Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química

Resumen

Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.

Resumen

La reciente subida de partículas similares a virus (VLPs) en biomédica y la investigación de materiales puede ser atribuido a su facilidad de biodegradabilidad, tamaño discreto, programación genética y biosíntesis. Mientras que son altamente susceptibles a reacciones bioconjugation por adición de ligandos sintéticos en su superficie, la gama en metodologías bioconjugation en estos cápsida nacido acuosa es relativamente limitada. Para facilitar la dirección de investigación de biomateriales funcionales, deben considerarse reacciones bioconjugation no tradicionales. La reacción que se describe en este protocolo utiliza dibromomaleimides para introducir nuevas funcionalidades en el solvente a base de disulfuro expuesta de una VLP al bacteriófago Qβ. Además, el producto final es fluorescente, que tiene la ventaja de generar una sonda rastreables en vitro usando un conjunto de filtros comercialmente disponibles.

Introducción

Utilizando nanopartículas de cápsida viral ha surgido como un campo interesante, que pretende ampliar el alcance de las aplicaciones en investigación biomédica^1,2,3. Por vía recombinante expresadas virus-como partículas (VLPs) son estructuralmente derivadas de virus, pero tienen el material genético viral original haciendo que no infecciosas proteináceas nanopartículas. Como las características superficiales están genéticamente programadas y cada cápside se expresa idénticamente a los antes y después de él, es posible conocer la ubicación y el número de cadenas laterales reactivas de los aminoácidos con precisión atomística. En muchos casos, las superficies exteriores e interiores poseen muchos tipos de residuos de solvente aminoácidos expuesta, que factible pueden ser funcionalizados a través bioconjugation reacciones - reacciones que forman enlaces covalentes entre una biomolécula y sintéticos molécula de^4,5.

Reacciones bioconjugation ayudan biomoléculas de interés tienen funcionalidades más diversas de una manera relativamente sencilla. Moléculas de interés, como drogas terapéuticas⁶, etiquetas fluorescentes⁷ y polímeros^8,9 pueden ser previamente sintetizadas y caracterizadas antes de que se colocan en la superficie de VLPs. Una VLP particularmente común en biomédica y la investigación de biomateriales ha sido la VLP basado en bacteriófago Qβ, que, como expresa por vía recombinante, es un 28 nm cápside viral icosaédrica¹⁰. Los sitios más comunes de la reacción en Qβ son lisinas por un amplio margen, aunque recientemente hemos comunicado verbal exitosa¹¹ de dibromomaleimide compuestos a los disulfuros reducidos que los poros de Qβ vía una reacción Haddleton-Baker. La reacción procede con buen rendimiento y, lo que es igualmente importante, sin perder la estabilidad térmica de las partículas. Al mismo tiempo, esta reacción genera fluorescencia inducida por la verbal, que puede utilizarse para rastrear la captación de estas partículas en las células. En este trabajo demostramos la conjugación de polietilenglicol (PEG) en la superficie de Qβ a través de la reacción Haddleton-Baker, que se traduce en un fluoróforo amarillo brillante. Estas partículas pueden rastrearse como se toman las células. El Protocolo adjunto ayudarán a los investigadores generar pegilado fluorescente nuevas nanopartículas proteínico basadas en Qβ, aunque sus principios son aplicables a uno de los muchos otros VLPs que contienen solvente disulfuros expuestas.

Protocolo

1. preparación

1. Hacer agar caldo (LB) de lisogenia y verter placas¹².
2. Transformar BL21(DE3) con un plásmido pET28 que contiene la secuencia de la proteína de wtQβ capa.
   1. Descongelar las células competentes de e. coli BL21(DE3) en un baño de hielo. Depositar 50 μL de las células en un tubo de microcentrífuga.
   2. Añadir 2 μL del plásmido en un tubo y mueva suavemente el tubo. Luego incubar en hielo durante 30 minutos.
   3. Choque térmico las células para 45 s en un baño de agua a exactamente a 42 ° C. Coloque el tubo en el baño de hielo inmediatamente después del choque de calor e incubar durante 5 minutos.
   4. Agregar 950 μL de medio LB que no contiene ningún antibiótico.
   5. Agitar el cultivo a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.
   6. Placa de 100 μL de la cultura en placas de agar LB (con kanamicina) e incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Seleccione colonias blancas cuando sea necesario.
3. Hacer los medios caldo óptimo Super (sollozo).
   1. Autoclave 2 L había desconcertado matraces Erlenmeyer en un ciclo de superdry.
   2. En un ambiente aséptico, pesar y añadir 20,0 g de triptona, extracto de 5,0 g de levadura, 2,469 g de sulfato de magnesio anhidro, 0,584 g de cloruro de sodio y 0,186 g de cloruro de potasio a cada matraz.
   3. Llevar el volumen a 1 L con agua ultrapura en cada frasco y autoclave en el ciclo líquido.
   4. Una vez que los medios de comunicación SOB ha alcanzado temperatura ambiente después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de kanamicina (100 mg/mL) a cada litro de medio y guardar a 4 ° C.
4. Hacer el tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
   1. Hacer solución monobásico de potasio de 1 M disolviendo 68,045 g de potasio monobásico en 500 mL de agua ultrapura.
   2. Hacen 1 M potasio dibásico solución disolviendo 87,09 g de potasio dibásico en 500 mL de agua ultrapura.
   3. Añadir 38,5 mL de solución de potasio monobásico y 61,5 mL de potasio dibásico a una botella de 1 L.
   4. Ajustar pH a 7.00 si es necesario y llevar a un volumen de 1 L.
5. Hacer 5 – 40% gradientes de sacarosa en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
   1. En tubos de centrífuga de 50 mL, preparar soluciones con sacarosa al 5 – 40% (aumentando en incrementos de 5%) disuelto en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
   2. Depósito de 3,3 mL de solución de sacarosa al 5% en la parte inferior de un tubo de fondo redondo policarbonato 38 mL usando una jeringa de aguja larga y repetir este proceso para los otros cinco tubos.
   3. Depositar cuidadosamente 3,3 mL de solución de sacarosa del 10% en la parte inferior del tubo y retire con cuidado la aguja para no molestar el gradiente. Repita para los otros cinco tubos.
       
6. Seguir depositar capas de 3,3 mL de soluciones de sacarosa, aumentando de 15% a 40% en cada tubo, teniendo cuidado para no perturbar el gradiente.
7. Cuando termine, cubrir la parte superior de los gradientes con papel de aluminio y almacenar a-80 ° C.

2. expresión de Qβ

1. Limpie el área del Banco con lejía y etanol de 1:1.
2. Hacer dos culturas de arrancador 3 mL en un ambiente aséptico añadiendo solo colonias de e. coli BL21(DE3) en 3 mL de medio de sollozo en un ambiente aséptico.
3. Crecen durante la noche en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% de humedad relativa (HR).
4. Sembrar cultura de arrancador en medio del sollozo:
   1. Sacar ambas culturas de arrancador 3 mL de la coctelera y, en un ambiente aséptico, vierta cada cultura de arrancador en uno de los dos 2 L desconcertado matraces Erlenmeyer con 1 L de frescas SOB los medios de comunicación en cada uno.
   2. Colocar el medio inoculado en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH.
5. Crecen las bacterias en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH hasta OD₆₀₀ 0.9 – 1.0.
6. Añadir 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) usando una pipeta P1000 para inducir la expresión de la proteína.
7. Deja los medios de comunicación en la coctelera a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% HR durante la noche.
8. Retire los medios de comunicación de la coctelera la mañana siguiente y centrífuga usando botellas de 1000 mL en 20.621 × g durante 1 h a 4 ° C para cosechar las células.
9. Deseche el sobrenadante y recoger el precipitado de células.
   1. Vierta el sobrenadante en un matraz con aproximadamente 5 mL de blanqueador para matar las bacterias. Se trata de residuos.
   2. Use una espátula para raspar el precipitado de células de la parte inferior de la botella de centrífuga y poner el sedimento en un tubo de centrífuga de 50 mL.

3. purificación de Qβ

1. Resuspender el precipitado de células con ~ 20-30 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
2. Asegúrese de que la resuspensión no tiene trozos y lyse las células usando un procesador microfluidizer según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales). Lyse las células de al menos dos veces para aumentar el rendimiento de las partículas.
3. Centrifugue el lisado en botellas de centrífuga de 250 mL a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.
4. Descarte el precipitado y medir el volumen del sobrenadante en mL. Multiplicar ese valor por 0.265 y añadir esa cantidad de g de sulfato de amonio en el sobrenadante.
5. Revuelva en 4 ° C durante al menos 1 h en una placa de agitación a 200 rpm a precipitar hacia fuera la proteína.
6. Centrifugue en botellas de 250 mL a 20.621 x g durante 1 h a 4 ° C.
7. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado con unos 10 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
8. Añadir volúmenes iguales de cloroformo 1:1 / n-butanol a la muestra cruda y mezclar con un vórtex durante unos segundos.
9. Centrifugar en tubos de 38 mL en 20.621 × g durante 30 minutos a 4 ° C.
10. Recuperar la capa acuosa superior utilizando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado no para tomar el gel como capa que se ha formado entre la capa acuosa y orgánica.
11. Descongelar seis 5 – 40% gradientes de sacarosa hecha de antemano y cargar unos 2 mL del extracto en cada uno.
12. Ultracentrífuga 99.582 x g durante 16 horas a 4 ° C con la desaceleración libre.
13. Brillar una luz de diodo (LED) en cada tubo de emisión de luz y una banda azul debe ser visible. Recuperar estas partículas con una jeringa de aguja larga.
14. Ultrapellet las partículas a 370.541 x g durante 2,5 h a 4 ° C.
15. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado transparente de partículas purificadas con tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).

4. cuantificación y confirmación del producto

1. Utilice análisis de Bradford para cuantificar el producto¹³.
2. Reducir la marcha y no reducir sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) para confirmar el producto¹⁴.
   Nota: Reducción de SDS-PAGE se utiliza para confirmar el peso molecular de la proteína de la capa; no reducción de SDS-PAGE es confirmar la estructura de orden superior.

5. conjugar los compuestos DB en Qβ

1. Reducir disulfuros en Qβ.
   1. Disolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) en 1 mL de agua ultrapura para hacer una solución stock de 100 x.
      Nota: Preparar TCEP fresco antes de la reducción.
   2. Añadir 200 μL de Qβ (5 mg/mL) en un tubo de microcentrífuga.
   3. Siga añadiendo 20 μl de solución stock de 100 x TCEP.
   4. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
2. Volver a puente disulfuro reducido utilizando polietilenglicol dibromomaleimide (DB-PEG).
   1. Se disuelven 0,0017 g de dibromomaleimide-polietilenglicol (PEG-DB) en 100 μl de DMF.
   2. Añadir 680 μl de solución de fosfato de sodio 10 mM (pH 5.00).
   3. Añadir reducido Qβ en la solución de DB-PEG y observar el proceso de mezcla bajo una lámpara de UV 365 nm. La fluorescencia amarillo brillante puede ser visualizada inmediatamente con 365 nanómetro portátil UV lámpara con mezcla.
   4. Que la reacción proceda durante la noche a temperatura ambiente (RT) en un asador estilo rotisserie.
3. Purificar la mezcla de reacción por filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) tres veces utilizando 1 x PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.
4. Supervisar la conjugación por no reducción de SDS-PAGE y electroforesis del gel de agarosa al nativo.
   Nota: VLPs ejecutan como partículas intactas en gel de agarosa nativa, y son separados en base a su carga, tamaño y forma.

Resultados

Los derivados de dibromomaleimide se pueden sintetizar mediante la reacción de condensación entre el anhídrido dibromomaleimide y aminas primarias¹⁵. Como alternativa, un método sintético suave¹⁶ usando N-Metoxicarbonil activado 3,4-dibromomaleimide fue explotada aquí reaccionando con metoxipolietilen glicol (PEG) al rendimiento DB-PEG (figura 1). NMR fue utilizada para identificar la estructura compuesta ...

Discusión

En comparación con purificación de proteínas más pequeñas, un único paso en la purificación de bacteriófago Qβ es la centrifugación del gradiente de sacarosa. Después del paso de extracción de cloroformo/n-butanol, Qβ más se purifica mediante gradientes de sacarosa 5-40%. Durante la centrifugación, las partículas se separan en base a sus tamaños. Las partículas más grandes viajan a la región de densidad más alta, mientras que las partículas más pequeñas permanecen en la región de más baja densid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, Poweder	Research Products International	T60060-1000.0
Yeast Extract, Poweder	Research Products International	Y20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfate	P212121	CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System	Fisher Scientific	4474524
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	P288-500
Sucrose	Fisher Scientific	S25590B
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor	Fisher Scientific	096-041053
Ammonium Sulfate	P212121	KW-0066-5KG
Chloroform	Alfa Aesar	32614-M6
1-Butanol	Fisher Scientific	A399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum	Beckman Coulter	342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,	Beckman Coulter	337922
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Fisher Scientific	PI23200
TRIS Hydrochloride	Research Products International	T60050-1000.0
Tetramethylethylenediamine	Alfa Aesar	J63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma Aldrich	C4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polythylene Glycol	Alfa Aesar	41561-22
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamide/bis-Acrylamide	P212121	RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771-100G
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Labnet Revolver Adjustable Rotator	Thomas Scientific	1190P25
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap	Thermo Scientific	010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer	Thermo Scientific	3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC	Thermo Scientific	3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim	Pyrex	4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	Millipore Sigma	UFC801024
M-110P Microfluidizer Materials Processor	Microfluidics	M-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate	Beckman Coulter	41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL	PolyLab	80005
533LS-E Series Steam Sterilizers	Getinge	533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid	LabSource	D36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 Orbital Shaker	VWR Scientifc Products	14005-830
Tetra Handcast systems	Bio-Rad	1658000FC
Polypropylene, 250 mL	Beckman Coulter	41121703
Spectrofluorometer NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	3300
Long Needle	Hamilton	7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock	Fisher Scientific	14-841-46
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl	Bio-Rad	456-1084