Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ultraschall-gesteuerte Injektion von Neuroblastom (NB) und Ewing Sarkom (ES) Zellen zu nutzen (gegründet Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen) an biologisch relevanten Standorten erstellen zuverlässigere präklinische Modellen für Krebs Forschung.

Zusammenfassung

Präklinische Tests von Anti-Krebs-Therapien setzt auf relevante Xenograft-Modelle, die die angeborenen Tendenzen des Krebses zu imitieren. Vorteile des standard subkutane Flanke Modelle sind prozedurale Leichtigkeit und die Fähigkeit, Monitor Tumorprogression und Antwort ohne invasive Bildgebung. Solche Modelle sind oft widersprüchlich in translationalen klinischen Studien und eingeschränkten biologisch relevante Merkmale mit geringer Neigung, Metastasen, zu produzieren wie eine native Mikroumgebung fehlt. Im Vergleich dazu zeigten orthotopen Xenograft Modelle an native Tumor Standorten zu imitieren den Tumor Mikroumgebung und wichtige Erkrankung Merkmale wie Ferne Metastasierung zu replizieren. Diese Modelle erfordern oft mühsame Operationsverfahren mit Narkose längere Zeit und Erholung. Um dieses Problem anzugehen, haben Krebsforscher kürzlich Ultraschall-geführte Injektionstechniken zu Krebs Xenograft Modelle für präklinische Experimente, ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Einrichtung unter der Regie von Gewebe murinen Modellen genutzt. Ultraschall-Visualisierung ermöglicht auch eine nicht-invasive Methode zur longitudinalen Beurteilung der Tumor Engraftment und Wachstum. Hier beschreiben wir die Methode für die Ultraschall-gesteuerte Injektion von Krebszellen, unter Verwendung der Nebenniere für NB und renale Sub Kapsel für ES. Diese minimal-invasive Ansatz überwindet mühsam offene Operation Implantation von Krebszellen im Gewebe-spezifische Standorte für Wachstum und Metastasierung und morbide Erholungsphasen nachlässt. Wir beschreiben die Verwendung von etablierten Zelllinien und Patienten abgeleitete Zellinien zur orthotopen Injektion. Vorgefertigte kommerziellen Kits sind erhältlich für Tumor Dissoziation und Luciferase tagging von Zellen. Injektion von Zellsuspension mit Bildführung bietet eine minimalinvasive und reproduzierbare Plattform für die Erstellung von präklinischen Modellen. Diese Methode wird genutzt, um zuverlässige präklinischen Modellen für andere Krebsarten wie Blase, Leber und Bauchspeicheldrüse Veranschaulichung seiner ungenutzte Potenzial für zahlreiche Krebs-Modelle zu erstellen.

Einleitung

Tierische Xenograft Modelle sind unverzichtbare Werkzeuge für präklinische Studien neuartiger Anti-Krebs-Therapien. Standard murinen Xenotransplantate setzen auf subkutane Flanke Implantation von Zellen, die vorsieht, dass einer effiziente und leicht zugänglichen Website Überwachung Tumorwachstum. Der Nachteil der subkutanen Modelle ist ihr Mangel an Tumor-spezifische biologische Merkmale, die ihr Potenzial metastasize¹eingeschränkt werden kann. Solche Einschränkungen sind durch den Einsatz von orthotopen Xenotransplantate in welchem, die Tumor Zellen bei nativen Gewebe, die relevanten Mikroumgebung mit metastasierendem potenzielle²aufgeprägt sind. Orthotopen Xenograft Modelle erhalten ursprüngliche biologischen Eigenschaften und bieten zuverlässige Modelle für präklinische Drug Discovery^3,4. Die Krebszellen genutzt für die Implantation unter der Regie von Gewebe sind etablierte Zelllinien oder Patienten gewonnenen Zellen von Patienten Tumoren. Gegründet von Krebszelllinien Xenotransplantate können hohe genetische Abweichung von den primären Tumor im Vergleich zu Patienten abgeleiteten Xenotransplantate⁵aufweisen. Angesichts dieser Tatsache ist die Einrichtung des Patienten abgeleitet orthotopen Xenotransplantate bevorzugter Standard für das Testen neuen Therapeutika in der Drogeentdeckung Krebs geworden.

In der pädiatrischen Krebs Neuroblastom (NB) orthotopen Xenograft Modelle rekapitulieren Primärtumor Biologie und Metastasen zu typischen Sehenswürdigkeiten der NB verteilt^6,7zu entwickeln. NB entwickelt in der Nebenniere oder entlang der paravertebralen Grenzstrang. Die am häufigsten verwendeten Methoden der orthotopen Implantation erfordern offene Trans abdominale chirurgische Eingriffe. Solche Methoden sind oft langweilig, haben hohe Tier Morbidität und komplexe Erholungsphasen. Hochauflösende Ultraschall wurde vor kurzem für Gewebe gerichtet Implantation von Tumorzellen in der Entwicklung von mehreren murinen Modellen für Krebs Forschung^8,9genutzt. Die Technik ist zuverlässige, reproduzierbare, effizient und sicher für die Einrichtung von entsprechenden metastasiertem Tumor Xenografts^10,11.

Die Einrichtung der pädiatrischen Krebs Xenotransplantate durch Ultraschall-geführte Ziel Orgel Lokalisierung und Nadel Implantation von Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen ist nachgewiesene¹¹. Die Technik war für NB gezielt an der murinen Nebenniere genutzt. Ewing Sarkom (ES) ist überwiegend ein knöcherner Krebs, häufig in den langen Röhrenknochen wie Femur und Beckenknochen¹²zu sehen. Fallberichte haben gezeigt, dass um festzustellen, ob eine überwiegend knöcherner Krebswachstum in renal Gewebe machbar ist, eine renale Sub Kapsel Lage für orthotopen Implantation¹³gewählt wurde. Renal Sub Kapsel Zelle Implantation von Tumorzellen ist als ein zukunftsträchtiges Modell, spontane Metastasen für ES¹⁴zu studieren verwendet worden.

Protokoll

Alle Arbeit erfolgte in Übereinstimmung mit der University of Michigan Institutional Review Board (HUM 00052430) und entspricht den Verfahren, die von der Universität Ausschuss für Gebrauch und Pflege von Tieren (UCUCA) genehmigt. Die Einheit für Labor von Tier Medizin (ULAM) beaufsichtigte Tierpflege.

Alle Arbeit wurde mit Genehmigung von der University of Michigan Institutional Review Board (HUM 00052430) getan und alle Humanforschung Ethik Komitee Vorschriften entspricht. Menschliche Zellen gelten als potenziell biogefährliches Material sein, also folgen alle Vorsichtsmaßnahmen und entsprechende Biosafety-Praktiken, die von Ihrer Institution erforderlich sind. NSG-Mäuse sind stark immungeschwächten und anfällig für Krankheiten, verursacht durch Bakterien in der Umwelt weit verbreitet.
Verwenden Sie immer strengen sterilen Technik, bei der Vorbereitung der Materialien für die Implantation und die Injektionen durchführen.

(1) Zellkultur

1. Etablierten menschlichen NB Zelllinien (SH-SY5Y, SK-N-BE2 und IMR32) in minimaler wesentliches Medium wachsen mit 10 % fötalen Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzt. IMR32 Zellen weiter mit 1 mM Pyruvat und 0.075 % Nahco3₃zu ergänzen. Halten Sie alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO₂ und 70-80 % Zusammenfluss_.
2. Wachsen Sie menschliche ES Zelllinien (TC32, A673 CHLA-25 und A4573) in RPMI Medium mit 10 % fötalen Rinderserum und 6 mM L-Glutamin ergänzt. Halten Sie alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO₂ auf 70-80 %_.
3. Senden Sie alle Zelllinien für die Authentifizierung.
   Hinweis: Zelle Authentifizierung erfolgt bei einer Außenanlage, verweisen wir auf Bestätigungen.

2. Vorbereitung des Patienten abgeleitet Primärtumor Zellen

1. Mit Zustimmung des Patienten und Zustimmung verworfen Ernte menschlichen NB Tumorgewebe von Patienten, die eine chirurgische Resektion für lokale Kontrolle und Transport ins Labor in Gewebe Speicherlösung für Erhaltung.
   Hinweis: Alle Patientenproben de identifiziert und entsprechend den Institutional Review Board Richtlinien behandelt.
2. Generieren Sie einen einzigen Patienten abgeleitet Krebs Zellsuspension (UMNBL001, UMNBL002) aus Tumorgewebe mit einem Tumor Dissoziation-Kit. Transfer ca. 0,5 g des Tumors zum einen 100 mm Zelle Kulturschale mit 5 mL RPMI Puffer, 200 µL Enzym H, 100 µL Enzym R und 25 µL Enzym A aus dem menschlichen Tumor-Dissoziation-Kit.
3. Hacken den Tumor in kleine Stücke (2-4 mm) mit Schere und Zange Gewebe. Mischen Sie diese Fragmente mit den Lösungen im Schritt 2.2.
4. Pipette die Tumor-Mischung in ein Dissociator Rohr und das Röhrchen verschließen. Invertieren der Röhre und auf der Hülle der Gewebe Dissociator befestigen. Führen Sie auf Programm h_tumor_01.
5. Inkubieren Sie die Tumor-Zellsuspension oben erhaltenen bei 37 ° C für 1 h auf einem drehbaren Gestell mit intermittierenden Verreibung alle 15 min.
6. Übertragen der Zellsuspension auf eine neue konische Rohr 50 mL und 10 mL RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 314 X g für 5 min.
7. Den überstand zu entfernen und das Pellet in 5 mL RPMI auszusetzen. Diese Lösung durch ein 40 µm Zelle Sieb passieren und die angespannte Lösung in ein frisches 50 mL konische Röhrchen sammeln. Waschen Sie dieses Sieb einmal mit 5 mL RPMI Medien und Zentrifugieren Sie die Mischung bei 314 X g für 5 min, ein Pellet zu sammeln.
8. Messen Sie die Zelldichte mit einem Hemacytometer¹⁵. Aussetzen der Pellets von oben erwarb RPMI, eine Endkonzentration von 4 × 10⁵ Zellen/10 µL zu erhalten. Nehmen Sie 5 µL dieser Zellsuspension und 5 µL Matrigel 10 µL der Zelle Lösung für jede Injektion zu machen.
   Hinweis: RPMI verwendet hängt die Zelle Dichtemessung. Beispielsweise wenn die gemessenen Zelldichte des erhaltenen Pellets 4 x 10⁵ Zellen ist, aussetzen Sie, das Pellet in 10 µL RPMI.

(3) Luciferase Tagging von Krebszellen

1. Machen Sie 10 mL der Transduktion Medien mit viralen überstand EF1a-Luc2-IRES-mCherry 5 mL und 5 mL Stammzell-Medien. Fügen Sie 7,5 µL 1 X Polybrene.
2. Mix 5 × 10⁶ Krebszellen in Transduktion Medien und Platte in 100 mm ultra-niedrigen Befestigungsplatte. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂ über Nacht.
   Hinweis: Da niedrige anbauplatten verwendet werden, werden Zellen nicht Platte eingehalten.
3. Bringen Sie nach 24 h 100 mm Platte Zellen unter Gewebekultur Haube zu, und übertragen Sie die Mischung in ein 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 314 X g für 5 min. zu Fuß die Zelle Pellet. Waschen Sie die Zelle Pellet einmal mit 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL HBSS, enthält 1 % fetalen bovine Serum (FBS).
   1. Sortieren Sie Luciferase Zellen basierend auf GFP-positiven Signal auf Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Analyse. Platte der sortierten Zellen auf 100 mm Gewebekultur behandelt-Speise- und pflegen auf 70-80 % Zusammenfluss, 37 ° C und 5 % CO₂ bis erforderlich.
4. Luciferase Signal mit Luciferase Assay Kit zu bestätigen. Platte 10 x 10⁴ sortiert Zellen pro Bohrloch in ein Illuminometer kompatibel 96 gut Platte und inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO₂. Nach 24 h 96-well-Platte auf Raumtemperatur bringen und kultivierten Medien in Brunnen im Verhältnis 1:1 Steady-Glo Reagenz hinzuzufügen. Können Sie Zellen lysiert für 5 min und Lumineszenz im Spektralphotometer zu lesen.
5. Bringen Sie die 100 mm Schale unter einer Gewebekultur Haube. Verwerfen Sie die überstand Medien. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL 1 X PBS.
6. Fügen Sie 2 mL 0,25 % Trypsin und 100 Millimeter-Teller in den Inkubator für 2-3 min zurück. Nach 2-3 min verdrängt Zellen unter dem Mikroskop suchen Sie und 8 mL RPMI, Trypsin zu deaktivieren.
7. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 314 X g für 5 min. zu Fuß ein Pellet. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zelle Pellet mit 1 mL 1 X PBS, auszusetzen Sie, das Pellet in 5 mL RPMI und bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hemacytometer¹⁵. Zentrifugieren Sie Yhe verbleibende Zelle Lösung bei 314 X g für 5 min um eine Kugel zu erhalten.
8. Hängen Sie das Pellet in RPMI, eine Konzentration von 4 x 10⁵ Zellen/10 µL zu erhalten. Nehmen Sie 5 µL Zellsuspension und 5 µL Matrigel 10 µL der Zelle Lösung für jede Injektion zu machen.

4. Ultraschall geführte Nebenniere (NB) oder renale Sub-Kapsel (ES)-Implantation

Hinweis: Alle Ultraschall-Verfahren werden mit einer hohen Auflösung in Vivo imaging-System durchgeführt. Für die beschriebenen Verfahren wurde die Wandler, hat eine Mittenfrequenz von 40 MHz und eine Bandbreite von 22-55 MHz verwendet.

1. 6-8-Woche-alten immundefiziente NSG Mäuse für alle Injektionsverfahren zu nutzen.
2. Chill Matrigel und autoklaviert Hamilton Spritzen ausgestattet mit einer 27G Nadel (1,25") und 22G Katheter (0,9 mm Außendurchmesser, Länge 25 mm) über Nacht bei 4 ° c
3. Legen Sie die Zelle Lösung in Schritt 3 auf Eis zubereitet.
4. Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktion Kammer mit 2 % Isofluran O₂ bei 2 L/min geliefert.
   Hinweis: Ausreichende Anästhesie wird mit der Mangel an Bewegung und die Erhaltung der Spontanatmung bestimmt.
5. Sobald betäubt, enthaaren Sie den Rücken und die Flanken der Tiere mit Haarwasser entfernen (z. B. Nair) und einen Rasierer.
6. Das Tier zum Übertragen der imaging Plattform mit Bauch Seite nach unten, wo die Nase des Tieres in eine Nosecone platziert und sicherte sich beim Einatmen Isofluran
7. Setzen Sie optische Salbe in das Tier Augen Austrocknen zu verhindern. Kleben Sie die Maus um eine unbeabsichtigte Bewegung zu verhindern.
8. Identifizieren der murinen Leber, Vena Cava, Milz, linke Niere und angrenzenden linke Nebenniere mit Ultraschall Visualisierung.
9. Sterile Handschuhe, Maske und Mütze für persönlichen Schutz und Pflege der sterilen Bedingungen zu verwenden. Unter Ultraschallkontrolle sanft legen Sie 22G Katheter durch die Haut und sichern Sie Muskel direkt in der linken Nebenniere für zelluläre Injektion einen Kanal zu. Entfernen Sie die Nadel und verlassen Sie den Katheter im Ort zu.
10. Last einer gekühlten Hamilton-Spritze mit einer KK Nadel mit 10 µL der Zelle-Lösung ausgestattet, dann führen Sie die Spritze hierbei durch den Katheter positioniert in der Mitte der Nebenniere.
11. Injizieren Sie die Zellen in den Nebennieren Zielgewebe. Belassen der Nadelöhrs für 1-2 min erlauben die Matrigel festlegen. Langsam ziehen Sie die Nadel, gefolgt von der Entfernung des Katheters.
12. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihren Käfig und sicherstellen Sie, dass die Maus ausreichend zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wieder zu sich kommt.
    Hinweis: aufgrund des minimal-invasiven Charakters dieser Technik, post prozeduralen Schmerz ist minimal, aber immer noch überwacht auf einer täglichen Basis mit Mäusen Gesundheit Kontrollen. "befolgt werden mit einem Satz:" Wenn unerwartete Zeichen von Schmerz oder Stress im Verlauf gekennzeichnet sind ein Experiment wenden Sie sich bitte mit Ihrem institutionellen tierärztliche Unterstützung Gerät Informationen zur Analgesie oder andere medizinische Versorgung.
    

Ergebnisse

Mit den beschriebenen Verfahren vorgestellt, erfolgte Ultraschall-geführte Implantation von NB-Zellen in der Nebenniere in einem speziellen Verfahren Raum verfügt über eine beheizte OP-Tisch. Arm und Fuß-Pads stellte für die Überwachung der murinen Herztätigkeit (Abbildung 1A). Das Tier blieb unter kegelkonus Inhalation mit Isofluran betäubt. Mit einer hochauflösenden Ultraschallsonde, wurde die linke Niere mit Nebenniere nur cranial der Niere (

Diskussion

Ultraschall-geführte Implantation von NB und ES Zellen ist eine effiziente und sichere Methode, um zuverlässige murinen Xenotransplantate für präklinische Studien in der Krebsbiologie zu etablieren. Entscheidend für den Erfolg des Ultraschall-geführte Gewebe gezielt Implantation ist die Präsenz und Verfügbarkeit von geschultem Personal mit Fachwissen in anatomisch Lokalisierung der Orgel von Interesse und Stereotaktische Injektion von Tumorzellen.

Die Dissoziation des Tumorgewebes erwi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G