Использование УЗИ руководствоваться ткани направленных сотовой имплантации для создания ксенотрасплантатов биологически соответствующих метастатические опухоли

Резюме

Здесь мы представляем протокол использовать УЗИ руководствуясь инъекций нейробластома (NB) и саркомой Капоши (ES) клетки (создана линии клеток и клеток опухоли пациента производные) на биологически соответствующие сайты для создания надежных доклинических моделей для рака исследования.

Аннотация

Преклинические испытания противоопухолевой терапии опирается на соответствующих ксенотрансплантата моделей, которые имитируют врожденной тенденции рака. Преимущества стандартного подкожной фланге моделей включают процедурные легкость и способность монитора опухолевой прогрессии и ответ без инвазивных изображений. Такие модели часто непоследовательны в трансляционной клинических испытаний и имеют ограниченную биологически соответствующие характеристики с низкой склонности производить метастазов, как отсутствие родной микроокружения. В сравнении ортотопическая ксенотрансплантата моделей на участках родной опухоли показали имитировать микроокружения опухоли и тиражирования важные болезни характеристики таких отдаленных метастатической распространения. Эти модели часто требуют утомительные хирургических процедур с обезболивающий длительное время и восстановления. Для решения этой проблемы рака исследователи использовали недавно УЗИ руководствуясь инъекций методы учредить рака ксенотрансплантата модели для доклинических экспериментов, которые обеспечивает быстрое и надежное создание ткани направленных мышиных моделях. Ультразвуковой визуализации также предоставляет неинвазивный метод для продольной оценки приживления опухоли и роста. Здесь мы описываем метод для УЗИ руководствуясь инъекций раковых клеток, используя надпочечников NB и капсула почек sub для ES. Это минимально инвазивной подход преодолевает имплантации утомительно открытой хирургии раковых клеток в ткани конкретного места для роста и метастазирования и стихает болезненного восстановления периоды. Мы описываем использования установленных клеточных линий и пациентом производных клеточных линий для инъекций ортотопическая. Готовые коммерческие наборы доступны для опухоли диссоциации и Люцифераза пометки клеток. Введения суспензии клеток, используя изображение руководство обеспечивает минимально инвазивных и воспроизводимые платформу для создания доклинических моделей. Этот метод используется для создания надежных доклинических моделей для других раковых заболеваний, таких как мочевого пузыря, печени и поджелудочной железы, иллюстрируя свой неиспользованный потенциал для многочисленных моделей рака.

Введение

Животных ксенотрансплантата модели являются необходимыми инструментами для доклинических исследований Роман противоопухолевой терапии. Стандартный мышиных ксенотрасплантатов полагаются на подкожную фланге имплантация клеток, предоставление эффективных и легко доступных сайт для мониторинга роста опухоли. Недостаток подкожной моделей является отсутствие опухоль – специфичные биологических характеристик, которые могут ограничить их способность метастазировать¹. Такие ограничения преодолеваются с помощью ортотопическая ксенотрасплантатов в котором опухоли клетки являются прижившимися в родной ткани сайтов, предоставляя соответствующие микроокружения метастатического потенциала². Ортотопическая гранулы ксенотрансплантата модели сохранить оригинальный биологические особенности и обеспечивают надежные модели для доклинических наркотиков discovery^3,4. Раковые клетки используются для ткани направленных имплантации являются установленными клеточных линий или пациент производные клетки из опухоли пациента. Ксенотрасплантатов от линий клеток рака могут демонстрировать высокие генетических отклонений от первичной опухоли, по сравнению с пациентом производных ксенотрасплантатов⁵. Учитывая это, создание ксенотрасплантатов пациента производные ортотопическая стал предпочтительным стандартом для тестирования Роман терапии рака лекарственных препаратов.

В педиатрического рака нейробластома (NB) ортотопическая ксенотрансплантата модели пилки первичной опухоли биологии и развивать метастазирования типичные сайты NB распространение^6,7. NB развивается в надпочечников или вдоль паравертебральных симпатической цепочки. Наиболее распространенные методы имплантации ортотопическая требуют открытой транс брюшной хирургических процедур. Такие методы часто утомительным, имеют высокую заболеваемость животных и сложные восстановления периоды. Высоким разрешением УЗИ недавно использовались для ткани направленных имплантации опухолевых клеток в развитии нескольких мышиных моделей для исследования рака^8,9. Методика является надежным, воспроизводимость, эффективной и безопасной для создания соответствующих метастатические опухоли ксенотрасплантатов^10,11.

Показали¹¹является создание педиатрического рака ксенотрасплантатов по УЗИ руководствуясь целевой орган локализации и иглы имплантации пациент производные опухолевых клеток и клеточных линий. Техника была использована для NB, ориентированные на мышиных надпочечников. Саркома Юинга (ES) является преимущественно костной рак, часто видели в длинные кости бедренной кости и костей таза¹². Доклады показали, что чтобы определить, является ли рост преимущественно костной рака возможно в почечной ткани, почечной суб капсульной место было выбрано для имплантации ортотопическая¹³. Имплантация капсульной клеток почек суб опухолевых клеток была использована как перспективной моделью для изучения спонтанной метастазов для ES¹⁴.

протокол

Все работы было сделано в соответствии с Мичиганского университета, институциональных Наблюдательный Совет (HUM 00052430) и соответствует процедурам, утвержденных Комитетом университета по использованию и заботе о животных (UCUCA). Единица для лабораторных животных медицины (УЛАМ) контролировала уход за животными.

Все работы было сделано с одобрения от Мичиганского университета, институциональных Наблюдательный Совет (HUM 00052430) и соответствует всем правилам комитета этики исследований человеческого. Клетки человека считаются быть потенциально зараженные материалы, так что следовать все специальные меры предосторожности и соответствующие биобезопасности практики, которые необходимы вашей организации. ГЯП мышей сильно ослабленным и восприимчивы к болезни, вызванные бактериями, которые обычно встречаются в окружающей среде.
Всегда используйте строгие стерилизации, при подготовке материалов для имплантации и выполнения инъекции.

1. клеточная культура

1. Расти установленных человека NB клеточных линий (SH-SY5Y SK-N-BE2 и IMR32), в минимально необходимых среде, дополнена плода бычьим сывороточным 10%, глютамин 2 мм, 100 единиц/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина. Дополнение IMR32 клетки далее с 1 мм пируват и 0,075% NaHCO₃. Сохранить все клетки при 37 ° C, 5% CO₂ , 70-80% слияния_.
2. Расти человеческого линии клетки ES (TC32, A673, ХЛ-25 и A4573) в среде RPMI, дополненная плода бычьим сывороточным 10% и 6 мм L-глютамина. Сохранить все клетки при 37 ° C, 5% CO₂ при впадении в 70-80%_.
3. Отправьте всех клеточных линий для аутентификации.
   Примечание: Клетки проверка подлинности выполняется на объекте за пределами, обратитесь к благодарности.

2. Подготовка клетки первичной опухоли пациента производные

1. С согласия пациента и согласие урожай отбрасываются человека NB опухолевой ткани от пациентов, перенесших хирургической резекции для местного управления и транспорта в лабораторию в ткани решение хранения для сохранения.
   Примечание: Все образцы пациента де выявляются и обрабатываются в соответствии с руководящими принципами институциональных Наблюдательный Совет.
2. Создавать один пациент производные рака суспензию клеток (UMNBL001, UMNBL002) из опухолевой ткани с помощью комплекта диссоциации опухоли. Передачи примерно 0,5 г опухоли в блюдо культуры клеток 100 мм, содержащие 5 мл RPMI буфера, промаркированные фермента H, 100 мкл фермента R и 25 мкл фермента A из комплекта диссоциации человека опухоли.
3. Фарш опухоли на мелкие кусочки (2-4 мм) с помощью ножниц и ткани щипцами. Смешайте эти фрагменты с решениями на шаге 2.2.
4. Пипетка смесь опухоли в диссоциатором трубу и закрыть трубку. Инвертировать трубу и прикрепить на рукав диссоциатором ткани. Запустите программу h_tumor_01.
5. Инкубируйте суспензию клеток опухоли, полученные выше при 37 ° C для 1 h на вращающейся стойке с прерывистой Тритурация каждые 15 мин.
6. Передать новые Конические трубки 50 мл суспензии клеток и добавляют 10 мл RPMI. Центрифуга суспензию клеток в 314 g x 5 мин.
7. Удалить супернатант и приостановить гранулы в 5 мл RPMI. Передать это решение через стрейнер клетки 40 мкм и собирать напряженными решение в свежий 50 мл Конические трубки. Вымойте этот фильтр один раз с 5 мл RPMI СМИ и центрифуги смеси на 314 g x 5 мин для сбора гранул.
8. Измерьте плотность клеток с помощью hemacytometer¹⁵. Приостановите гранулы, полученные из выше в RPMI для получения конечной концентрации 4 × 10⁵ клеток/10 мкл. Возьмите 5 мкл этой суспензии клеток и 5 мкл matrigel сделать 10 мкл раствора ячейки для каждой инъекции.
   Примечание: Количество используемых RPMI зависит от измерения плотности клеток. Например если плотность измеренной клеток полученные гранулы 4 x 10⁵ клеток, приостановить гранулы в 10 мкл RPMI.

3. Люцифераза пометки раковых клеток

1. Сделайте 10 мл трансдукции СМИ с вирусной супернатанта EF1a-Luc2-IRES-mCherry 5 мл и 5 мл стволовых клеток средств массовой информации. 7.5 мкл Полибрен 1 x.
2. Смешайте 5 × 10⁶ раковые клетки в средствах массовой информации трансдукция и пластины в 100 мм ультра-низким крепежную пластину. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ на ночь.
   Примечание: Как низкий крепежные пластины используются, клетки не будут придерживаться пластины.
3. После 24 часов принести пластину 100 мм, содержащие клетки под капотом культуры ткани и передача смеси в коническую пробирку 15 мл. Центрифуга суспензию клеток в 314 g x 5 минут получить клетки Пелле. Помыть лепешка клетки один раз с 1 мл раствора 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) и приостановить Пелле клеток в 1 мл HBSS, содержащей 1% плода бычьим сывороточным (ФБС).
   1. Сортировать клетки Люцифераза, основанный на GFP-позитивный сигнал на активированной флуоресценции клеток, сортировка (FACS) анализ. Пластина сортировки клеток на культуре ткани 100 мм лечение блюдо и поддерживать на 70-80% слияния, 37 ° C и 5% CO₂ до тех пор, пока требуется.
4. Подтвердите Люцифераза сигнал с Люцифераза пробирного kit. Пластина 10 x 10⁴ Сортировка ячеек на хорошо луксометр совместимый 96 хорошо пластины и инкубации клеток на ночь при 37 ° C и 5% CO₂. После 24 часов довести 96 хорошо пластины до комнатной температуры и добавить устойчивый-Glo реагент культивированный СМИ в скважинах в соотношении 1:1. Позволяют клеткам лизируют для 5 минут и прочитайте люминесценции в спектрофотометре.
5. Принесите блюдо 100 мм под капотом культуры ткани. Выбросите супернатанта СМИ. Вымойте клетки один раз с 2 мл ПБС.
6. Добавить 2 мл 0,25% трипсина и вернуться на 100 мм блюдо инкубатора для 2-3 мин. После 2-3 мин проверьте выбили клетки под микроскопом и добавить 8 мл RPMI для деактивации трипсина.
7. Соберите суспензию клеток в 15 мл Конические трубки и центрифуги на 314 g x 5 минут для получения гранул. Выбросите супернатант. Помыть лепешка клеток в 1 мл ПБС, приостановить гранулы в 5 мл RPMI и определить плотность клеток с помощью hemacytometer¹⁵. Центрифуга yhe оставшиеся ячейки решение на 314 x g 5 минут для получения гранул.
8. Приостановите гранулы в RPMI для получения концентрации 4 x 10⁵ клеток/10 мкл. Возьмите 5 мкл суспензии клеток и 5 мкл matrigel сделать 10 мкл раствора ячейки для каждой инъекции.

4. Ультразвуковая руководствуясь надпочечника (NB) или имплантации почечной Sub капсула (ES)

Примечание: Все ультразвуковые процедуры выполняются с использованием высокого разрешения в vivo imaging системы. Для описанных процедур был использован преобразователь, который имеет центр частотой 40 МГц и пропускной способностью 22-55 МГц.

1. Используйте 6-8-week-old мышей ГЯП иммунной недостаточным для выполнения всех процедур инъекций.
2. Chill matrigel и автоклавного Гамильтон шприцы с иглой 27G (1,25"), и 22G катетеры (внешний диаметр 0,9 мм, длиной 25 мм) на ночь при 4 ° C.
3. Место клетки раствор, приготовленный в шаге 3 на льду.
4. Анестезировать мышей в камеру всасывание с помощью 2% изофлюрановая O₂ на 2 Л/мин.
   Примечание: Адекватной анестезии определяется с отсутствием активного движения и поддержание спонтанного дыхания.
5. Как только под наркозом, депилировать обратно и грудинкой животных, с использованием лосьон для удаления волос (например Наир) и бритвы.
6. Передать животное изображений платформы с брюшной стороны вниз, где помещены в ураном и обеспеченных вдохом изофлюрановая нос животного.
7. Место оптических мази в глаза животного для предотвращения высыхания. Лента мыши в место, чтобы предотвратить любое случайное движение.
8. Идентифицировать мышиных печени, верхней полой вены, селезенке, Левая почка и прилегающих левого надпочечника, используя ультразвуковой визуализации.
9. Используйте стерильные перчатки, маска, шапочка для личной защиты и поддержания стерильных условий. Под УЗИ руководством аккуратно вставить катетер 22G через кожу и мышцы непосредственно в левого надпочечника в качестве канала для сотовых инъекций. Извлеките иглу и оставить катетер на месте.
10. Загрузка охлажденные шприц Гамильтон оснащены малокалиберная игла с 10 мкл раствора ячейки, а затем руководство шприц вентрикуло через катетер, расположены в центре надпочечников.
11. Inject клеток в целевой ткани надпочечников. Оставьте иглу в место для 1-2 мин позволить matrigel установить. Медленно извлеките иглу, последующим удалением катетера.
12. Поместите мышей обратно в их клетке и убедитесь, что мышь восстанавливает достаточно сознания для поддержания грудной recumbency.
    Примечание: из-за минимально инвазивной природы этой техники, болевых ощущений после минимальной, но по-прежнему наблюдается на ежедневной основе с мышей здравоохранения проверки.» следует использовать с предложением: «Если неожиданный признаки боли или страданий определяются в ходе эксперимента консультироваться с устройство ветеринарных институциональной поддержки для получения информации о обезболивание или другие медицинские услуги.
    

Результаты

С помощью процедур представлены, УЗИ руководствуясь имплантации NB клеток в надпочечников было сделано в специализированную процедуру, залом с подогревом столы. Руки и ноги колодки были размещены для наблюдения за активностью мышиных сердца (рис. 1A). Жи...

Обсуждение

УЗИ руководствуясь имплантация NB и ES клеток-это эффективный и безопасный метод, чтобы установить надежный мышиных ксенотрасплантатов для доклинических исследований в биологии рака. Решающее значение для успеха УЗИ руководствуясь ткани целевой имплантация является присутствие и нал?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G