Доклиническая конфокальная лазерно-сканирующая эндомикроскопия (pCLE) капилляров гиппокампа у бодрствующих мышей in vivo

Резюме

В то время как многофотонная визуализация эффективна только на ограниченных глубинах от поверхности ткани, с помощью pCLE можно получить изображение с разрешением 3 мкм на любой глубине. В данной работе мы представляем протокол проведения pCLE-визуализации для измерения микрососудистой динамики в гиппокампе иктальных и диких мышей.

Аннотация

Целью этого протокола является описание доклинической конфокальной лазерной сканирующей эндомикроскопии (pCLE) с оптоволоконным пучком в ее специфическом применении для выяснения эффектов капиллярного кровотока во время судорог, вызванных клетками стенки. Визуализация коры головного мозга in vitro и in vivo показала, что сужение капилляров, вызванное перицитами, может быть результатом функциональной локальной нейронной активности, а также применения лекарств у здоровых животных. Здесь представлен протокол о том, как использовать pCLE для определения роли микроваскулярной динамики в дегенерации нервов при эпилепсии на любой тканевой глубине (в частности, в гиппокампе). Мы описываем технику удержания головы, которая была адаптирована для регистрации pCLE у бодрствующих животных, чтобы устранить потенциальные побочные эффекты анестетиков на нейронную активность. Используя эти методы, электрофизиологические и визуализирующие записи могут проводиться в течение нескольких часов в глубоких нейронных структурах головного мозга.

Введение

В отличие от других методов микроскопической визуализации 1,2,3,4,5,6,7,8, волоконно-оптическая конфокальная микроскопия in vivo позволяет измерять динамику кровотока в любом участке мозга, на любой глубине^, с высокой скоростью (до 240 Гц в зависимости от размера поля зрения⁹). Волоконно-оптический зонд позволяет получать изображения с конфокальным лазерным сканированием in vivo с разрешением 3 мкм, поскольку кончик зонда (объектив без линзы, состоящий из пучка отдельных волокон диаметром 5000-6000 диаметром 3 мкм) может быть позиционирован с точностью микроэлектрода в пределах 15 мкм от интересующей флуоресцентной мишени. Как и при двухфотонной визуализации in vivo, флуорофоры должны быть предварительно введены в объект визуализации. Например, флуоресцеин декстран (или квантовые точки) могут быть введены в сосудистую сеть, или генетически кодируемые флуоресцентные белки могут быть трансфицированы в клетки, или флуоресцентные красители, такие как Oregon Green BAPTA-1, могут быть загружены в клетки перед визуализацией.

Недавние исследования с использованием этих методов показали, что моторная активность клеток стенки, приводящая к спазмам иктальных капилляров — внезапным сужениям, возникающим в положении клеток стенки во время судорог 9, — может способствовать нейродегенерации в иктальном гиппокампе⁹. В то время как предыдущие исследования визуализации показали сужение перицитов in vitro и in vivo, связанное с применением лекарств 6,7,10,11,12^, Leal-Campanario et al. обнаружили первые доказательства спонтанных сужений капилляров in vivo в мозге мышей. Чтобы установить связь с височной эпилепсией человека, они изучили самцов (P30-40) нокаутированных (KO) Kv1.1 (kcna1-null) мышей ^14,15 (JAX stock #003532), генетическую модель эпизодической атаксии человека типа 1¹⁵. Перициты вызывали как патологические, так и физиологические вазоконстрикции гиппокампа⁹ у животных со спонтанной эпилепсией и их однопометников дикого типа (WT). Эти наблюдения были воспроизведены на животных WT, ставших эпилептиками с помощью каиновой кислоты, тем самым указывая на их генерализацию на другие формы эпилепсии. Кроме того, Leal-Campanario et al. определили, используя новые подходы стереологической микроскопии, что апоптотические, но не здоровые нейроны у животных, страдающих эпилепсией, пространственно связаны с микроциркуляторным руслом гиппокампа. Поскольку эксайтотоксичность не имеет известной пространственной связи с сосудистой системой, этот результат указывает на то, что аномальная капиллярная вазоспазмическая ишемия, индуцированная гипоксией, способствует нейродегенерации при эпилепсии. На рисунке 1 показана схема общей установки.

протокол

Протокол соответствует Рекомендациям NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию. Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию при Неврологическом институте Барроу.

1. Стереотаксическое позиционирование при трепанации черепа

1. Взвесьте, а затем обезболивайте мышь коктейлем из кетамина-ксилазина (100 мг/кг–10 мг/кг в/). Убедитесь, что животное находится под полным наркозом, наблюдая за отсутствием у него реакции на защемление хвоста и/или пальца ноги.
2. Поместите грелку под мышь и используйте ректальный термометр для непрерывного контроля температуры ее тела во время первоначальной операции по имплантации под наркозом (Рисунок 2A).
3. Применяйте офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить сухость глаз.
4. Стабилизируйте голову животного в стереотаксической рамке грызуна, оснащенной адаптером для мыши. Чтобы правильно сориентировать мышь в стереотаксической рамке, поместите зубы животного внутрь отверстия прикусной планки (рис. 2А и рис. 3А , . ж). Затяните носовой зажим до плотного прилегания (Рисунок 2A, B и Рисунок 3A, поз. h). Положение тела мыши должно быть как можно более прямым (как на рисунке 2A).
   1. Дополнительно закрепите голову животного с помощью ушных планок мыши с манжетами держателя челюсти (рис. 2А и рис. 3А,. i), чтобы надежно зажать скуловые отростки черепа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После закрепления головка мыши не должна иметь диапазона горизонтального движения.
5. После того, как мышь будет настроена на стереотаксическую рамку (рис. 3B, поз. j), очистите и простерилизуйте кожу головы, протерев ее хлор-гексединным скрабом 2-3 раза, каждый раз с последующим ополаскиванием спиртом. Затем нанесите местный лидокаин на макушку головы.
6. Сделайте разрез по средней линии от задней до передней (начните разрез у основания черепа и завершите его между глазами; 12-15 мм) вдоль сагиттальной средней линии черепа, используя либо тонкие ножницы, либо лезвие. Втяните границы кожи головы с помощью четырех 28-миллиметровых зажимов bulldog serrefine, чтобы обнажить череп и максимально увеличить рабочую зону (рис. 2B и рис. 3C).
7. С помощью скальпеля или микрошпателя (рис. 3C) соскребите надкостницу к краям разреза. Используйте ножницы или щипцы для разделения тканей (Рисунок 3C), чтобы осторожно втянуть мышцы задней части шеи (Рисунок 2B).
8. Высушите верхнюю часть черепа аппликатором с ватным наконечником, смоченным спиртом или 30% перекисью водорода, чтобы оптимизировать визуализацию черепных швов. Нанесите физиологический раствор на череп после удаления соединительной ткани.
9. После того, как голова мыши стабилизируется в стереотаксическом аппарате, поместите кончик иглы шприца (21 G) в электрододержатель (рис. 3B, поз. l) и прикрепите электрододержатель к стереотаксическому микроманипулятору, опустив кончик иглы до уровня черепа (рис. 2D).
10. Отрегулируйте медиально-латеральное направление черепа, измерив высоту черепа на любом расстоянии позади брегмы (т.е. -2,0 мм) и на двух равных расстояниях латеральнее средней линии с обеих сторон черепа (т.е. ± 1,5 мм) (рис. 2D). Стремитесь к разнице высот в разных местах менее 0,05 мм в дорсально-вентральном направлении.
    1. Если он превышает 0,05 мм, поверните череп мыши с помощью прикусной планки или измените положение головы мыши, осторожно ослабив амбушюры, при необходимости сместив голову и амбушюры в стороны, а затем снова затянув амбушюры.
11. После того, как череп будет помещен в стереотаксическое устройство, определите и запишите стереотаксические координаты брегма и лямбда-швы черепа вдоль переднезадней (AP), медиальной латеральной (ML) и дорсальной вентральной (DV) осей.
12. Определите целевую точку (правый гиппокамп) с помощью стереотаксического атласа. Затем найдите на черепе координаты целевой точки относительно брегмы (AP: -2,7 мм, ML: -2,7 мм) (рис. 2E).
13. С помощью хирургического маркера отметьте четыре угла окна визуализации размером 1,4 мм x 2 мм на черепе точками, центрированными вокруг целевой точки прямо над гиппокампом (рис. 2F), для последующей трепанации черепа.
14. С помощью хирургического маркера нарисуйте две дополнительные точки: одну над верхней левой теменной костью (Рисунок 2G), а другую над правой лобной костью (Рисунок 2H), чтобы обозначить будущее размещение двух костных винтов (Рисунок 3A, пункт b), которые будут крепить головной колпачок (Рисунок 3B, пункт m) к черепу.
15. С помощью хирургического маркера нарисуйте еще три точки, указывающие, куда будут вставлены эпидуральные регистрирующие электроды ЭЭГ: одна точка расположена на расстоянии 1 мм по обе стороны от средней линии, и одна дополнительная точка на средней линии, расположенная на расстоянии 1 мм позади лямбды (Рисунок 2E, Рисунок 4A и Рисунок 5B).

2. Установка налобного колпачка

1. С помощью жернова диаметром 0,7 мм (рис. 3C) осторожно просверлите два небольших отверстия в черепе в точках, указывающих на расположение костных винтов (см. шаг 1.15 выше). Затем возьмите два костных винта (с прорезями из нержавеющей стали, длина: 4 мм; диаметр: 0,85 мм), предварительно продезинфицированные этанолом 70-80%, и прикрутите их к черепу для дополнительной устойчивости головного колпачка (рис. 2I-J и рис. 3A, пункт b).
   1. Следите за тем, чтобы наконечники винтов не выступали за пределы нижней части кости в полость черепа, рискуя повредить мозг. Обратите внимание, что один из двух костных винтов будет находиться спереди от двух винтов с головкой, а другой — сзади от них (Рисунок 2G-J).
2. Сбрызните солевой раствор на череп, чтобы охладить его и очистить. Затем полностью высушите череп и нанесите тонкий слой цианоакрилата вокруг винтов.
3. Используйте специальную выравнивающую деталь (Рисунок 3A, поз. c), прикрепленную к микроприводу, установленному на стереотаксическом устройстве (Рисунок 2F-J и Рисунок 3A, поз. d), таким образом, чтобы положение головной крышки было выровнено по средней линии, а передний гребень перекрывал брегму. Это изготовленное на заказ изделие из нержавеющей стали имеет L-образную форму (под углом 90°) с двумя отверстиями, разделенными 4 мм (Рисунок 2F-J и Рисунок 3A, пункт c).
   1. Используйте стереотаксический манипулятор для позиционирования L-образной выравнивающей детали с прикрепленными двумя ведущими винтами с шлицевой головкой филлистера (M1,6 x 0,35 метрического грубого, длина 12 мм; Рисунок 3А, пункт а) над брегмой до тех пор, пока основание винтов не ляжет плашмя на череп, стараясь не оказывать давления на череп (Рисунок 2I-J).
4. Нанесите цианоакрилат с последующим стоматологическим цементом, чтобы прикрепить основание винтов к черепу. Будьте осторожны, чтобы не загораживать контрольные метки окна визуализации над гиппокампом (рис. 2K).

3. Операция трепанации черепа с визуализирующим окном

1. В каждом из положений контрольных меток для краниотомии, которые обозначают углы окна визуализации (см. шаг 1.14 выше), просверлите отверстие для заусенцев диаметром 0,7 мм, а затем аккуратно очертите с помощью сверла периферию окна краниотомии размером 1,4 мм x 2 мм с итеративно более глубокими надрезами (рис. 2L).
2. Следите за тем, чтобы не просверлить слишком глубоко или со слишком большой силой череп, который является тонким и хрупким, имеющим толщину около 300 мкм. После того, как костный лоскут будет готов, подденьте свободный лоскут кончиком скальпеля, стараясь не повредить подлежащую твердую мозговую оболочку.
3. Покройте открытое окно костным воском (рисунок 2М).
4. Используя жернова диаметром 0,9 мм, просверлите три отверстия для будущего размещения эпидуральных электродов ЭЭГ (см. шаг 1.15 выше), стараясь не разрезать твердую мозговую оболочку (рис. 2, E, L).
5. Закройте три отверстия костным воском.
6. Осторожно нанесите цианоакрилат по краям окна визуализации, покрытого костным воском, и отверстий ЭЭГ, стараясь не запечатывать краниотомию (Рисунок 2L).
7. Постройте стену из стоматологического цемента, которая охватывает окно визуализации и отверстия для ЭЭГ и связывает ее с предварительно зацементированной головкой (Рисунок 2M и Рисунок 3B, пункт m).
8. Дайте цементу высохнуть не менее 10 минут.
9. Закройте все свободные края раны простыми прерывистыми швами, используя черный плетеный шелк 4-0 или 5-0 (Рисунок 2N и Рисунок 3C).

4. Послеоперационный период

1. Используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы нанести лидокаиновую мазь на открытые участки кожи, чтобы притупить чувствительность по краю раны.
2. Используйте стерильный аппликатор с ватным наконечником, чтобы нанести Неоспорин на открытые участки кожи.
3. Извлеките животное из стереотаксической рамки (рис. 2N).
4. Вводят кетопрофен (5 мг/кг) ВМ или в/м для послеоперационного обезболивания.
5. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не станет бдительным и не начнет двигаться (обычно это происходит в течение нескольких минут).
6. Поместите животное в теплую клетку и продолжайте следить за его выздоровлением до тех пор, пока оно не напьется или не поест и не будет готово к переводу в помещение для животных.
7. Осматривайте животное не реже одного раза в день в течение примерно одной недели после операции, наблюдая за любыми признаками вялого поведения и/или недостаточного питания/питья (рис. 2O).

5. Ввод красителя и запись ЭЭГ

1. Подождите не менее одного дня после операции по имплантации головного колпачка, чтобы начать запись.
2. Поместите мышь в пенопластовое удерживающее устройство, прикрепленное к ее корпусу, в стереотаксической рамке (рис. 3B, поз. n и j).
3. Прикрепите колпачок (Рисунок 3 B-I, поз. m) к специальной монтажной планке, которая прикреплена к стереотаксической раме (Рисунок 3A, B, пункты e и j и Рисунок 4A). Длинная часть изделия e (рис. 3 A, B) должна иметь длину от 9,4 до 13 мм. Закрепите деталь f (монтажную пластину размером 1,5 см x 0,5 см с двумя отверстиями, разделенными на 4 мм от центра к центру) к элементу e (рисунок 3A, B, элементы e, f и k). Эта система выравнивания надежно расположит пробужденную мышь относительно стереотаксической рамки на протяжении всех сеансов визуализации (рис. 4).
4. Вставьте эпидуральные регистрирующие электроды для ЭЭГ (Рисунок 5A), поместив заземляющие электроды (белые провода) в заднее центральное отверстие, а регистрирующие электроды (красные провода) в передние левое и правое отверстия (Рисунок 2E, Рисунок 4E и Рисунок 5E). Расположите каждый из проводов в L-образной форме между черепом и твердой мозговой оболочкой (рис. 5C) для оптимизации электрического контакта.
5. Введите в хвостовую вену зеленый флуоресцеин-лизин-фиксируемый декстран (0,2 мл/25 г тела с флуоресцеином 5% по массе), чтобы визуализировать кровоток в гиппокампе.
   1. Чтобы усилить расширение центральной вены хвоста мыши перед инъекцией, используйте одну или несколько из следующих стратегий: а) Нанесите 70% этанола на центральную вену с помощью аппликатора с ватным наконечником; б) Опустите хвост в теплую воду (35-40 °C) на 1-3 минуты; в) Подставьте хвост нагревательной лампе на несколько минут.
   2. Закрепите хвост мыши двумя пальцами и найдите центральную вену, которая лежит непосредственно под кожей. Введите иглу (ультратонкий инсулиновый шприц со встроенной иглой 30G) скосом вверх в вену, примерно на полпути к двум третям от основания хвоста. Во время инъекции держите иглу параллельно хвосту.
   3. Вводите краситель медленно и равномерно, стараясь избежать каких-либо изменений в положении иглы или хвоста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на поршень шприца не должно быть никакого сопротивления.
   4. После завершения инъекции извлеките иглу и слегка надавите на место прокола, чтобы запечатать сосуд.
   5. Дайте произойти свертыванию.

6. Доклиническая конфокальная лазерно-сканирующая эндомикроскопия in vivo

1. Непосредственно после инъекции в хвостовую вену (шаг 5.5.3 выше) зажмите скошенный оптоволоконный пучок размером 300 мкм (содержащий 5000–7000 волокон по 3 мкм в каждом пучке) в направлении вниз к подвижному рычагу роботизированного стереотаксического привода.
2. Удалите костный воск из трепанации черепа.
3. Удалите твердую мозговую оболочку, используя загнутый кончик иглы шприца.
4. Используя роботизированную систему позиционирования, сначала переместите волоконный объектив в соответствующее передне-заднее и лево-правое стереотаксическое место, при этом кончик будет обнулен по оси Z на поверхности коры головного мозга.
5. Инициируйте запись ЭЭГ (рис. 5D).
6. Начните конфокальное лазерное сканирование задней панели волоконного объектива, а затем медленно опускайте объектив по оси Z с помощью z-элементов управления роботизированного микропривода, пока он не достигнет целевой глубины в мозге (рис. 4C). Просматривайте результаты визуализации в микроскопическом программном обеспечении во время спуска.
   1. Если наконечник волокна находится в целевой области записи X-Y-Z, а два или более сосудов входят в поле зрения окна визуализации, остановите спуск и начните запись видео. Получайте в режиме реального времени покадровые видеоролики кровотока с частотой 11,7 Гц с помощью программного обеспечения для визуализации Cellvizio Lab. (Более высокие скорости могут быть достигнуты при меньшем поле зрения). Запись может длиться 4-5 часов, при необходимости в течение нескольких дней подряд.
7. С помощью шприца объемом 10 мл со скошенной силиконовой трубкой, закрепленной на кончике иглы, кормите животное во время записей, периодически подавая пасту, приготовленную из гранул мышей, измельченных водой.
8. По окончании сеанса визуализации прекратите запись.
9. Аккуратно извлеките электроды ЭЭГ и очистите их с помощью Tergazyme.
10. Медленно извлеките волоконно-оптический пучок из мозга животного, перевернув волокно вдоль оси z входа.
11. Освободите животное от подголовника и ограничителей тела.
12. При необходимости следуйте необходимым протоколам эвтаназии и обработки тканей для визуализации кровеносных сосудов и проведения иммуногистохимии.
13. Если вы планируете вести съемку от одного и того же животного в будущем сеансе, закройте окно визуализации костным воском или силастиком.

Результаты

Мы разработали эти методы, чтобы оценить, могут ли аномальные капиллярные вазоспазмы в гиппокампе, вызванные перицитами, возникающие в результате судорог, вызывать выраженную гипоксию, которая способствует гибели клеток в иктальном очаге ^9,13.

Обсуждение

Мы разработали систему фиксации головы для одновременного проведения электрофизиологических и волоконно-оптических экспериментов pCLE на бодрствующих мышах, снижая потенциальную ответную контаминацию из-за анестезирующих препаратов. Головной колпачок и монтажное устройство просты ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121