초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

요약

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초록

항 암 치료의 임상 시험 관련이 종이 식 모델을 암의 타고 난 경향을 모방에 의존 합니다. 표준 피하 측면 모델의 장점 절차 간편 하 고 모니터 종양 진행과 침략 적 영상 없이 응답 하는 기능을 포함합니다. 이러한 모델 자주 변환 임상 시험에서 일치 하지 않는 고 네이티브 microenvironment의 부족으로 전이 생산 하기 위해 낮은 경향으로 생물학으로 관련 된 특성을 제한 했다. 비교에서는, 기본 종양 사이트에서 orthotopic이 종이 식 모델 종양 microenvironment를 모방 하 여 먼 전이성 확산 등 중요 한 질병 특성을 복제 표시 되었습니다. 이러한 모델은 종종 지루한 수술 연장된 마 취 시간 및 회복 기간을 필요합니다. 이 해결 하기 위해 암 연구자는 최근 조직 감독 murine 모델의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 설립에 대 한 수 있는 전 임상 실험에 대 한 암이 종이 식 모델 확립을 초음파 유도 주입 기술을 활용 하 고. 초음파 시각화는 또한 종양 engraftment 성장과의 경도 평가 대 한 비 침범 성 방법을 제공 한다. 여기, 우리는 ES에 대 한 주 및 신장이 캡슐에 아드레날린 선의 활용 암 세포의 주입 초음파 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 최소한 침략 적 접근 암 세포 성장 및 전이, 조직 특정 위치에서의 지루한 오픈 수술 주입을 극복 하 고 병 적인 복구 기간 상거래. 우리가 설립된 셀 라인과 orthotopic 주입에 대 한 환자 파생된 셀 라인의 사용률을 설명합니다. 미리 만든된 상업 키트 종양 분리 및 luciferase 셀의 태그에 대 한 사용할 수 있습니다. 이미지 지도 사용 하 여 세포 현 탁 액의 주입 전 임상 모델의 생성에 대 한 최소한 침략 적 하 고 재현 가능한 플랫폼을 제공 합니다. 이 메서드는 방광, 간, 췌 장 수많은 암 모델에 대 한 미 개발된 잠재력을 예증 등 다른 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 데 이용 된다.

서문

동물이 종이 식 모델은 새로운 항 암 제 치료의 전 임상 연구를 위한 필수적인 도구입니다. 표준 murine xenografts 종양 성장 모니터링에 대 한 효율적이 고 쉽게 접근할 수 있는 사이트를 제공 하는 셀의 측면은 피하 주입에 의존 합니다. 피하 모델의 단점은¹전이를 그들의 잠재력을 제한 수 있습니다 종양 특정 생물 학적 특성의 그들의 부족. 이러한 한계는 종양에서 세포는 전이성 잠재적인²관련 microenvironment를 제공 하는 기본 조직 위치에 engrafted orthotopic xenografts 사용 하 여 극복 됩니다. Orthotopic이 종이 식 모델 원래 생물 학적 기능을 유지 하 고 전 임상 약 발견^3,4에 대 한 신뢰할 수 있는 모델을 제공. 암 세포 이식 조직 감독에 대 한 활용은 설립된 셀 라인 또는 환자 종양에서 환자에서 파생 된 셀입니다. 암 세포 선에서 설립 xenografts 환자 파생된 xenografts⁵에 비해 기본 종양에서 높은 유전 분기를 전시 수 있습니다. 이 감안할 때, 환자 파생 orthotopic xenografts 설립 암 약물 발견에 새로운 치료제를 테스트 하기 위한 기본 표준 되고있다.

소아 암 신경 (NB)에서 orthotopic이 종이 식 모델 기본 종양 생물학을 정리 하 고 전이 확산 주의^6,7의 일반적인 사이트를 개발. NB은 아드레날린 선 또는 paravertebral 공감 체인을 개발 하고있다. Orthotopic 이식의 가장 일반적인 방법은 오픈 트랜스-복 부 수술 절차를 필요로합니다. 이러한 메서드는 종종 지루한, 높은 동물 사망률, 그리고 복잡 한 복구 기간. 고해상도 초음파 암 연구^8,9에 대 한 몇 가지 murine 모델의 개발에 종양 세포의 식을 조직 감독에 대 한 최근 이용 되어 있다. 기술은 재현, 효율적, 안정적이 고 관련 전이성 종양 xenografts^10,11의 설립에 대 한 안전입니다.

소아 암 xenografts 세포 선 및 환자 파생 된 종양 세포의 초음파 기반 대상 기관 현지화 및 바늘 주입에 의해의 설립 시연된¹¹입니다. NB murine 아드레날린 선에 대상에 대 한 기술은 이용 되었다. Ewing의 육 종 (ES)은 주로 대 퇴 골과 골반 뼈¹²등 긴 뼈에서 일반적으로 볼 수는 뼈가 있는 암 이다. 사건 보고서는 주로 뼈가 있는 암 성장 신장 조직에서 가능 여부 확인, 하 신장 하위 capsular 위치 선정 되었다 orthotopic 이식¹³나타났습니다. 종양 세포의 신장 하위 capsular 세포 이식 ES¹⁴에 대 한 자연 스러운 전이 공부 하는 유망 모델으로 활용 되었습니다.

프로토콜

모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에 따라 수행 되었다 사용과 관리의 동물 (UCUCA)에 대학 위원회에 의해 승인 하는 절차를 따릅니다. 단위에 대 한 실험실의 동물 의학 (ULAM) 동물 보호를 만들었다.

모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에서 승인 되었으며 모든 인간의 연구 윤리 위원회 규정에 따른다. 인간의 세포는 잠재적으로 유해 물질, 그래서 모든 특별 한 예방 조치 및 해당 교육 기관에 필요한 적절 한 biosafety 관행에 따라 간주 됩니다. NSG 마우스는 심하게 immunocompromised 그리고 환경에서 일반적으로 발견 되는 박테리아에 의해 발생 하는 질병에 취약.
이식 하 고 주사를 수행에 대 한 자료를 준비할 때 항상 엄격한 무 균 기술을 사용 합니다.

1. 세포 배양

1. 최소한의 필수적인 매체 설립된 인간의 NB 셀 라인 (SH-SY5Y, SK-N-BE2, 및 IMR32)을 성장 10% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μ g/mL 스 보완. 1 mM pyruvate와 0.075% NaHCO₃IMR32 셀 추가 보충. 37 ° C, 5% CO₂ , 70-80% 합류_. 에서 모든 셀을 유지
2. 인간의 ES 세포 선 (TC32, A673, CHLA-25, A4573) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 6 mM L-글루타민 보충 RPMI 매체에 성장. 37 ° C, 5% CO₂ 70-80% 합류_. 에서 모든 셀을 유지
3. 인증에 대 한 모든 셀 라인을 보냅니다.
   참고: 셀 인증 외부 시설에서 이루어집니다, 그리고 승인을 참조 하십시오.

2. 기본 환자 파생 된 종양 세포의 준비

1. 환자 동의와 동의 수확 로컬 제어 및 보존을 위한 조직 스토리지 솔루션에 실험실에 수송을 위한 외과 절제술을 받은 환자에서 인간의 NB 종양 조직 삭제.
   참고: 모든 환자 샘플은 드 식별 및 기관 검토 위원회 지침에 따라 처리.
2. 종양 조직 종양 분리 키트를 사용 하 여에서 한 단일 환자 유래 암 세포 현 탁 액 (UMNBL001, UMNBL002)를 생성 합니다. 포함 된 RPMI 버퍼, 효소의 효소 R 100 µ L H의 200 µ L 및 25의 5 mL 100 mm 셀 문화 접시에 종양의 약 0.5 g을 전송 인간의 종양 분리 키트에서 효소 A의 µ L.
3. 작은 조각 (2-4 m m 각)으로 종양을 말하다가 위 및 조직 집게를 사용 하 여. 2.2 단계에서 솔루션이 파편을 믹스.
4. Dissociator 튜브로 종양 혼합 플라스틱 고 튜브를 닫습니다. 튜브를 반전 하 고 조직 dissociator의 소매에 연결 합니다. 프로그램 h_tumor_01에서 실행 합니다.
5. 간헐적인 분쇄 15 분 마다와 회전 선반에 1 시간 동안 37 ° C에 위에서 얻은 종양 세포 현 탁 액을 품 어.
6. 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 RPMI의 10 mL를 추가 합니다. 셀 서 스 펜 션 5 분 314 x g에서 원심
7. 제거는 상쾌한 고 RPMI의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해이 솔루션을 전달 하 고 신선한 50 mL 원뿔 튜브로 긴장된 솔루션을 수집 합니다. 이 여과기 RPMI 미디어의 5 mL로 한번 세척 하 고 5 분 펠 릿 수집 314 x g에서 혼합물을 원심.
8. Hemacytometer¹⁵를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다. 4 × 10⁵ 셀/10 µ L의 최종 농도를 RPMI에 위에서 얻은 펠 릿을 일시 중단 합니다. 이 세포 현 탁 액의 5 µ L 10 µ L의 각 주입에 대 한 셀 솔루션을 만들기 위해 matrigel의 5 µ L을가지고.
   참고: 사용 RPMI 양의 셀 밀도 측정에 따라 달라 집니다. 예를 들어 얻은 펠 릿의 측정된 셀 밀도 4 x 10⁵ 셀 이면 RPMI의 10 µ L에 펠 릿을 일시 중단.

3. luciferase 암 세포의 태그

1. 변환 미디어 바이러스 표면에 뜨는 EF1a-Luc2-IRES-mCherry의 5 mL 및 줄기 세포 미디어의 5 mL와 10 mL을 확인 합니다. 1 x polybrene의 7.5 µ L를 추가 합니다.
2. 5 × 10⁶ 암 세포 변환 미디어 믹스 100 m m의 매우 낮은 첨부 접시에 접시. 37 ° C, 5% CO₂ 에서 밤새 품 어.
   참고: 낮은 부착 판 사용, 셀 접시에 준수 하지 것 이다.
3. 후 24 h, 포함 하는 조직 문화 후드 셀 100 mm 접시 가져오고 15 mL 원뿔 튜브로 혼합물을 전송. 세포 현 탁 액 셀 펠 릿을 5 분 동안 314 x g에서 원심 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1 mL와 함께 한 번 셀 펠 릿을 세척 하 고 HBSS 1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.
   1. Luciferase 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 분석에 GFP-긍정적인 신호에 따라 정렬 합니다. 플레이트 100 m m 조직 문화 취급에 정렬된 셀 접시와 70-80% 합류, 37 ° C와 5% CO₂ 필요할 때까지 유지.
4. Luciferase 분석 결과 키트 luciferase 신호를 확인 합니다. 당 illuminometer 호환 96 잘 접시 10 x 10⁴ 정렬 셀 접시 고 37 ° C, 5% CO₂에서 하룻밤 셀을 품 어. 24 시간 후 실내 온도에 96 잘 접시를 가져올 하 고 1:1 비율로 스 교양된 미디어 안정-저런 형광 시 약 추가. 5 분 동안 lyse 세포 발광 분 광 광도 계에서 읽을 수 있습니다.
5. 조직 문화 후드 100 mm 접시를 가져. 표면에 뜨는 미디어를 삭제 합니다. 1 x PBS의 2 개 mL를 한번 셀을 씻어.
6. 0.25 %trypsin 2 개 mL를 추가 하 고 2-3 분 인큐베이터를 100 mm 접시를 반환 합니다. 2-3 분 후 현미경 빠질된 셀에 대 한 확인 하 고 비활성화 trypsin RPMI의 8 mL를 추가 합니다.
7. 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브에 펠 릿을 5 분 동안 314 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다. 폐기는 상쾌한. 1 x PBS의 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척, RPMI의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단 하 고 hemacytometer¹⁵를 사용 하 여 셀 밀도 결정 합니다. Yhe 314 x g는 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안에 전지 솔루션 남은 원심
8. 4 x 10⁵ 셀/10 µ L의 농도를 RPMI에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 세포 현 탁 액의 5 µ L 10 µ L의 각 주입에 대 한 셀 솔루션을 만들기 위해 matrigel의 5 µ L을가지고.

4. 초음파 유도 아드레날린 선 (NB) 또는 신장 하위 캡슐 (ES) 이식

참고: 모든 초음파 절차는 높은 해상도 vivo에서 이미징 시스템을 사용 하 여 수행 됩니다. 설명 된 절차에 대 한 변환기를 40 m h z의 중심 주파수와 22-55 MHz의 대역폭 사용 되었다.

1. 6 8 주 오래 된 면역 결핍 NSG 쥐 모든 주입 절차를 활용 합니다.
2. 진정 matrigel 및 압력가 해밀턴 주사기 27 G 바늘 (1.25"), 장착 및 22 G 카 (0.9 m m 외부 직경, 25 m m 길이) 4 ° c.에서 하룻밤
3. 장소 준비 얼음에 3 단계에서 셀 솔루션.
4. O₂ 2 L/min에서 isoflurane 2%를 사용 하 여 유도 챔버에서 마우스 anesthetize
   참고: 적절 한 마 취는 활성 운동 부족과 자발적인 호흡의 유지 보수와 함께 결정 됩니다.
5. 일단 마 취, depilate 뒤 및 머리 제거 로션 (예: Nair)는 면도기를 사용 하 여 동물의 측면.
6. 전송 동물 복 부 측면과 이미징 플랫폼, 동물의 코는 nosecone에 배치 하 고 isoflurane 흡입 하는 동안 보안은.
7. 건조를 방지 하기 위해 동물의 눈에 광 연 고를 배치 합니다. 실수로 움직임을 방지 하기 위해에서 마우스를 테이프.
8. Murine 간, 베 나 정 맥, 비장, 왼쪽된 신장, 및 인접 한 왼쪽된 부 신 동맥 초음파 시각화를 사용 하 여 식별 합니다.
9. 멸 균 장갑, 마스크와 모자를 사용 하 여 개인 보호 및 살 균 조건의 유지 보수에 대 한. 초음파-가이드에서 부드럽게 피부를 통해 22 G 카 테 터를 삽입 하 고 다시 근육 세포 주입을 위한 채널을 제공 하도록 왼쪽된 부 신 동맥에 직접. 바늘을 제거 하 고 장소에 테를 떠나.
10. 부하 냉장된 해밀턴 주사기 작은-내경 바늘 10 µ L 셀 솔루션의와 함께 장착 후 부 신 동맥의 중심에 위치 하는 카 테 터를 통해 stereotactically 주사기를 안내.
11. 대상된 부 신 조직으로 세포를 주사. 바늘 matrigel 설정할 수 있도록 1-2 분을 위한 장소에 둡니다. 천천히 바늘, 카 테 터 제거 다음 제거 합니다.
12. 다시 그들의 감 금 소에 쥐를 놓고 마우스 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복을 보장 합니다.
    참고:이 기법은 최소한 침략 적 특성상 포스트 절차 통증은 최소한의 하지만 여전히 쥐 건강 검사. 매일 모니터링 "는 문장으로 지켜져야 한다:"만약 통증이 나 조 난의 예기치 않은 징후는 과정에서 확인 된 실험의 진통 또는 다른 의료 서비스에 대 한 정보 기관 수의 지원 단위와 상의 하십시오.
    

결과

제시 하는 절차를 사용 하 여, 초음파 유도 주입 주의 세포의 아드레날린 선으로 온수 수술 테이블을 갖춘 전용된 프로시저 룸에서 이루어졌다. 팔과 발 패드 murine 심장 활동 (그림 1A)를 모니터링 하기 위한 배치 했다. 동물 마 취 isoflurane 원뿔 흡입을 사용 하 여 아래에 남아 있었다. 고해상도 초음파 프로브를 사용 하 여 왼쪽된 신장 신장 (

토론

NB 및 ES 세포의 주입 초음파 기반 암 생물학에서 전 임상 연구에 대 한 안정적인 murine xenografts를 설정 하는 효율적이 고 안전한 방법입니다. 초음파 유도의 성공에 중요 한 조직 대상으로 이식 존재와 해부학 관심의 기관 현지화 및 종양 세포의 정위 적 주사에 전문성을 갖춘 훈련 된 인원의 가용성 이다.

종양 조직의 분리 설명된 환자 파생이 종이 식 모델을 개발 하는 중요 한 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G