Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Resumen

Prueba preclínica de terapias contra el cáncer se basa en modelos de xenoinjerto pertinentes que imitan las tendencias innatas del cáncer. Ventajas de los modelos estándar del flanco subcutánea incluyen facilidad procesal y la capacidad de respuesta sin la proyección de imagen invasiva y monitor la progresión del tumor. Tales modelos son a menudo inconsistentes en ensayos clínicos traslacionales y han limitado características biológicamente relevantes con baja tendencia a producir metástasis, ya que hay una falta de un microambiente nativo. En comparación, han demostrado modelos de xenoinjerto ortotópico en los sitios de tumor nativo imitar el microambiente del tumor y replicar las características de la enfermedad importante como diseminación metastásica distante. Estos modelos requieren a menudo tediosos procedimientos quirúrgicos con periodos prolongados de tiempo y recuperación anestésicas. Para hacer frente a esto, los investigadores del cáncer han utilizado recientemente técnicas de inyección guiada por ultrasonido para establecer modelos de xenoinjerto de cáncer para los experimentos preclínicos, que permite la creación rápida y confiable de modelos murinos dirigida de tejido. Visualización ecográfica también proporciona un método no invasivo para la evaluación longitudinal del engraftment del tumor y crecimiento. Aquí, describimos el método de inyección guiada por ultrasonido de las células de cáncer, utilizando la glándula suprarrenal para NB y cápsula renal sub es. Este acercamiento como mínimo invasor supera implantación tedioso cirugía abierta de las células cancerosas en ubicaciones específicas de tejido para el crecimiento y metástasis y disminuye en períodos de recuperación mórbida. Se describe la utilización de las líneas celulares establecidas y líneas celulares derivadas paciente de orthotopic inyectable. Kits comerciales prefabricados están disponibles para disociación de tumor y luciferasa el marcaje de las células. Inyección de la suspensión celular utilizando la dirección de la imagen proporciona una plataforma mínimamente invasiva y reproducible para la creación de modelos preclínicos. Este método se utiliza para crear modelos preclínicos confiables para otros cánceres tales como vejiga, hígado y ejemplificando su potencial sin explotar para numerosos modelos de cáncer de páncreas.

Introducción

Modelos de xenoinjerto animales son herramientas esenciales para los estudios preclínicos de nuevas terapias contra el cáncer. Xenoinjertos murinos estándar se basan en la implantación subcutánea del flanco de las células, proporcionando un sitio eficaz y accesible para monitorear el crecimiento del tumor. La desventaja de los modelos subcutáneas es su falta de características biológicas tumorales, que pueden limitar su potencial para metastatizar¹. Tales limitaciones se superan mediante el uso de xenoinjertos de orthotopic en cual tumor las células se engrafted en sitios de tejido propio, proporciona un microambiente relevante potencial metastático². Modelos de xenoinjerto de orthotopic mantienen características biológicas originales y modelos fiables para preclínica drogas discovery^3,4. Las células de cáncer utilizadas para la implantación de tejido dirigida son las líneas celulares establecidas o derivados del paciente las células de tumores de pacientes. Xenoinjertos establecidos a partir de líneas celulares de cáncer pueden presentar alta divergencia genética del tumor primario en comparación con pacientes xenoinjertos derivadas⁵. Ante esto, el establecimiento de xenoinjertos ortotópicos derivados del paciente se ha convertido en el estándar preferido para las pruebas de nuevas terapias en descubrimiento de fármacos de cáncer.

En el neuroblastoma (NB) de cáncer pediátrico, modelos de xenoinjerto de orthotopic recapitulan la biología del tumor primario y desarrollan metástasis a sitios típicos de NB extendido^6,7. NB se desarrolla en la glándula suprarrenal o a lo largo de la cadena simpática paravertebral. Los métodos más comunes de implantación ortotópica requieren procedimientos quirúrgicos trans abdominal abiertos. Tales métodos son a menudo tediosos, tienen alta morbilidad animal y períodos de recuperación complejos. Ecografía de alta resolución se ha utilizado recientemente para implantación dirigida de tejido de las células del tumor en el desarrollo de varios modelos murinos de cáncer investigación^8,9. La técnica es fiable, reproducible, eficaz y seguro para el establecimiento del tumor metastático pertinentes xenoinjertos^10,11.

El establecimiento de xenoinjertos de cáncer pediátrico por la implantación de aguja y localización de órgano blanco guiada por ultrasonido de líneas celulares y células tumorales derivados del paciente es demostrada¹¹. La técnica fue utilizada por nota dirigida a la glándula suprarrenal murina. Sarcoma de Ewing (ES) es predominantemente un cáncer óseo, visto comúnmente en los huesos largos como el fémur y los huesos pélvicos¹². Informes de casos han demostrado que para determinar si el crecimiento de un cáncer óseo predominante es factible en el tejido renal, fue elegida una localización capsular sub renal ortotópico implantación¹³. Implantación de renal sub capsular de la célula de las células tumorales se ha utilizado como un modelo prometedor para el estudio de las metástasis espontáneas ES¹⁴.

Protocolo

Todo el trabajo se hizo acuerdo con la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan (HUM 00052430) y se ajusta a los procedimientos aprobados por el Comité de la Universidad sobre el uso y cuidado de animales (UCUCA). La unidad de laboratorio del Animal medicina (ULAM) supervisó el cuidado de los animales.

Todo el trabajo se realizó con la aprobación de la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan (HUM 00052430) y cumple con todas las normas de Comité de investigación humana ética. Las células humanas se consideran ser un material de riesgo biológico, así que siga todas las precauciones y prácticas de bioseguridad apropiados requeridos por la institución. NSG ratones son seriamente immunocompromised y susceptible a la enfermedad causada por bacterias que se encuentran comúnmente en el ambiente.
Utilice siempre una técnica aséptica estricta durante la preparación de materiales para la implantación y realización de las inyecciones.

1. cultivo celular

1. Crecimiento humano NB célula líneas establecidas (SH-SY5Y, SK-N-BE2 y IMR32) en medio esencial mínimo, suplementado con suero bovino fetal 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades/mL de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina. Suplemento IMR32 células más con 1 mM piruvato y 0.075% de NaHCO₃. Mantener todas las células a 37 ° C, 5% CO₂ y confluencia de 70-80%_.
2. Crecimiento humano ES la célula líneas (TC32, A673, CLA-25 y A4573) en Medio RPMI suplementado con suero bovino fetal 10% y 6 mM L-glutamina. Mantener todas las células a 37 ° C, 5% CO₂ en confluencia de 70-80%_.
3. Enviar todas las líneas celulares para la autenticación.
   Nota: Autenticación de celular se realiza en una instalación exterior, consulte agradecimientos.

2. preparación de las células del Tumor primario derivados del paciente

1. Con paciente consentimiento y asentimiento, cosecha descarta tejido de tumor humano NB de pacientes sometidos a resección quirúrgica para control local y el transporte al laboratorio en solución de almacenamiento de información de tejido para la preservación.
   Nota: Todas las muestras de paciente-identificadas y manejadas conforme a las directrices de la Junta de revisión institucional.
2. Generar una suspensión de células de cáncer derivados de paciente único (UMNBL001, UMNBL002) de tejido del tumor usando un kit de disociación del tumor. Transferir aproximadamente 0,5 g de tumor a una placa de cultivo de células de 100 mm que contiene 5 mL de tampón de RPMI, 200 μL de enzima H, 100 μl de enzima R y 25 μl de enzima A del kit de disociación del tumor humano.
3. Pique el tumor en trozos pequeños (2-4 mm cada uno) usando tijeras y pinzas de tejido. Estos fragmentos se mezclan con las soluciones en el paso 2.2.
4. Pipetear la mezcla del tumor en un tubo de disociador y cierre el tubo. Invertir el tubo y colocar en la manga de la Disociador de tejido. Ejecute el programa h_tumor_01.
5. Incubar la suspensión de células de tumor obtenida anteriormente a 37 ° C por 1 h en un rack giratorio con trituración intermitente cada 15 minutos.
6. Transferir la suspensión de células a un nuevo tubo cónico de 50 mL y añadir 10 mL de RPMI. Centrifugue la suspensión de células a 314 x g durante 5 minutos.
7. Quite el sobrenadante y suspender el sedimento en 5 mL de RPMI. Pasar esta solución a través de un tamiz de 40 μm celular y recoger la solución filtrada en un tubo cónico de 50 mL fresco. Lavar este filtro una vez con 5 mL de Medio RPMI y centrifugar la mezcla a 314 x g durante 5 minutos recoger un diábolo.
8. Medir la densidad celular con un hemacitómetro¹⁵. Suspender el sedimento obtenido desde arriba en RPMI para obtener una concentración final de 4 × 10⁵ células/10 μl. Tomar 5 μl de esta suspensión celular y 5 μl de matrigel hacer 10 μl de la solución celular para cada inyección.
   Nota: Cantidad de RPMI utilizado depende de la medida de la densidad celular. Por ejemplo, si la densidad de la célula medida del precipitado obtenido es 4 x 10⁵ células, suspender el sedimento en 10 μl de RPMI.

3. luciferase el marcaje de las células cancerosas

1. Tomar 10 mL de medio de transducción con 5 mL de viral sobrenadante EF1a-Luc2-IRES-mCherry y 5 mL de medio de células madre. Añadir 7,5 μl de polibreno 1 x.
2. Mezclar 5 × 10⁶ células de cáncer en medio de la transducción y la placa en la placa de fijación ultra baja de 100 mm. Incubar a 37 ° C y 5% CO₂ durante la noche.
   Nota: Como se utilizan las placas de fijación baja, las células no se adhieren a la placa.
3. Después de 24 h, traer la placa de 100 mm que contiene células bajo campana de cultivo de tejidos y transferir la mezcla a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugue la suspensión de células a 314 x g durante 5 min obtener el precipitado de células. Lavar el precipitado de células una vez con 1 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y suspender el precipitado de células en 1 mL de HBSS conteniendo 1% de suero bovino fetal (FBS).
   1. Ordenar celdas de luciferasa basados en señal GFP-positivas en celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS). Placa las células ordenadas en cultivo de tejidos de 100 mm tratada plato y mantienen en confluencia de 70-80%, 37 ° C y 5% CO₂ hasta que la necesite.
4. Confirmar la señal de la luciferasa con kit de ensayo de luciferasa. Placa 10 x 10⁴ clasificado células por pocillo en una illuminometer compatible 96 bien placa e incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO₂. Después de 24 h, poner la placa de la pozo 96 a temperatura ambiente y añadir Reactivo estable-Glo a los medios cultivados en los pozos en relación 1:1. Permitir que las células lyse durante 5 minutos y leer en espectrofotómetro de la luminescencia.
5. Traer el plato de 100 mm bajo una campana de cultivo de tejidos. Desechar el medio sobrenadante. Lavar las células una vez con 2 mL de PBS 1 x.
6. Añadir 2 mL de tripsina 0.25% y vuelva el plato de 100 mm a la incubadora durante 2-3 minutos. Después de 2-3 min, busque células desalojadas bajo microscopio y añadir 8 mL de RPMI para desactivar la tripsina.
7. Recoger la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 314 x g durante 5 min obtener un pellet. Deseche el sobrenadante. Lavar el precipitado de células con 1 mL de PBS 1 x, suspender el sedimento en 5 mL de RPMI y determinar la densidad celular con un hemacitómetro¹⁵. Yhe restante solución celular 314 x g durante 5 min obtener un pellet de centrífuga.
8. Suspender el sedimento en RPMI para obtener una concentración de 4 x 10⁵ células/10 μl. Tomar 5 μl de la suspensión celular y 5 μl de matrigel hacer 10 μl de la solución celular para cada inyección.

4. ultrasonido dirigida a la glándula suprarrenal (NB) o implantación de Sub Renal cápsula (ES)

Nota: Todos los procedimientos de ultrasonido se realizan con una alta resolución en vivo sistema de imagen. Para los procedimientos descritos, se utilizó el transductor, que tiene una frecuencia de centro de 40 MHz y un ancho de banda de 22-55 MHz.

1. Utilizar ratones NSG inmune deficiencia de 6-8 semanas de edad para todos los procedimientos de inyección.
2. Enfriar el matrigel y esterilizadas jeringas Hamilton con una aguja de 27G (1.25"), y catéteres de 22G (0,9 mm de diámetro externo, longitud de 25 mm) durante la noche a 4 ° C.
3. Coloque la solución celular preparada en el paso 3 en el hielo.
4. Anestesiar los ratones en una cámara de inducción con isoflurano 2% del O₂ a 2 L/min.
   Nota: La anestesia adecuada se determina con la falta de movimiento activo y el mantenimiento de la respiración espontánea.
5. Una vez anestesiados, depilarse la espalda y el flanco de los animales con loción de retiro del pelo (como Pamela) y una máquina de afeitar.
6. Traslado del animal a la plataforma de proyección de imagen con el lado abdominal, donde la nariz del animal se coloca en una ojiva y asegurada al inhalar isoflurano.
7. Colocar ungüento óptico en ojos del animal para prevenir la resequedad. El ratón en el lugar para evitar cualquier movimiento involuntario de la cinta.
8. Identificar hígado murino, la vena cava, bazo, riñón izquierdo y la glándula suprarrenal izquierda adyacente mediante visualización ecográfica.
9. Utilizar guantes estériles, mascarilla y gorro para protección personal y mantenimiento de condiciones estériles. Bajo dirección del ultrasonido, suavemente inserte un catéter 22G a través de la piel y músculo de nuevo directamente en la glándula suprarrenal izquierda para proporcionar un canal para la inyección celular. Retire la aguja y deja el catéter en su lugar.
10. Carga una jeringa Hamilton refrigerada equipado con una aguja de pequeño calibre con 10 μl de solución de la célula, entonces guía la jeringa stereotactically a través del catéter colocado en el centro de la glándula suprarrenal.
11. Inyectar las células específicas del tejido suprarrenal. Deje la aguja en su lugar por 1-2 min permitir el matrigel establecer. Lentamente retire la aguja, seguida de la remoción del catéter.
12. Coloque el ratón en su jaula y asegúrese de que el ratón recupera la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
    Nota: debido al carácter mínimamente invasivo de esta técnica, dolor post procedimiento es mínima, pero siendo monitoreados sobre una base diaria con controles de salud de ratones. "debe seguirse con una frase:"si inesperados signos de dolor o angustia se identifican durante el curso de un experimento, consultar con la unidad de apoyo veterinario institucional para obtener información sobre la analgesia u otro tipo de atención médica.
    

Resultados

Utilizando los procedimientos presentados, implantación guiada por ultrasonido de las células NB en la glándula suprarrenal se realizó en una sala de procedimientos dedicado equipada con una mesa quirúrgica climatizada. Cojines de brazo y pie fueron colocados para supervisar la actividad de corazón murino (figura 1A). El animal seguía siendo anestesiado con isoflurano con inhalación de cono de nariz. Utilizando una sonda de ecografía de alta resoluci...

Discusión

Implantación guiada por ultrasonido de las células NB y ES es un método seguro y eficaz para establecer xenoinjertos murinos confiables para los estudios preclínicos en Biología del cáncer. Fundamental para el éxito de la guiada por ultrasonido implantación dirigida de tejido es la presencia y la disponibilidad de personal capacitado con experiencia en la localización anatómica del órgano de interés y en inyección estereotáctica de las células tumorales.

La disociación del teji...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G