Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Özet

Burada, biyolojik ilgili sitelerdeki kanser için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için bir protokol ultrason destekli enjeksiyon Nöroblastom (NB) ve Ewing sarkomu (ES) hücre yararlanmak için (hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri kurulu) mevcut araştırma.

Özet

Preklinik antikanser terapiler test kanser doğuştan gelen eğilimleri taklit ilgili xenograft modellerde dayanır. Yordam kolaylığı ve yeteneği monitör tümör ilerleme ve yanıt invaziv görüntüleme olmadan standart subkutan kanat modelleri avantajları şunlardır. Modelleri gibi çoğu kez translasyonel klinik deneylere tutarsız ve yerel bir microenvironment eksikliği olduğu biyolojik ilgili özellikleri metastaz, üretmek için düşük meyil ile sınırlı. Buna karşılık, orthotopic xenograft modelleri yerli tümör sitelerdeki tümör microenvironment taklit ve uzak metastatik yaymak gibi önemli hastalık özellikleri çoğaltmak için gösterilmiştir. Bu modeller genellikle sıkıcı cerrahi anestezik zaman ve kurtarma takmaktan ile gerektirir. Bu sorunu çözmek için kanser araştırmacılar son zamanlarda kanser xenograft modeller için doku Yönetmen: fare modelleri hızlı ve güvenilir kurulması için sağlar preklinik deneyler kurmak için ultrason destekli enjeksiyon teknikleri kullanılan. Ultrason görselleştirme de boyuna değerlendirme tümör engraftment ve büyüme için invaziv bir yöntem sağlar. Burada, böbreküstü bezi NB ve böbrek alt kapsülü kullanmak için ES için kanser hücrelerinin ultrason destekli enjeksiyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu minimal invaziv yaklaşım sıkıcı açık cerrahi implantasyon kanser hücrelerinin büyüme ve metastaz doku özel konumlarda üstesinden gelir ve marazi kurtarma dönemleri azaliyor. Biz kurulan hücre satırları ve hasta türetilmiş hücre satırları orthotopic enjeksiyon için kullanımını açıklar. Tümör ayrılma ve luciferase hücrelerinin etiketleme için önceden hazırlanmış ticari kitleri mevcuttur. Görüntü Kılavuzu kullanarak hücre süspansiyon enjeksiyon preklinik modellerinin oluşturulması için minimal invaziv ve tekrarlanabilir bir platform sağlar. Bu yöntem, mesane, karaciğer ve pankreas delinmemiş potansiyeline çok sayıda kanser modelleri için örnekli gibi diğer kanserler için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için kullanılmaktadır.

Giriş

Hayvan xenograft modelleri roman antikanser terapiler preklinik çalışmaları için gerekli araçları vardır. Subkutan kanat implantasyon hücrelerinin tümör büyümesini izlemek için bir verimli ve kolay erişilebilir sitesi sağlayan standart fare xenografts güveniyor. Subkutan modelleri¹metastaz potansiyellerini sınırlayabilir tümör özgü biyolojik özellikleri onların eksikliği dezavantajdır. Gibi sınırlamalar tarafından hangi tümör hücreleri metastatik potansiyel²ile ilgili bir microenvironment sağlayan yerel doku sitelerdeki engrafted orthotopic xenografts kullanımı üstesinden vardır. Orthotopic xenograft modelleri orijinal biyolojik özellikleri korumak ve güvenilir modelleri preklinik ilaç bulma^3,4için sağlar. Doku yönetmen implantasyon için kullanılan kanser hücrelerinin kurulan hücre hatları veya hasta kaynaklı hücrelerden hasta tümör vardır. Xenografts kanser hücre satırlarından kurulan hasta türetilmiş xenografts⁵' e göre birincil tümör üzerinden yüksek genetik sapma sergileyebilirler. Bu göz önüne alındığında, hasta kaynaklı orthotopic xenografts kurulması roman tedavi kanser ilaç bulma gelen test etmek için tercih edilen standart haline gelmiştir.

Pediatrik kanser Nöroblastom (NB), orthotopic xenograft modelleri birincil tümör biyolojisi özetlemek ve metastaz yaymak NB^6,7tipik sitelere geliştirmek. NB böbreküstü bezi veya paravertebral sempatik zinciri boyunca gelişir. Orthotopic implantasyonu en yaygın yöntem açık trans-abdominal cerrahi işlemler gerektirir. Tür yöntemler genellikle sıkıcı, yüksek hayvan hastalık ve karmaşık kurtarma dönemleri yoktur. Yüksek çözünürlüklü ultrason son zamanlarda doku yönetmen implantasyonu tümör hücreleri kanser araştırma^8,9için birkaç fare modelleri geliştirilmesi için kullanılmıştır. Güvenilir, tekrarlanabilir, verimli ve güvenli ilgili metastatik tümör xenografts^10,11kurulması için tekniğidir.

Pediatrik kanser xenografts ultrason destekli hedef organ yerelleştirme ve iğne implantasyon hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri tarafından kurulması gösterdiği¹¹olduğunu. Teknik fare böbreküstü bezinin hedef NB için kullanılmıştır. Ewing sarkomu (ES) ağırlıklı olarak uyluk kemiği ve pelvik kemik¹²gibi uzun kemiklerde yaygın olarak görülen bir kemik kanseri var. Olgu sunumları büyüme ağırlıklı olarak kemik kanseri böbrek dokusunda uygulanabilir olup olmadığını belirlemek için bir böbrek alt kapsüler yerde orthotopic implantasyon¹³için seçildi olduğunu göstermiştir. Tümör hücreleri böbrek alt kapsüler hücre implantasyonu spontan Metastazlari ES¹⁴için çalışmaya gelecek vaat eden bir model olarak kullanılmıştır.

Protokol

Tüm iş The University of Michigan Kurumsal değerlendirme Komitesi (HUM 00052430) uygun olarak yapıldığını ve kullanımı ve bakımı hayvanlar (UCUCA) üniversite Komitesi tarafından onaylanmış yordamlar için uygundur. Birim için laboratuvar, hayvan Tıp (ULAM) hayvan bakımı konusunda çalışmalar yaptı.

Tüm çalışma onayı ile University of Michigan kurumsal İnceleme Kurulu (HUM 00052430) yapıldı ve bütün insan Araştırma Etik Komitesi düzenlemeler için uygundur. İnsan hücreleri potansiyel biyolojik bir malzeme olması, bu yüzden tüm özel önlemler ve kurum tarafından gerekli uygun Biyogüvenlik uygulamaları takip için kabul edilir. NSG fareler ağır immün ve yaygın ortamda bulunan bakteriler neden hastalığa duyarlı değildir.
Her zaman sıkı steril tekniği malzeme implantasyon ve enjeksiyonları gerçekleştirmek için hazırlanırken kullanın.

1. hücre kültürü

1. Kurulan insan NB hücre hatları (SH-SY5Y, SK-N-BE2 ve IMR32) en az gerekli ortamı, büyümek % 10 fetal Sığır serum, 2 mM glutamin, 100 adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiştir. IMR32 hücreleri daha fazla 1 mM pyruvate ve %0.075 NaHCO₃ek. 37 ° C, % 5 CO₂ ve % 70-80 izdiham_. tüm hücreleri korumak
2. İnsan ES Hücre hatlarında (TC32, A673, CHLA-25 ve A4573) RPMI orta % 10 fetal Sığır serum ve 6 mM L-glutamin ile desteklenmiş büyümek. 37 ° c, % 5 CO_%2 70-80 izdiham_. , tüm hücreleri korumak
3. Kimlik doğrulama için tüm hücre satırlarını göndermek.
   Not: Bir dış tesisinde hücre kimlik doğrulaması yapılır, bildirimleri için bakınız.

2. birincil hasta kaynaklı tümör hücreleri hazırlanması

1. Hasta izni ve onayı ile hasat insan NB tümör dokusu yerel kontrol ve koruma için doku depolama çözümü laboratuvarda ulaşım için cerrahi rezeksiyon geçiren hastaların atılır.
   Not: Tüm hasta numuneleri de-tespit ve Kurumsal değerlendirme komitesi kılavuzlarınıza uygun olarak ele.
2. Bir tek hasta kaynaklı kanser hücre süspansiyon (UMNBL001, UMNBL002) bir tümör ayrılma kit kullanarak tümör doku oluşturmak. Tümör yaklaşık 0,5 g 5 mL RPMI arabellek, enzim H, enzim R 100 µL 200 µL ve 25 de içeren bir 100 mm hücre kültür yemek için aktarım µL enzim A insan tümör ayrılma Takımı'ndan.
3. Küçük parçalar halinde (2-4 mm her) tümör kıyma makas ve doku forseps kullanarak. Bu parçaları adım 2.2 çözümlerinde karıştırın.
4. Dissociator tüp içine tümör karışımı pipette ve tüp kapatın. Tüp ters çevir ve doku dissociator kol ekleyin. Program h_tumor_01 üzerinde çalıştırın.
5. Aralıklı toz her 15 dk ile dönen bir raf üzerinde 1 h için 37 ° C'de yukarıda elde tümör hücre süspansiyon kuluçkaya.
6. Hücre süspansiyon için yeni 50 mL konik tüp aktarmak ve RPMI 10 mL ekleyin. Hücre süspansiyon vasıl 314 x g 5 dk santrifüj kapasitesi.
7. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 5 mL RPMI askıya alma. Bu çözüm 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve gergin çözüm taze 50 mL konik tüp içine toplamak. Bu süzgeç bir kez 5 mL RPMI medya ile yıkayın ve bir Pelet toplamak 5 min için 314 x g karisimin santrifüj kapasitesi.
8. Hemacytometer¹⁵kullanarak hücre yoğunluğu ölçmek. Yukarıdan RPMI içinde 4 × 10⁵ hücreleri/10 µL son bir konsantrasyon elde etmek için elde edilen Pelet askıya alma. Bu hücre süspansiyon 5 µL alıp her enjeksiyon için hücre çözümü 10 µL yapmak için matrigel 5 µL.
   Not: Hücre yoğunluğu ölçüm üzerinde kullanılan RPMI bağlıdır. Örneğin, elde edilen Pelet ölçülen hücre yoğunluğu 4 x 10⁵ hücreleri ise, Pelet RPMI 10 µL içinde askıya.

3. luciferase kanser hücrelerinin etiketleme

1. 10 mL 5 mL de viral süpernatant EF1a-Luc2-DDE'ler-mCherry ve kök hücre medya 5 mL ile iletim ortamının olun. 1 x polybrene 7.5 µL ekleyin.
2. 5 × 10⁶ kanser hücreleri iletim medya ve plaka 100 mm Ultra düşük ek plaka karıştırın. 37 ° C ve % 5 CO₂ adlı gecede kuluçkaya.
   Not: düşük ek plakaları kullanılan olarak hücreleri plaka için uygun olmaz.
3. 24 saat sonra doku kültürü başlık altında hücreleri içeren 100 mm tabak getir ve karışımı 15 mL konik tüp içine aktarın. Hücre süspansiyon hücre pelet almak 5 min için 314 x g, santrifüj kapasitesi. Bir kez 1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile hücre Pelet yıkama ve hücre pelet 1 mL % 1 fetal Sığır serum (FBS) içeren HBSS askıya alma.
   1. Luciferase hücreleri floresan aktif hücre (FACS) analiz sıralama GFP pozitif sinyal dayalı sıralama. 100 mm doku kültürü tedavi sıralanmış hücrelerdeyse çanağı ve % 70-80 izdiham, 37 ° C ve gerekli kadar % 5 CO₂ korumak plaka.
4. Luciferase sinyal luciferase tahlil kiti ile onaylayın. Bir illuminometer uyumlu 96 bir kuyu başına plaka 10 x 10⁴ sıralı hücre plaka iyi ve hücreleri gecede saat 37 ° C ve % 5 CO₂kuluçkaya. 24 saat sonra 96 iyi plaka oda sıcaklığına getirmek ve sabit-Glo reaktif Wells 1:1 oranında kültürlü medya ekleyin. Hücreleri 5 min için koşullar ve ışıldama spektrofotometre içinde okumak için izin.
5. 100 mm çanak doku kültürü başlık altında getir. Süpernatant medya atmak. Hücreler 2 mL 1 x PBS ile yıkayın.
6. 2 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve 100 mm bulaşık kuluçka makinesi 2-3 dakika için geri dönün. 2-3 dk sonra mikroskop altında yerinden çıkar hücreleri denetleyin ve tripsin devre dışı bırakmak için RPMI 8 mL ekleyin.
7. 15 mL konik tüp ve santrifüj 314 x g bir pelet almak 5 min için de hücre süspansiyon toplamak. Süpernatant atmak. 1 mL 1 x PBS ile hücre Pelet yıkama, Pelet 5 mL RPMI askıya alma ve hemacytometer¹⁵kullanarak hücre yoğunluğu belirlemek. Hücre çözümü 314 x g bir Pelet elde etmek 5 min için de kalan yhe santrifüj kapasitesi.
8. Pelet 4 x 10⁵ hücreleri/10 µL bir konsantrasyon elde etmek için RPMI içinde askıya alma. Hücre süspansiyon 5 µL alıp her enjeksiyon için hücre çözümü 10 µL yapmak için matrigel 5 µL.

4. böbrek üstü bezi (NB) veya böbrek alt Kapsülü (ES) implantasyon ultrason destekli

Not: Tüm ultrason yordamları kullanarak görüntüleme sistemi bir yüksek çözünürlüklü vivo içinde gerçekleştirilir. Açıklanan yordamları için 40 MHz merkezi sıklığını ve 22-55 MHz bant genişliği vardır dönüştürücü kullanıldı.

1. 6-8-hafta-yaşlı bağışıklık eksikliği NSG fareler tüm enjeksiyon yordamları için kullanmaktadır.
2. Matrigel ve autoclaved Hamilton şırınga 27 G iğne ile (1,25") ile donatılmış ve 22G kateterler (0.9 mm dış çapı, 25 mm uzunluk) 4 ° C'de gece
3. Adım 3 buz üzerinde hazırlanan hücre çözümü yerleştirin.
4. 2 L/dak teslim O_%2 2 isoflurane kullanılarak bir indüksiyon odası farelerde anestezi.
   Not: Yeterli anestezi etkin hareket eksikliği ve spontan solunum Bakımı ile belirlenir.
5. Bir kez anestezi, sırt ve kanat saç Temizleme losyonu (örneğin Nair) ve bir tıraş makinesi kullanarak hayvanların depilate.
6. Hayvan görüntüleme platformu ile karın yan aşağı, burada hayvan burun bir nosecone yerleştirilir ve isoflurane teneffüs edilmesi sırasında güvenli aktarın.
7. Optik merhem kurutma önlemek için hayvanın gözlerinin içine yerleştirin. Fare yerine yanlışlıkla herhangi bir hareketi engellemek için teyp.
8. Fare karaciğer, vena cava, dalak, sol böbrek ve bitişik sol böbreküstü bezi ultrason görselleştirme kullanarak tanımlayın.
9. Steril eldiven, maske ve kap kişisel koruma ve bakım Steril koşullar için kullanın. Ultrason rehberliği altında yavaşça deri yoluyla 22 G kateter takın ve hücresel enjeksiyon için bir kanal sağlamak için sol böbreküstü bezi içine doğrudan kas geri. İğneyi çıkarın ve kateter yerde bırakın.
10. Yük bir soğutulmuş Hamilton şırınga hücre çözümü 10 µL ile küçük bir iğne ile donatılmış, sonra şırınga stereotactically böbreküstü bezi ortasına konumlandırılmış kateter aracılığıyla rehberlik.
11. Hücreleri hedeflenen adrenal dokusu içine enjekte. İğne matrigel ayarlamak izin vermek 1-2 min için bir yerde bırakın. Yavaş yavaş iğne kateterin kaldırma tarafından takip, kaldırın.
12. Fareler onların kafes yerleştirin ve fare sternal recumbency korumak için yeterli bilincinin tekrar yerine geleceğinden emin olun.
    Not: Bu teknik minimal invaziv doğası gereği, en az, ama hala günlük ile fareler sağlık kontrolleri. izlenen sonrası yordam ağrı "bir cümle ile takip edilmelidir:"beklenmeyen belirtileri ağrı veya acı sırasında belirlenen Eğer bir deney, senin hayvan hastalıklarıyla ilgili kurumsal destek birimi analjezi veya diğer tıbbi bakım ile ilgili bilgi için başvurun.
    

Sonuçlar

Sunulan yordamları kullanarak, ultrason destekli implantasyon NB hücrelerinin böbrek üstü bezi içine ısıtılmış bir cerrahi tablo ile donatılmış bir özel yordamın Oda yapıldı. Kol ve ayak pedleri fare kalp etkinlik (Şekil 1A) izlemek için yerleştirildi. Hayvan imzalat burun konisi inhalasyon kullanarak isoflurane altında kaldı. Bir yüksek çözünürlüklü ultrason sonda kullanarak, sol böbrek böbrek (Şekil 1B

Tartışmalar

Ultrason destekli implantasyon NB ve ES hücre kanser biyolojide preklinik çalışmaları için güvenilir fare xenografts kurmak için verimli ve güvenli bir yöntemdir. Ultrason destekli başarısı için kritik doku hedefli implantasyon varlığı ve uzmanlık anatomik olarak faiz organı yerelleştirme ve tümör hücrelerinin stereotaksik enjeksiyon ile eğitimli personel durumu olduğunu.

Tümör dokusunun ayrılma açıklanan hasta kaynaklı xenograft modeli geliştirmek çok önemli ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G