超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

要約

ここでは、癌に対する信頼性の高い前臨床モデルを作成する生物学的関連性の高いサイトで超音波ガイド下注入 (NB) 神経芽細胞腫、ユーイング肉腫 (ES) 細胞を利用する (設立細胞と患者由来腫瘍細胞) プロトコルを提案します。研究。

要約

抗癌治療の前臨床試験は癌の生得的な傾向を模倣する関連する異種移植モデルに依存します。標準皮下フランク モデルの利点には、手続き型の使いやすさとモニターの腫瘍の進行と侵襲的イメージングすることがなく応答する能力が含まれます。このようなモデルはしばしば並進臨床試験で一貫で、ネイティブの微小環境の欠如がある、転移を生成する低性癖と関連する生物学的特性が限られています。比較では、腫瘍微小環境を模倣し、遠い転移拡大など重要な病気の特徴を複製するネイティブ腫瘍のサイトで同所性同種異種移植モデルを示されています。これらのモデルは、多くの場合面倒な手術麻酔時および回復期間の長期を必要します。これに対処するため、癌の研究者は最近組織監督マウスモデルの迅速かつ信頼性の高い設置を可能にする臨床実験のため癌異種移植モデルを確立する超音波ガイド下注入技術を活用しています。超音波可視化は、腫瘍生着と成長の縦断的評価のための非侵襲的方法を提供します。ここでは、我々 ES の NB と腎サブ カプセルの副腎を利用した癌細胞の超音波ガイド下注射法をについて説明します。この低侵襲アプローチは、癌細胞の成長・転移、組織固有の場所での退屈なオープン外科注入を克服し、病的な回復期間を減少させます。両方の確立されたセルラインおよび同所性同種注射患者派生セルラインの利用について述べる。腫瘍解離とルシフェラーゼの細胞のタグ付けには、既製の市販キットがあります。画像ガイダンスを使用して細胞懸濁液の注入は、前臨床モデルを作成するため低侵襲で再現可能なプラットフォームを提供します。このメソッドを利用して、膀胱、肝臓、膵臓癌モデルの多数の潜在的な可能性を実証など他の癌のための信頼性の高い前臨床モデルを作成します。

概要

動物の異種移植モデルは、新規抗癌治療の前臨床試験のための不可欠なツールです。標準的なマウス異種移植片は、細胞、腫瘍の成長を監視するための効率的かつ簡単にアクセスできるサイトを提供するの脇腹の皮下注入に依存します。皮下のモデルの欠点は、腫瘍固有の生物学的特性は、¹を転移する可能性を制限可能性がありますの欠如です。このような制限は、直交異方性異種移植片に腫瘍細胞が転移の可能性がある²と関連する微小環境を提供するネイティブの組織のサイトでしみ込んでの使用によって克服します。同所性同種異種移植モデル元生物学的機能を維持し、前臨床創薬探索^3,4信頼性の高いモデルを提供します。がん細胞の組織向けの注入のために利用、確立されたセルラインまたは患者の腫瘍から患者由来の細胞です。がん細胞から確立された異種患者派生異種⁵と比較して原発の腫瘍から高の遺伝的分化を表わすかもしれない。これを考えると、患者由来同所性同種異種移植片の確立がん創薬における治療薬をテストするため最寄りの標準となった。

小児がんの芽 (NB)、同所性同種異種移植モデル原発腫瘍生物学を要約し、広がる NB^6、7の典型的なサイトへの転移を開発します。NB は、副腎や傍脊椎交感神経鎖に沿って開発しています。同所性同種移植の最も一般的な方法は、オープン トランス腹部手術を必要とします。このようなメソッドは、退屈な高い動物罹患率、複雑な回復期間です。高分解能超音波は、最近がん研究^8,9のいくつかのマウスモデルの開発中に腫瘍細胞の組織向けに利用されています。テクニックは、信頼性の高い、再現性の高い、効率的、かつ関連する転移性腫瘍異種移植片^10,11の確立のため安全です。

細胞と患者由来腫瘍細胞の超音波ガイド下のターゲット臓器局在と針注入による小児癌異種移植片の確立は示した¹¹です。マウス副腎を対象とした NB の技術が利用されました。ユーイング肉腫 (ES) は主に長い骨の大腿骨と骨盤の骨¹²などでよく見られる、骨のがんであります。症例報告では、主に骨の癌の成長は腎組織で実現可能かどうかを確認するのには同所性同種移植¹³腎サブ被膜場所が選ばれたことが示されています。腎サブ被膜腫瘍細胞の移植は、ES の¹⁴のための自発的な転移を勉強する有望なモデルとして利用されています。

プロトコル

すべての仕事は、米国ミシガン大学制度検討委員会 (ハム 00052430) に従って行われ、使用とケアの動物 (UCUCA) の大学委員会によって承認された手続きに適合しています。ユニットの実験室の動物医学 (ウラム) は、動物の世話を監督しました。

すべての仕事は、ミシガン大学制度検討委員会 (ハム 00052430) からの承認を得て行われ、すべて人間研究倫理委員会規程に準拠しています。ひと細胞は、潜在的汚染物質、従ってすべての特別な注意とあなたの機関で必要とされる適切なバイオ セーフティ プラクティスと見なされます。NSG マウスは、深刻な免疫不全と環境に一般的に見られる細菌によって引き起こされる病気になりやすいです。
常に注入し注射を実行するための材料を準備するとき厳密な無菌技術を使用します。

1. 細胞培養

1. 最小必須培地の確立されたラインの人間 NB セル (SH SY5Y、SK-N-BE2、IMR32) を成長 10% 牛胎児血清、2 mM グルタミン、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンと補われます。1 mM ピルビン酸と 0.075% NaHCO₃でさらに IMR32 細胞を補います。37 ° C、5% CO₂ 70-80% 合流_.ですべてのセルを維持します。
2. 成長 10% 牛胎児血清と 6 mM L グルタミン RPMI 培のヒト ES 細胞株 (TC32、A673、クロロフィル-25 日、A4573)。37 ° c、5% CO₂ 70 〜 80% 合流_.ですべてのセルを維持します。
3. 認証のためのすべての細胞を送信します。
   注: セル認証外の施設で行うと、受信確認を参照してください。

2. 患者由来腫瘍細胞の調製

1. 患者の同意と同意、局所制御と保全組織のストレージ ソリューションで研究所への輸送のため外科的切除を受けた患者から捨てられた人間 NB 腫瘍を収穫します。
   注: すべての患者のサンプルは解除識別、制度検討委員会のガイドラインに従って処理します。
2. 腫瘍腫瘍解離キットを使用してから単一患者由来がん細胞懸濁液 (UMNBL001、UMNBL002) を生成します。腫瘍の約 0.5 g を 5 mL の RPMI バッファー、酵素酵素 R の 100 μ H の 200 μ L と 25 を含む 100 mm 細胞培養皿に転送ひと腫瘍解離キットから酵素 A μ L。
3. 小さな断片 (2-4 mm ずつ) に腫瘍をミンチはさみと組織鉗子を使用しています。2.2 の手順でソリューションと、これらのフラグメントをミックスします。
4. 分解管に腫瘍混合物をピペットし、チューブを閉じます。チューブを反転、組織分解のスリーブの上に取り付けます。プログラム h_tumor_01 で実行します。
5. 断続的な製粉 15 分毎の回転ラックの 1 h の 37 ° C で得られた腫瘍細胞の懸濁液を孵化させなさい。
6. 新しい 50 mL のコニカル チューブに細胞懸濁液を転送し、RPMI の 10 mL を追加します。5 分の 314 x g で細胞懸濁液を遠心します。
7. 上澄みを除去し、RPMI 5 mL にペレットを中断します。40 μ m の細胞ストレーナーをこのソリューションを通過し、新鮮な 50 mL の円錐管に緊張したソリューションを収集します。5 mL の RPMI 培と一度このストレーナーを洗浄し、ペレットを収集するために 5 分の 314 x g で混合物を遠心分離機します。
8. ¹⁵計算盤を用いた細胞密度を測定します。上から、最終濃度が 4 × 10⁵セル/10 μ l RPMI で得られたペレットを中断します。この細胞懸濁液 5 μ L、5 μ L の各注入の細胞液の 10 μ L にマトリゲルを取る。
   注: RPMI 使用量は、細胞密度の測定によって異なります。たとえば、4 x 10 の⁵セルを指定した場合、得られたペレットの測定セル密度 RPMI の 10 μ L のペレットを中断します。

3. ルシフェラーゼは、がん細胞へのタグ付け

1. ウイルス上清 EF1a-Luc2-IRES-mCherry の 5 mL と 5 mL の幹細胞培伝達メディアの 10 mL を作る。1 x polybrene の 7.5 μ L を追加します。
2. ミックス 5 × 10⁶癌細胞情報伝達メディアで 100 mm 超低取り付けプレートのプレート。37 ° C、5% CO₂で一晩インキュベートします。
   注: 低接着プレートを使用すると、セルはプレートに付着しません。
3. 24 h 後ティッシュ文化フードの下のセルを含む 100 mm プレートを持参し、15 mL の円錐管に混合物を転送します。細胞ペレットを取得する 5 分の 314 x g で細胞懸濁液を遠心します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 1 mL で一度細胞ペレットを洗浄し、1% ウシ胎児血清 (FBS) を含む HBSS の 1 mL の細胞ペレットを中断します。
   1. ルシフェラーゼの細胞ソーティング (FACS) による蛍光活性化細胞での GFP 陽性信号に基づいてを並べ替え。プレート 100 mm 培養治療に並べ替えられた細胞料理し、70-80% の合流点、37 ° C、5% CO₂必要になるまでに維持します。
4. ルシフェラーゼ アッセイ キットとルシフェラーゼ信号を確認します。照度計互換性のある 96 の井戸あたりプレート 10 × 10⁴並べ替えセル ウェルし、37 ° C、5% CO₂で一晩細胞を孵化させなさい。24 h 後室温に 96 ウェル プレートを持参し、定常グロ試薬を 1:1 の比率で井戸の培養メディアに追加します。5 分間溶解し、発光分光光度計を読んでセルを許可します。
5. ティッシュ文化フードの下 100 mm ディッシュをもたらします。培養上清中のメディアを破棄します。2 mL の 1x PBS で 1 回洗浄を行う。
6. 0.25% トリプシンの 2 mL を追加し、2 〜 3 分のためのインキュベーターに 100 mm ディッシュを戻ります。2-3 分後に顕微鏡下で細胞を剥がれを確認、トリプシンを非アクティブ化する RPMI 8 mL を加えます。
7. 15 mL コニカル チューブ、ペレットを取得する 5 分の 314 × g で遠心分離細胞懸濁液を収集します。上清を捨てます。1 mL の 1x PBS で細胞ペレットを洗って RPMI 5 mL にペレットを中断¹⁵計算盤を用いたセル密度を決定します。Yhe の残りのペレットを取得する 5 分の 314 x g で細胞液を遠心します。
8. 濃度が 4 × 10⁵セル/10 μ l に RPMI でペレットを中断します。細胞懸濁液 5 μ L、5 μ L の各注入の細胞液の 10 μ L にマトリゲルを取る。

4. 超音波ガイド (NB) 副腎または腎サブ カプセル (ES) 注入

注: 超音波のすべてのプロシージャは、高解像度生体内でイメージ投射システムを使用して実行が。記載されている手順 22 55 MHz の帯域幅 40 MHz の中心周波数は、探触子が使用されます。

1. すべての注入手順 6-8 週齢免疫欠損 NSG マウスを活用します。
2. マトリゲルやハミルトンの 27 G 針 (1.25") を搭載するオートクレーブ注射器を冷やすし、22 G カテーテル (外径 0.9 mm、長さ 25 mm) 4 ° C で一晩
3. 氷の上 3 の手順で準備携帯ソリューションを配置します。
4. O₂ 2l/分で配信で 2% イソフルランを用いた誘導室でマウスを麻酔します。
   注: 適切な麻酔、活発な動きの欠如と自発呼吸のメンテナンスで決まります。
5. 麻酔、一度戻るとローション (ナイル) などと髭剃りを使用して動物の側面を depilate します。
6. 動物の鼻は、ノーズに置かれ、イソフルランを吸入しながら保護、動物を腹部側とイメージングのプラットフォームに転送します。
7. 乾燥を防ぐために動物の目の光の軟膏を配置します。テープの任意の不用意な動きを防止するためのマウス。
8. マウスの肝臓、上大静脈、脾臓、左腎臓、および超音波可視化を使用して隣接した左副腎を識別します。
9. 個人用保護具や滅菌条件のメンテナンスのため、滅菌手袋、マスク、キャップを使用します。超音波指導の下で慎重に皮膚を通して 22 G カテーテルを挿入、細胞注入のためのチャネルを提供する左副腎に直接筋肉をバックアップします。針を外し、カテーテルを場所に残します。
10. 負荷チルド ハミルトン注射器細胞液の 10 μ L で小口径の針が装備し、副腎のセンターに配置されているカテーテルを定位注射器をご案内します。
11. 対象となる副腎組織にセルを挿入します。マトリゲルを設定するを許可するように 1-2 分の場所に針を残します。ゆっくりと、カテーテル抜去後、針を抜きます。
12. 自分のケージに戻ってマウスを置き、マウスが胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻すことを確認します。
    注: この手法の低侵襲性質のため投稿手続き痛みは最小限ですが、まだマウスの健康チェックを日常的に監視されている」文に従う必要があります:「苦痛や予想外の印が識別される場合、コース中に実験の鎮痛やその他の医療に関する情報をあなたの施設の獣医支援ユニットにご相談ください。
    

結果

記載されている手順を使用して、超音波ガイド下副腎への NB 細胞の注入は温水手術テーブルを装備した専用の処置室で行われました。腕と足のパッドは、マウス中心の活動 (図 1 a) を監視するために置かれました。動物に残ったイソフルラン吸入ノーズコーンを使用して下で麻酔をかけられました。高分解能超音波プローブを使用して、左の腎?...

ディスカッション

超音波ガイド NB および ES 細胞移植は、がん生物学における臨床研究の信頼性の高いマウス異種移植片を確立する効率的かつ安全な方法です。超音波ガイド下の成功に重要な組織標的化注入が存在して腫瘍細胞の定位注射、解剖学的関心の器官のローカライズは専門知識を持つ訓練された人材の利用可能性。

腫瘍組織の解離は説明患者由来の異種移植モデルの開発の重要...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G