JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем процедура дневно functionalize дисульфиды на Qβ VLP с dibromomaleimide. Мы описываем выражение Qβ и очистки, Синтез функционализированных dibromomaleimide молекул и спряжение реакции между dibromomaleimide и Qβ. Результате желтый флуоресцентный конъюгированных частиц может использоваться как флуоресценции зонда внутрь клетки.

Аннотация

Недавний рост вирусоподобных частиц (VLP) в биомедицинских и материалы исследований можно отнести их простота биосинтез, дискретных размер, генетическое программирование и способность к биологическому разложению. Хотя они очень поддаются реакции bioconjugation для добавления синтетическими лигандами на их поверхность, диапазон в методологии bioconjugation на эти водные родился capsids относительно ограничен. Чтобы облегчить направление исследований функциональные биоматериалы, должны рассматриваться нетрадиционных bioconjugation реакций. Реакции, указанных в настоящем Протоколе использует dibromomaleimides ввести новую функциональность в растворителе, подвергаются дисульфидными облигаций VLP основе бактериофага Qβ. Кроме того конечный продукт флуоресцентные, которая имеет дополнительное преимущество генерации отслеживаются в vitro зонд, с помощью набора коммерчески доступных фильтров.

Введение

С помощью нано размера вирусного capsids стала возбуждающего поля, которая направлена на расширение сферы применения биомедицинских исследований в1,2,3. Recombinantly выразил вирусоподобных частиц (VLP) структурно являются производными от вирусов, но им не хватает оригинальных вирусного генетического материала, делая их неинфекционных белковых наночастиц. Как особенности поверхности генетически запрограммирован и каждый капсид выражается одинаково на те до и после него, это можно узнать местонахождение и количество реактивных боковых цепей аминокислот с атомистическим точностью. Во многих случаях наружных и внутренних поверхностей обладают многие виды растворителей подвергаются аминокислотных остатков, которые реально могут быть функционализированных через bioconjugation реакции - реакции, которые образуют ковалентные связи между биомолекулы и синтетические молекула4,5.

Bioconjugation реакции помогают биомолекул интерес у более разнообразных функций в относительно простой моды. Молекулы интереса, таких как лечебных препаратов6, флуоресцентные метки7 и полимеров8,9 могут быть предварительно синтезируется и характеризуется, прежде чем они крепятся на поверхности VLP. Особенно распространены VLP в биомедицинских и биоматериалов исследования был ВЛП, основанные на бактериофага Qβ, который, как recombinantly выраженным, является 28 Нм икосаэдра вирусного капсида10. Наиболее распространенные реакции сайты на Qβ являются lysines с большим отрывом, хотя недавно мы общались успешного сопряжения11 dibromomaleimide соединений для снижения дисульфиды, которые выстилают поры Qβ через Haddleton-Бейкер реакции. Реакция идёт с хорошим доходность и, что не менее важно, без потери термостабильности частиц. В то же время эта реакция генерирует спряжение индуцированной флуоресценции, который может использоваться для отслеживания поглощение этих частиц в клетки. В этой работе мы демонстрируем спряжение полиэтиленгликоля (PEG) на поверхность Qβ через Haddleton-Бейкер реакцию, которая приводит яркий желтый Флюорофор. Эти частицы затем могут быть отслежены, как они принимаются клетки. Протокол здесь поможет генерировать новые люминесцентные Пегилированный белковых наночастиц на основе Qβ, хотя его принципы применяются к одному из многих других VLP, содержащие растворитель подвергаются дисульфиды исследователей.

протокол

1. Подготовка

  1. Сделать Lysogeny бульон (LB) агар и залить12пластин.
  2. Преобразование BL21(DE3) с pET28 плазмиды, содержащих последовательности белка wtQβ пальто.
    1. Оттепель E. coli BL21(DE3) сведущие клетки в ледяной бане. Место 50 мкл клеток в пробки microcentrifuge.
    2. Добавить 2 мкл плазмида в одну трубу и мягко проведите трубки. Затем Инкубируйте на льду за 30 мин.
    3. Теплового шока клетки для 45 s в ванне с водой, в Ровно 42 ° C. Сразу после тепло шокирующие Поместите трубку обратно в ледяной ванне и инкубировать в течение 5 мин.
    4. Добавление 950 мкл LB средств массовой информации, которые не содержат любой антибиотик.
    5. Встряхнуть культуры на 200 об/мин, 60 мин при температуре 37 ° C.
    6. Пластина 100 мкл культуры на плитах агара фунтов (с канамицин) и инкубировать пластину на ночь при 37 ° C. Выберите белый колонии при необходимости.
  3. Сделайте супер оптимального бульон (SOB) средства массовой информации.
    1. Автоклав два 2 L озадаченного Эрленмейер колбы на superdry цикла.
    2. В асептических условиях весят и добавить 20,0 г Триптон, 5,0 г дрожжей экстракт, 2.469 g безводного сульфата магния, 0,584 г натрия хлорида и 0,186 г хлористого калия на каждый флакон.
    3. Доводят объем до 1 Л с ультрачистая вода в каждом колбу и автоклава на жидком цикла.
    4. После того, как СОБ СМИ достигла комнатной температуре после автоклавирования, добавить 1 мл канамицин (100 мг/мл) в каждый литр средства массовой информации и хранить при 4 ° C.
  4. Сделайте буфер фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
    1. Сделайте 1 M калия монокальций решения путем растворения 68.045 г калия монокальций в 500 мл ультрачистая вода.
    2. Сделайте 1 M калия двуосновной решения путем растворения 87.09 г калия двуосновной в 500 мл ультрачистая вода.
    3. Добавьте 38,5 мл раствора калия монокальций и 61,5 мл калия двуосновной бутылка 1 Л.
    4. Отрегулируйте пэ-аш до 7.00, в случае необходимости и довести до объемом 1 л.
  5. Сделать 5-40% сахарозы градиенты в буфере фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
    1. В 50 мл пробирок Подготовьте решения с сахарозы 5-40% (увеличение с шагом 5%), растворенного в буфере фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).
    2. Депозит 3,3 мл раствора 5% сахарозы в нижней части 38 мл раунд дно из поликарбоната с помощью длинной иглой шприца и повторите это действие для пяти других труб.
    3. Тщательно депозит 3,3 мл 10% раствора сахарозы в нижней части трубки и осторожно извлеките иглу относительно не беспокоить градиента. Повторите для других пяти трубок.
       
  6. Продолжать депозит слои 3,3 мл растворов сахарозы, увеличение от 15% до 40% в каждой тюбике, будучи осторожны, чтобы не нарушить градиента.
  7. Когда закончите, охватывают верхушки градиенты с фольгой и хранить при температуре-80 ° C.

2. выражение Qβ

  1. Протрите скамейке Блич/этанол 1:1.
  2. Сделать два 3 мл закваски в асептической среде путем добавления одной колонии E. coli BL21(DE3) в 3 мл SOB СМИ в асептической среде.
  3. Растут на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% относительная влажность (rH) номер на ночь.
  4. Прививать закваски в СОБ СМИ:
    1. Снять оба 3 мл стартерных культур шейкер и в асептических условиях, налить каждый закваски в один из двух 2 L озадаченного Эрленмейер колбы с 1 Л свежих SOB СМИ в каждом.
    2. Место привитых СМИ на шейкер на 250 об/мин в комнате 37 ° C и 0% rH.
  5. Расти бактерии на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% rH комнате, пока ОД600 достигает 0,9 – 1,0.
  6. Добавьте 1 mL 1 М изопропиловый β-D-1 тиогалактопиранозид (IPTG) с помощью пипетки P1000 побудить выражения протеина.
  7. Оставьте СМИ на шейкер на 250 об/мин в 37 ° C и 0% rH комнате на ночь.
  8. Удалите СМИ из шейкер следующее утро и центрифуги с помощью 1000 мл бутылки на 20,621 × g за 1 час при температуре 4 ° C для сбора клеток.
  9. Отменить супернатант и собирать Пелле ячейки.
    1. Залейте супернатант в колбу с около 5 мл отбеливатель, чтобы убить бактерии. Это отходов.
    2. Лопаточкой скрести клетки гранулы из нижней части бутылки центрифуги и положить лепешку в 50 мл пластиковых пробирок.

3. Очистка Qβ

  1. Ресуспензируйте клетки лепешка с ~ 20-30 мл 0,1 М калия фосфат буфера (pH 7.00).
  2. Убедитесь, что ресуспендирования имеет не куски и лизировать клетки, с помощью microfluidizer процессора по данным производителя протокол (см. Таблицу материалы). Лизируйте клетки по крайней мере дважды увеличить доходность частиц.
  3. Центрифуга lysate в 250 мл бутылки центрифуги на 20,621 x g за 1 час при 4 ° C.
  4. Отменить гранулы и измерить объем супернатант в мл. Умножьте это значение на 0,265 и добавить что количество г сульфата аммония супернатант.
  5. Движение на 4 ° C для по крайней мере 1 h на плите переполох на 200 об/мин, чтобы осадить из белка.
  6. Центрифуга в 250 мл бутылки на 20,621 x g за 1 час при 4 ° C.
  7. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с около 10 мл 0,1 М калия фосфат буфера (pH 7.00).
  8. Добавьте равных объемах 1:1 хлороформ/н бутанолом в сырой пример и микс, vortexing на несколько секунд.
  9. Центрифуга 38 мл пробирки на 20,621 × g 30 минут при 4 ° C.
  10. Восстановите Топ водный слой с помощью пипетки Пастера. Будьте осторожным, чтобы не принимать любое из геля как слой, который сложился между водный и органического слоя.
  11. Оттепель шесть 5-40% готовые сахарозы градиенты и загрузки около 2 мл экстракт на каждую.
  12. Ультрацентрифуги на 99,582 x g для 16 ч при 4 ° C с бесплатным замедления.
  13. Блеск Светоиспускающий диод (LED) свет под каждой трубы и синей полосой должен стать видимым. Восстановите эти частицы с длинной иглой шприца.
  14. Ultrapellet частиц на 370,541 x g для 2,5 ч при 4 ° C.
  15. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Прозрачные гранулы очищенный частиц с буфером фосфат калия 0,1 М (pH 7.00).

4. Количественная оценка и подтверждение продукта

  1. Использование Assay Брадфорд для количественного определения продукта13.
  2. Выполнения сокращения и не сокращение натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) для подтверждения продукта14.
    Примечание: Уменьшение SDS-PAGE используется для подтверждения низкомолекулярных белков пальто; не сокращение SDS-PAGE является подтверждение структуры высшего порядка.

5. спряжение DB соединений на Qβ

  1. Уменьшите дисульфиды на Qβ.
    1. Распустить 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP) в 1 мл сверхчистой воды сделать Стоковый раствор 100 x.
      Примечание: Подготовьте свежие TCEP до сокращения.
    2. Добавьте 200 мкл Qβ (5 мг/мл) в трубку microcentrifuge.
    3. Следовать за путем добавления 20 мкл 100 x TCEP раствор.
    4. Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
  2. Повторно мост снижение дисульфида, с помощью dibromomaleimide Полиэтиленгликоль (DB-PEG).
    1. Растворите 0,0017 г dibromomaleimide-Полиэтиленгликоль (DB-PEG) в 100 мкл ДМФ.
    2. 680 мкл раствора натрия фосфата 10 мм (рН 5.00).
    3. Добавить сократить Qβ в раствор DB-КОЛЫШЕК и наблюдать процесс смешивания под лампой УФ 365 Нм. Яркие желтые флуоресценции могут быть немедленно визуализированы с 365 Нм Карманный УФ лампой после смешивания.
    4. Пусть реакции перейти на ночь при комнатной температуре (RT) на вертеле.
  3. Очистить реакционной смеси центробежным фильтром (COMW = 10 кДа) три раза с использованием ПБС в 3,283 x g 20 мин при 4 ° C.
  4. Контролировать спряжение, не снижая SDS-PAGE и родной геля агарозы.
    Примечание: VLP как нетронутыми частиц в родной агарозном геле, и они разделяются на их заряда, размер и форму.

Результаты

Dibromomaleimide производные могут быть синтезированы посредством реакции конденсации между dibromomaleimide ангидрид и первичных аминов15. Кроме того мягкий синтетический метод16 , с использованием N-метоксикарбонил активированный 3,4-dibromomaleimide эксплуатиров...

Обсуждение

По сравнению с небольших очищение протеина, уникальный шаг в очищающий бактериофага Qβ — сахароза градиентного центрифугирования. После извлечения хлороформ/н бутанолом шага Qβ далее очищается с помощью 5-40% сахарозы градиентов. Во время центрифугирования частицы разделяются на их раз...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

J.J.G. признает Национальный научный фонд (DMR-1654405) и Институт исследования профилактики рака штата Техас (CPRIT) (RP170752s) за их поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth (Miller) EMD Millipore1.10285.0500
Tryptone, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Yeast Extract, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfateP212121CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-10
Potassium ChlorideFisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification SystemFisher Scientific4474524
Potassium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP362-1
Potassium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificP288-500
SucroseFisher ScientificS25590B
EthanolFisher ScientificBP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor Fisher Scientific096-041053
Ammonium SulfateP212121KW-0066-5KG
ChloroformAlfa Aesar32614-M6
1-ButanolFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, AluminumBeckman Coulter342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,Beckman Coulter337922
Coomassie (Bradford) Protein AssayFisher ScientificPI23200
TRIS HydrochlorideResearch Products InternationalT60050-1000.0
TetramethylethylenediamineAlfa AesarJ63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma AldrichC4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97%Sigma Aldrich553603-5G
Polythylene GlycolAlfa Aesar41561-22
Sodium PhosphateFisher ScientificAC424375000
Acrylamide/bis-AcrylamideP212121RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfateSigma AldrichL3771-100G
Ammonium PersulfateFisher ScientificBP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscopeOlympus FV3000 
Labnet Revolver Adjustable Rotator Thomas Scientific 1190P25 
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap Thermo Scientific010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene CopolymerThermo Scientific3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PCThermo Scientific3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty RimPyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitsMillipore SigmaUFC801024
M-110P Microfluidizer Materials ProcessorMicrofluidicsM-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge TubesThermo Scientific3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, PolycarbonateBeckman Coulter41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mLPolyLab80005
533LS-E Series Steam SterilizersGetinge533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with LidLabSourceD36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubeFisher Scientific14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mLFisher Scientific05-408-129
VWR Os-500 Orbital ShakerVWR Scientifc Products14005-830
Tetra Handcast systemsBio-Rad1658000FC
Polypropylene, 250 mLBeckman Coulter41121703
Spectrofluorometer NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Long Needle Hamilton 7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilsonF144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory BalanceIntelligent Weighting TechnologyIWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubeFisher Scientific14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µlBio-Rad456-1084

Ссылки

  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
  3. Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
  4. Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
  5. Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
  6. Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
  7. Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
  8. Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
  10. Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
  11. Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
  12. . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
  13. Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
  14. Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
  15. Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
  16. Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
  17. Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135Q Qbetafunctionalizing capsidsbioconjugationdibromomaleimidePEG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены