ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנצל מונחה אולטרה סאונד הזרקה של נוירובלסטומה (NB) ותאים של יואינג סרקומה (ES) (שהוקמה שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה) באתרים הרלוונטיים ביולוגית ליצירת במודלים פרה אמין עבור סרטן מחקר.

Abstract

בדיקה פרה של טיפולים נגד סרטן מסתמכת על מודלים xenograft רלוונטי המחקים את נטיות מולדת של סרטן. היתרונות של דגמים סטנדרטיים האגף תת עורית כוללות הקלות פרוצדוראליות ואת היכולת התקדמות הגידול צג, התגובה ללא פולשני הדמיה. מודלים כאלה לעיתים קרובות אינם עקביים בניסויים קליניים translational, יש מוגבל המאפיינים הרלוונטיים ביולוגית עם נטייה נמוכה כדי לייצר גרורות, כפי שיש מחסור microenvironment מקורי. לשם השוואה, orthotopic דגמים xenograft באתרי גידול יליד הראו לחקות את microenvironment הגידול ואף לשכפל את מאפייני המחלה חשוב כגון התפשטות גרורתית מרוחקת. מודלים אלה דורשות לעתים קרובות ניתוחים מייגע עם תקופות זמן ושחזור הרדמה ממושכות. כדי לטפל בבעיה זו, סרטן חוקרים נעזרו לאחרונה הזרקת מונחה אולטרה סאונד טכניקות כדי ליצור מודלים xenograft סרטן לניסויים פרה, המאפשר הקמת מודלים מאתר מכוון רקמות מהיר ואמין. הדמיית אולטרה סאונד מספק גם שיטה לא פולשנית להערכת האורך של engraftment גידול וצמיחה. כאן, נתאר את שיטת להזרקה מונחה אולטרה סאונד של תאים סרטניים, ניצול בלוטת יותרת הכליה עבור NB ו- sub כליות כמוסה עבור ES. בגישה פולשנית זו גוברת על ניתוח פתוח מייגע ההשתלה של תאים סרטניים במיקומים רקמות ספציפיות עבור הצמיחה, גרורות, abates ותקופות התאוששות חולנית. אנו מתארים את הניצול של שורות תאים הוקמה והן שורות תאים נגזר החולה להזרקה orthotopic. ערכות מוכנות מראש מסחריים זמינים עבור גידול דיסוציאציה ותיוג לוציפראז של תאים. הזרקה של הבולם התא באמצעות תמונה-ההדרכה מספק פלטפורמה מינימלית פולשנית, לשחזור להקמת במודלים פרה. שיטה זו מנוצל ליצירת במודלים פרה אמין עבור סוגי סרטן אחרים כגון שלפוחית השתן, המשמשים שלה פוטנציאל לא ממומש עבור מודלים רבים של סרטן הכבד והלבלב.

Introduction

מודלים xenograft בעלי חיים הם כלי חיוני עבור מחקרים פרה של טיפולים נגד סרטן. Xenografts מאתר סטנדרטי להסתמך על האגף תת עורית ההשתלה של תאים, מתן אתר נגיש ויעיל עבור ניטור הגידול. החיסרון של מודלים תת עורית הוא היעדרם של מאפייני וחיסונים גידול ספציפי, אשר עשוי להגביל את הפוטנציאל שלהן גרורות¹. הגבלות יש להתגבר על ידי שימוש xenografts orthotopic ב איזה גידול התאים הם engrafted באתרים רקמה מקורית, מתן של microenvironment רלוונטי עם פוטנציאל גרורתי². מודלים xenograft Orthotopic לשמור על תכונות ביולוגיות המקורי ולספק מודלים אמינים סמים פרה-גילוי-^3,-⁴. התאים הסרטניים מנוצל להשתלה רקמות מכוון הם שורות תאים הוקמה או תאים החולה נגזר מן המטופל גידולים. Xenografts הוקמה מתוך שורות תאים סרטן עשוי להפגין סטייה גנטית גבוהה מן הגידול העיקרי לעומת xenografts נגזר החולה⁵. נתון זה, הקמת xenografts orthotopic נגזר החולה הפך תקן המועדפת לבדיקת הריפוי בגילוי סרטן סמים.

סרטן ילדים נוירובלסטומה (NB), מודלים xenograft orthotopic מסכם את הדברים הגידול העיקרי ביולוגיה, לפתח גרורות לאתרים טיפוסי של NB להפיץ^6,7. NB מתפתח בבלוטת יותרת הכליה או לאורך השרשרת סימפטי הבין-חולייתיים. השיטות הנפוצות ביותר של orthotopic-השרשה מחייבים הליכים כירורגיים הטרנס-בטן פתוחה. שיטות כאלה לעיתים מייגע, יש תחלואה גבוהה בעלי חיים, ותקופות התאוששות מורכבים. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יש לאחרונה נעזרו מכוון רקמות ההשתלה של תאים סרטניים בשלבי פיתוח של מספר מודלים מאתר סרטן מחקר^8,9. הטכניקה היא אמין לשחזור, יעיל, בטוח להקמתה של גידול גרורתי הרלוונטיים xenografts^10,11.

הקמת סרטן ילדים xenografts על ידי המטרה מונחה אולטרסאונד איברים ההשתלה לוקליזציה ואת המחט של שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה הוא והפגינו¹¹. הטכניקה היה מנוצל עבור NB ממוקד בלוטת יותרת הכליה מאתר. סרקומה ע ש יואינג (ES) היא בעיקר סרטן osseous, לעתים קרובות העצמות הארוכות כמו עצם הירך ו עצמות האגן¹². הדו חות הראו כי כדי לקבוע אם הצמיחה של סרטן בעיקר osseous ריאלי ברקמת הכליה, במיקום הסיבה sub כליות נבחרה עבור orthotopic-השרשה¹³. יש כבר מנוצל כליות תת תא הסיבה ההשתלה של תאים סרטניים כמודל מבטיח ללמוד גרורות ספונטנית ES¹⁴.

Protocol

כל העבודה נעשתה על פי אוניברסיטת מישיגן הועד המוסדי (00052430 לזמזם) ותואם לשגרות אושרה על ידי הוועדה האוניברסיטה על שימוש, טיפול בבעלי חיים (UCUCA). יחידת עבור המעבדה של בעלי חיים רפואה (אולם) השגיח טיפול בבעלי חיים.

כל העבודה נעשתה באישור של אוניברסיטת מישיגן הועד המוסדי (לזמזם 00052430), תואמת לכל תקנות ועדת האתיקה מחקר אנושי. תאים אנושיים נחשבים להיות חומר העלול ותברואה, אז תעקוב אחרי כל באמצעי זהירות מיוחדים ושיטות אבטחה המתאימה הנדרשים על ידי המוסד שלך. NSG עכברים הם immunocompromised קשות להיות רגישים למחלה הנגרמת על ידי חיידקים הנמצאים בדרך כלל הסביבה.
השתמש תמיד קפדנית סטרילי טכניקה בעת הכנת חומרי השרשה וביצוע הזריקות.

1. תרבית תאים

1. לגדול ויצר אנושי NB שורות תאים (SH-SY5Y, SK-N-BE2 ו IMR32) אמצעי חיוני מינימלי, בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 2 מ מ, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/mL 100. תוספת IMR32 תאים נוספים עם 1 מ מ פירובט ו- 0.075% NaHCO₃. לשמור על כל התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו- 70-80% הנהרות_.
2. לגדול האנושי ES שורות תאים (TC32, A673, CHLA-25 ו A4573) בינוני RPMI בתוספת 10% סרום שור בעובר ו 6 מ"מ-גלוטמין. לשמור על כל התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ב 70-80% הנהרות_.
3. לשלוח כל שורות תאים עבור אימות.
   הערה: תא האימות נעשה על מתקן חיצוני, עיין תודות.

2. הכנה של תאי הגידול העיקרי נגזר החולה

1. עם החולה והסכמתו ובהסכמה, קציר שנמחקו רקמה אנושית הגידול NB של חולים שעברו כריתה כירורגית עבור בקרה מקומיות ותחבורה ציבורית המעבדה בפתרון אחסון רקמות לשימור.
   הערה: כל דוגמאות החולה בטל מזוהה, מטופלים לפי הנחיות הועד המוסדי.
2. צור השעיה תא יחיד נגזר חולה סרטן (UMNBL001, UMNBL002) של רקמת הגידול באמצעות ערכת דיסוציאציה הגידול. להעביר לצלחת תרבות תא 100 מ מ המכיל 5 מ ל מאגר RPMI, 200 µL של האנזים H, µL 100 של האנזים R ו- 25 כ 0.5 g של גידול µL של אנזים A הערכה דיסוציאציה גידול אנושי.
3. מינצ הגידול לחתיכות קטנות (2-4 מ מ כל אחד) באמצעות רקמות מלקחיים ומספריים. מערבבים קטעים אלה עם הפתרונות בשלב 2.2.
4. Pipette את תערובת הגידול לתוך צינור dissociator וסגור את הצינור. היפוך הצינור וחבר בשרוול של dissociator הרקמה. להפעיל תוכנית h_tumor_01.
5. דגירה התליה תא הגידול לקבלו מעל 37 ° C עבור h 1 על מתלה מסתובב עם trituration לסירוגין כל 15 דקות.
6. התליה תא להעביר צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI. Centrifuge התליה תא ב g 314 x במשך 5 דקות.
7. הסר את תגובת שיקוע, להשעות את צניפה ב 5 מ של RPMI. פתרון זה עוברים מסננת תא 40 µm ולאסוף את הפתרון מאומצות לתוך צינור חרוטי מ"ל. רוחצים זו מסננת פעם אחת עם 5 מ של התקשורת RPMI את centrifuge את התערובת ב g 314 x עבור 5 דקות כדי לאסוף גלולה.
8. מודדים את צפיפות התאים באמצעות hemacytometer¹⁵. להשעות את צניפה להשיג מלמעלה RPMI בריכוז סופי של 4 × 10⁵ תאים/10 µL. לוקחים 5 µL של ההשעייה תא µL 5 של matrigel כדי להפוך µL 10 של התא פתרון עבור כל זריקה.
   הערה: כמות RPMI נעשה שימוש תלויה מדידת צפיפות התאים. לדוגמה, אם צפיפות תא נמדד בגדר שהושג 4 x 10⁵ תאים, להשעות את צניפה ב 10 µL של RPMI.

3. לוציפראז תיוג של תאים סרטניים

1. להפוך 10 מ"ל של התמרה חושית מדיה עם 5 מ של נגיפי supernatant EF1a-Luc2-IRES-mCherry, 5 מ של תאי גזע מדיה. להוסיף 7.5 µL של 1 x polybrene.
2. מערבבים 5 × 10⁶ תאים סרטניים התמרה חושית מדיה וצלחת בצלחת 100 מ מ קובץ מצורף נמוך במיוחד. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בן לילה.
   הערה: צלחות מצורף נמוכה משמשים, התאים לא דוגלים צלחת.
3. לאחר 24 שעות, להביא את הצלחת 100 מ מ המכיל תאים מתחת תרביות רקמה המנוע ולהעביר את התערובת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. Centrifuge התליה תא ב g 314 x עבור 5 דקות להביא בגדר התא. רוחצים בגדר תא פעם אחת עם 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) את להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של HBSS המכיל 1% סרום שור עוברית (FBS).
   1. מיין תאים לוציפראז בהתבסס על אות ה-GFP-חיוביות על תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח. צלחת התאים הממוינים על תרביות רקמה 100 מ מ מטופלים דיש ולתחזק ב 70-80% הנהרות, 37 ° C ו- 5% CO₂ עד הנדרש.
4. לאשר לוציפראז האות עם ערכת assay לוציפראז. דגירה תאים בן לילה על 37 ° C ו 5% CO₂, ואוהבים צלחת צלחת 10 x 10 תאים⁴ ממוין לפי בעיר illuminometer 96 תואם. לאחר 24 שעות, להביא את הצלחת היטב 96 לטמפרטורת החדר ומוסיפים יציב-Glo ריאגנט מדיה בתרבית בבארות ביחס 1:1. מאפשרים לתאים lyse עבור 5 דקות ולקרוא הארה ב ספקטרופוטומטרים.
5. להביא את המנה 100 מ מ תחת ברדס תרביות רקמה. למחוק את התקשורת supernatant. לשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ ל 1 x PBS.
6. להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין וחוזרים המנה 100 מ מ החממה למשך 2-3 דקות. לאחר 2-3 דקות, לבדוק אם התאים ונדרש תחת מיקרוסקופ ולהוסיף 8 מ של RPMI לבטל את הפעלתה של טריפסין.
7. לאסוף את התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה ב g 314 x עבור 5 דקות כדי לקחת גלולה. למחוק את תגובת שיקוע. לשטוף בגדר תא עם 1 מ"ל של PBS 1 x, להשעות את צניפה ב 5 מ של RPMI וקבע את צפיפות התאים באמצעות hemacytometer¹⁵. צנטריפוגה yhe שנותרו פתרון תא g 314 x עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה.
8. להשעות את צניפה ב RPMI בריכוז של 4 x 10⁵ תאים/10 µL. לוקחים 5 µL של התליה תא µL 5 של matrigel כדי להפוך µL 10 של התא פתרון עבור כל זריקה.

4. אולטרסאונד מודרכת בלוטת יותרת הכליה (NB) או Sub כליות השרשה כמוסה (ES)

הערה: כל הפרוצדורות האולטרסאונד מתבצעות באמצעות יישום ברזולוציה גבוהה ויוו מערכת הדמיה. ההליכים המתוארים, שימש המתמר, אשר יש תדר מרכז של 40 מגה-הרץ של הפס של 22-55 מגה-הרץ.

1. לנצל 6-8-בת שבוע חיסונית לקויה NSG עכברים עבור כל שגרות הזרקה.
2. להרגיע את matrigel ואת בלוק מזרקים המילטון מצויד עם מחט 27G (1.25"), קטטרים 22 גרם (בקוטר חיצוני 0.9 מ מ, 25 מ מ אורך) לילה ב 4 º C.
3. המקום הפתרון תא מוכן בשלב 3 על קרח.
4. עזים ומתנגד העכברים בתא אינדוקציה שימוש איזופלוריין 2% ב- O₂ וכשאשר 2 ל'/min.
   הערה: הרדמה נאותה נקבע עם חוסר תנועה פעיל ותחזוקה של נשימה ספונטנית.
5. ברגע מרדימים, depilate האגף של בעלי החיים באמצעות קרם להסרת שיער (כגון Nair) שייבר ומאחור.
6. העברת החיה פלטפורמת הדמיה עם צד הבטן למטה, איפה האף של החיה ימוקם nosecone, מאובטחת תוך שאיפה איזופלוריין.
7. הצב משחה אופטי בעיניים של בעל החיים כדי למנוע התייבשות. קלטת את העכבר במקום כדי למנוע כל תנועה בהיסח הדעת.
8. לזהות את הכבד מאתר, הנבוב, הטחול, הכליות, הסמוך בלוטת יותרת הכליה השמאלית בעזרת ויזואליזציה אולטרסאונד.
9. השתמש בכפפות סטריליות, מסכה, כובע הגנה אישית ותחזוקה של תנאים סטריליים. בהנחיית אולטרסאונד, בעדינות נחדיר קטטר 22 גרם דרך העור, חזרה השריר ישירות לתוך בלוטת יותרת הכליה השמאלית כדי לספק ערוץ להזרקה הסלולר. הסר את המחט ולהשאיר את הקתטר במקומו.
10. עומס מזרק המילטון צוננת מצויד עם מחט small-bore עם 10 µL של פתרון תא ולאחר מכן להנחות את המזרק stereotactically דרך הקטטר ממוקם לתוך המרכז של בלוטת יותרת הכליה.
11. להזריק את התאים לתוך רקמת הכליה יישוב. להשאיר את המחט במקום למשך 1-2 דקות לאפשר את matrigel להגדיר. הסר את המחט, ואחריו הסרת הקטטר.
12. הצב והעכברים בחזרה לכלוב שלהם ולהבטיח כי העכבר להכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
    הערה: בשל אופיו פולשנית של טכניקה זו, כאב פוסט פרוצדורלי הוא מינימלי, אבל עדיין בפיקוח על בסיס יומי עם עכברים בריאות בדיקות. "צריכה להיות מלווה עם משפט:"אם לא צפוי סימני כאב או מצוקה מזוהים במהלך הקורס של ניסוי, התייעץ עם היחידה שלך תמיכה מוסדית וטרינרית לקבלת מידע בנוגע שיכוך כאבים או טיפול רפואי אחר.
    

תוצאות

באמצעות ההליכים שהוצגו, מונחה אולטרה סאונד ההשתלה של תאים NB לתוך בלוטת יותרת הכליה נעשה הליך ייעודי חדר מאובזר בשולחן מחומם כירורגי. מגיני זרוע ורגל הונחו לניטור פעילות הלב מאתר (איור 1 א'). בעל החיים נשאר anesthetized תחת איזופלוריין באמצעות אינהלציה האף חרוט. ב...

Discussion

מונחה אולטרה סאונד ההשתלה של תאים NB ו- ES היא שיטה יעילה ובטוחה להקים אמין xenografts מאתר ללימודי פרה בביולוגיה סרטן. קריטי להצלחת מונחה אולטרה סאונד ממוקדות רקמות השרשה הוא הנוכחות ואת הזמינות של צוות מיומן עם מומחיות אנטומית לאתר. את האיבר של עניין, הזרקת סטיאוטטי של תאים סרטניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G