Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo utilizar injeção guiada por ultra-som de neuroblastoma (NB) e células (ES) de sarcoma de Ewing (estabeleceu linhas celulares e células tumorais do paciente-derivado) biologicamente relevantes locais para criar modelos pré-clínicos confiáveis para câncer pesquisa.

Resumo

Testes pré-clínicos de terapias anticâncer baseia-se em modelos de xenoenxertos relevantes que imitam as tendências inatas de câncer. Vantagens dos modelos padrão flanco subcutânea incluem facilidade processual e a capacidade de resposta sem imagens invasivas e progressão do tumor do monitor. Tais modelos são muitas vezes inconsistentes em ensaios clínicos translacionais e limitaram características biologicamente relevantes com baixa propensão para produzir metástase, como há uma falta de um microambiente nativo. Em comparação, modelos de transplante ortotópico em localizações tumorais nativos foram mostrados para imitar o microambiente do tumor e replicar características importantes doenças tais como a propagação metastática distante. Estes modelos geralmente exigem procedimentos cirúrgicos tediosos com períodos prolongados de tempo e recuperação anestésicos. Para resolver isso, pesquisadores de câncer recentemente tem utilizado técnicas de injeção guiada por ultra-som para estabelecer modelos de enxerto heterólogo câncer para experimentos pré-clínicos, que permite a criação rápida e fiável de modelos murino tecido-dirigido. Visualização de ultra-som também fornece um método não invasivo para avaliação longitudinal da enxertia de tumor e crescimento. Aqui, descrevemos o método de injeção guiada por ultra-som de células de câncer, utilizando a glândula adrenal para NB e cápsula renal sub para ES. Esta abordagem minimamente invasiva supera a implantação de cirurgia aberta tedioso de células cancerosas em locais específicos do tecido para o crescimento e a metástase e períodos de recuperação mórbida de abates. Descrevemos a utilização de linhagens celulares estabelecidas e de linhas de células derivadas paciente ortotópico injectável. Pre-feitos jogos comerciais estão disponíveis para dissociação de tumor e de luciferase marcação de células. Injeção da suspensão de células usando imagem-orientação fornece uma plataforma minimamente invasiva e pode ser reproduzida para a criação de modelos pré-clínicos. Este método é utilizado para criar modelos pré-clínicos confiáveis para outros tipos de câncer como bexiga, fígado e pâncreas, exemplificando seu potencial inexplorado de numerosos modelos de câncer.

Introdução

Modelos animais xenoenxertos são ferramentas essenciais para estudos pré-clínicos de romance terapias anticâncer. Xenografts murino padrão dependem de implantação subcutânea de flanco das células, fornecendo um local facilmente acessível e eficiente para monitorar o crescimento do tumor. A desvantagem dos modelos subcutâneos é a falta de características biológicas específicas do tumor, que pode limitar seu potencial de metástase¹. Tais limitações são superadas pelo uso de xenografts ortotópico no qual tumor células estão incorporadas nos sítios de tecidos nativos, proporcionando um microambiente relevante com potencial metastático². Modelos de transplante ortotópico mantêm características biológicas originais e fornecem modelos de confiança para descoberta de drogas pré-clínicos^3,4. As células cancerosas utilizadas para implantação de tecido-dirigido são linhagens celulares estabelecidas ou paciente-derivado de células de tumores de pacientes. Xenografts estabelecidos de linhas de células de câncer podem apresentar alta divergência genética do tumor primário em relação ao paciente xenografts derivada⁵. Diante disso, o estabelecimento de paciente-derivado ortotópico xenografts tornou-se o padrão preferencial para teste novela terapêutica na descoberta da droga de cancro.

No neuroblastoma de câncer pediátrico (NB), modelos de transplante ortotópico recapitular a biologia do tumor primário em desenvolvem metástases para locais típicos de NB espalhar^6,7. NB se desenvolve na glândula adrenal ou ao longo da cadeia simpática paravertebral. Os métodos mais comuns de implantação ortotópico requerem procedimentos cirúrgicos trans-abdominal abertos. Tais métodos são muitas vezes tediosos, têm alta taxa de mortalidade animal e períodos de recuperação complexa. Ultra-som de alta resolução tem sido recentemente utilizada para tecido-dirigido a implantação de células tumorais no desenvolvimento de vários modelos de murino para câncer pesquisa^8,9. A técnica é confiável, pode ser reproduzido, eficiente e segura para o estabelecimento de tumor metastático relevantes xenografts^10,11.

O estabelecimento de xenografts câncer pediátrico por alvo guiada por ultra-som órgão localização e agulha implantação de linhas de células e células tumorais do paciente-derivado é demonstrada¹¹. A técnica foi utilizada para NB direcionado para a glândula adrenal murino. Sarcoma de Ewing (ES) é predominantemente um câncer ósseo, comumente visto em ossos longos como fêmur e ossos pélvicos¹². Relatos de casos têm demonstrado que, para determinar se o crescimento de um câncer ósseo predominantemente é viável no tecido renal, uma localização capsular sub renal foi escolhida para ortotópico implantação¹³. Implantação de célula capsular sub renal de células do tumor tem sido utilizada como um modelo promissor para estudar metástases espontâneas para ES¹⁴.

Protocolo

Todo o trabalho foi feito de acordo com o Conselho de revisão institucional da Universidade de Michigan (HUM 00052430) e está de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de Universidade no uso e cuidado dos animais (UCUCA). A unidade para o laboratório de medicina Animal (ULAM) supervisionou cuidados com animais.

Todo o trabalho foi feito com a aprovação do Conselho de revisão institucional da Universidade de Michigan (HUM 00052430) e está em conformidade com todos os regulamentos de Comitê de ética de pesquisa humana. As células humanas são consideradas para ser um material potencialmente de risco biológico, então siga todas as precauções especiais e práticas apropriadas de biossegurança exigidos pela sua instituição. NSG ratos são severamente imunocomprometidos e suscetíveis a doenças causadas por bactérias comumente encontradas no ambiente.
Sempre use técnica asséptica rigorosa quando preparar materiais para implantação e realizar as injeções.

1. cultura de pilha

1. Crescer estabelecida humana NB linhas celulares (SH-SY5Y, SK-N-BE2 e IMR32) em meio essencial mínimo, suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina 100 de μg/mL. Suplemento IMR32 células ainda mais com 1 mM piruvato e 0,075% NaHCO₃. Manter todas as células em 37 ° C, 5% de CO₂ e confluência de 70-80%_.
2. Cresce humano ES linhas celulares (TC32, A673, CHLA-25 e A4573) em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino e 6 mM L-glutamina. Manter todas as células a 37 ° C, 5% de CO₂ na confluência de 70-80%_.
3. Envie todas as linhas de célula para autenticação.
   Nota: A célula autenticação é feita em uma instalação externa, consulte reconhecimentos.

2. preparação de células de Tumor primário do paciente-derivado

1. Com o consentimento do paciente e o parecer favorável, colheita descartados NB tumor tecido humano de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica para controle local e transporte para o laboratório em solução de armazenamento de tecido para preservação.
   Nota: Todas as amostras são de identificados e tratadas em conformidade com as diretrizes do Conselho de revisão institucional.
2. Gere uma suspensão de células de câncer único paciente-derivado (UMNBL001, UMNBL002) do tecido do tumor usando um kit de dissociação do tumor. Transferência de cerca de 0,5 g de tumor para um prato de cultura de célula 100mm contendo 5 mL de tampão RPMI, 200 µ l da enzima H, 100 µ l de enzima R e 25 µ l da enzima A partir do kit de dissociação de tumor humano.
3. Picar o tumor em pedaços pequenos (2-4 mm cada) usando uma tesoura e pinça de tecido. Estes fragmentos se misturam com as soluções no passo 2.2.
4. Pipetar a mistura de tumor em um tubo de dissociador e fechar o tubo. Inverter o tubo e instale no manga do dissociador do tecido. Execute no programa h_tumor_01.
5. Incube a suspensão de células de tumor obtida acima a 37 ° C por 1h em uma cremalheira de giro com trituração intermitente cada 15 min.
6. A suspensão de células de transferência para um novo tubo cónico de 50 mL e adicionar 10 mL de RPMI. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 314 x g por 5 min.
7. Remover o sobrenadante e suspender o sedimento em 5 mL de RPMI. Passe esta solução através de um filtro de célula de 40 µm e coletar a solução tensa em um tubo de cónico de 50 mL. Lavar o filtro uma vez com 5 mL de mídia RPMI e centrifugar a mistura a 314 x g por 5 min coletar uma pelota.
8. Medir a densidade de células usando um hemacytometer¹⁵. Suspenda o sedimento obtido de cima em RPMI para obter uma concentração final de 4 × 10⁵ células/10 µ l. Pegue 5 µ l da suspensão celular e 5 µ l de matrigel tornar-se 10 µ l de solução de célula para cada injeção.
   Nota: A quantidade de RPMI usado depende da medição de densidade celular. Por exemplo, se a densidade celular medido a pelota obtida é 4 x 10⁵ células, suspenda o sedimento em 10 µ l de RPMI.

3. luciferase de marcação das células cancerosas

1. Fazer 10 mL de mídia de transdução com 5 mL de viral sobrenadante EF1a-Luc2-IRES-mCherry e 5 mL de mídia de células-tronco. Adicione 7,5 µ l de polybrene 1x.
2. Mix 5 × 10⁶ células cancerosas em mídia de transdução e prato em chapa de fixação ultra baixo de 100 mm. Incube a 37 ° C e 5% de CO₂ durante a noite.
   Nota: Como as placas de fixação baixo são usadas, as células não aderirão à placa.
3. Após 24h, trazer a placa de 100 mm, contendo células sob capa de cultura de tecidos e transferir a mistura em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 314 x g por 5 min obter o centrifugado. Lave o centrifugado uma vez com 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x e suspender o centrifugado em 1 mL de HBSS contendo 1% de soro fetal bovino (FBS).
   1. Classificar as células luciferase baseadas no sinal de GFP-positivo na fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS). Chapa classificadas células em cultura de tecidos de 100mm tratados prato e mantêm-se na confluência de 70-80%, a 37 ° C e 5% CO₂ até necessária.
4. Confirme o sinal do luciferase com kit de ensaio do luciferase. Placa 10 x 10⁴ classificados células por poço em um illuminometer compatível 96 bem a placa e incubam as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO₂. Após 24 h, levar a placa bem 96 à temperatura e adicionar Reagente estacionário-Glo a media cultivada em poços na proporção 1:1. Permitir que células lyse por 5 min e ler luminescência em espectrofotômetro.
5. Trazer o prato de 100 mm sob uma capa de cultura de tecidos. Descarte a sobrenadante mídia. Lave as células uma vez com 2 mL de 1X PBS.
6. Adicionar 2 mL de tripsina 0,25% e devolver o prato de 100 mm a incubadora para 2-3 min. Após 2-3 min, verifique desalojadas células sob o microscópio e adicionar 8 mL de RPMI para desactivar a tripsina.
7. Recolha a suspensão de células em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 314 x g por 5 min obter uma pelota. Desprezar o sobrenadante. Lavar o centrifugado com 1 mL de 1X PBS, suspender o sedimento em 5 mL de RPMI e determinar a densidade de células usando um hemacytometer¹⁵. Centrifugue o yhe restante solução de célula a 314 x g por 5 min obter uma pelota.
8. Suspenda o sedimento em RPMI para obter uma concentração de 4 x 10⁵ células/10 µ l. Pegue 5 µ l da suspensão celular e 5 µ l de matrigel tornar-se 10 µ l de solução de célula para cada injeção.

4. ultrasound guiado glândula Adrenal (NB) ou Sub Renal cápsula (ES) de implantação

Nota: Todos os procedimentos de ultra-som são executados usando uma alta resolução na vivo sistema de imagem. Para os procedimentos descritos, utilizou-se o transdutor, que tem uma frequência central de 40 MHz e uma largura de banda de 22-55 MHz.

1. Utilize ratos NSG 6 8-week-old imune deficiente para todos os procedimentos de injeção.
2. Refrigere o matrigel e autoclavadas seringas Hamilton, equipadas com uma agulha 27G (1,25"), e cateteres de 22G (0,9 mm de diâmetro externo, comprimento de 25 mm) durante a noite a 4 ° C.
3. Coloque a solução de célula preparada na etapa 3 no gelo.
4. Anestesia os ratos em uma câmara de indução usando 2% de isoflurano em O₂ entregada a 2 L/min.
   Nota: Anestesia adequada é determinada com a falta de movimento ativo e a manutenção da respiração espontânea.
5. Uma vez anestesiado, depilar as costas e o flanco dos animais usando loção de remoção do cabelo (como Ney) e uma máquina de barbear.
6. Transferi o animal para a plataforma de imagem com o lado abdominal, onde o nariz do animal é colocado em um cone de nariz e garantiu ao inalar isoflurano.
7. Coloque pomada óptica nos olhos do animal para impedir a secagem. Tape o mouse no lugar para impedir qualquer movimento inadvertido.
8. Identifica o fígado murino, veia cava, baço, rim esquerdo e adjacente supra-renal esquerda usando a visualização de ultra-som.
9. Use luvas estéreis, máscara e boné para proteção pessoal e a manutenção de condições estéreis. Sob a orientação de ultra-som, delicadamente inserir um catéter 22g através da pele e músculo de volta diretamente na glândula adrenal esquerda para fornecer um canal para injeção celular. Retire a agulha e deixar o cateter no lugar.
10. Carregar uma seringa Hamilton refrigerada equipado com uma agulha de pequeno calibre com 10 µ l de solução de célula e, em seguida, orientar a seringa Estereotaxia através do cateter posicionado no centro da glândula adrenal.
11. Injete as células do tecido-alvo adrenal. Deixe a agulha no lugar por 1-2 minutos permitir que o matrigel definir. Retire lentamente a agulha, seguida da remoção do cateter.
12. Coloque os ratos na jaula e certifique-se de que o mouse recobra a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
    Nota: devido a natureza esta técnica minimamente invasiva, dor post processual é mínima, mas ainda monitorado em uma base diária com verificações de saúde ratos. "deve ser seguido com uma frase:"se inesperado sinais de dor ou desconforto são identificados durante o curso de um experimento, consulte com o seu aparelho institucional suporte veterinário para obter informações sobre analgesia ou outros cuidados médicos.
    

Resultados

Usando os procedimentos apresentados, guiada por ultra-som implantação de células NB na glândula adrenal foi feita em uma sala de procedimento dedicado equipada com uma mesa cirúrgica aquecida. Almofadas de braço e no pé foram colocadas para monitorar a atividade do coração murino (figura 1A). O animal permaneceu anestesiado com isoflurano usando inalação do cone de nariz. O rim esquerdo usando uma sonda de ultra-som de alta resolução, foi identi...

Discussão

Guiada por ultra-som de implantação de células NB e ES é um método eficiente e seguro para estabelecer confiança xenografts murino para estudos pré-clínicos em biologia do câncer. Críticos para o sucesso de guiada por ultra-som implantação de tecido-alvo é a presença e a disponibilidade de pessoal treinado com conhecimentos especializados em localizar anatomicamente o órgão de interesse e na injeção estereotáxica de células tumorais.

A dissociação do tecido do tumor provo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Established human neuroblastoma cell line
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Established human neuroblastoma cell line
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Established human neuroblastoma cell line
ES
TC32	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A673	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
CHLA-25	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
A4573	COGcell.ORG		Established human Ewing's Sarcoma cell line
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor Dissociation Kit	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
Cell Strainer	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University of Michigan, Vector Core		Luciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Inhaled Isoflurane	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution Imaging	Vevo	2100
Hamilton Syringes (27 gauge needle)	Hamilton	80000
22 Gauge Angiocatheter	BD Biosciences	381423
Optical ointment	Major Pharmaceuticals	301909
Nair	Church & Dwight Co		Hair Removal agent
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel	Parker		Ultrasound gel
Histology
CD99	DAKO	M3601	Primary Antibody
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928	Primary Antibody
Secondary HRP-Polymer antibody	Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1.5 mL Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
P1000 pipette	Eppendorf	3120000062
P200 pipette	Eppendorf	3120000054
P1000 pipette tips	Fisher Scientific	21-375E
P200 pipette tips	Fisher Scientific	21-375D
Portable pipette aid	Drummond	4-000-101
digital animal Weighing Scale	KentScientific	SCL-1015
Calipers	Fisher Scientific	06-664-16
6well low attachment plates	Corning	07-200-601
10 cm Tissue Culture Treated Dishes	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G