Faire induite par la conjugaison Fluorescent pégylé Pseudo-particules virales de chimie Dibromomaleimide-disulfure

Résumé

Nous présentons ici une procédure pour fonctionnaliser fluorescent les disulfures sur Qβ VLP avec dibromomaleimide. Nous décrivons Qβ expression et purification, la synthèse de molécules dibromomaleimide fonctionnalisés et la réaction de conjugaison entre dibromomaleimide et Qβ. La particule de conjugué fluorescente jaune qui en résulte peut être utilisée comme une sonde de fluorescence à l’intérieur des cellules.

Résumé

La récente hausse des Pseudo-particules virales (VLP) dans la recherche biomédicale et la recherche sur les matériaux peut être attribuée à leur facilité de biosynthèse, taille discrète, programmabilité génétique et biodégradabilité. Pendant qu’ils sont très susceptibles de réactions bioconjugaison permettant d’ajouter des ligands synthétiques sur leur surface, la bioconjugaison méthodologies sur ces capsides nés aqueux est relativement limitée. Pour faciliter la direction de la recherche de biomatériaux fonctionnels, réactions bioconjugaison non traditionnels doivent être considérées. La réaction décrite dans le présent protocole utilise dibromomaleimides pour introduire de nouvelles fonctionnalités dans le solvant disulfures exposées d’un PPV basés sur Qβ de bactériophage. En outre, le produit final est fluorescent, qui présente l’avantage de produire une sonde traçable in vitro à l’aide d’un jeu de filtres disponibles dans le commerce.

Introduction

À l’aide de taille nanométrique des capsides virales est devenue un domaine passionnant, qui vise à élargir le champ des applications dans la recherche biomédicale^1,2,3. Inoculation exprimées Pseudo-particules virales (VLP) structurellement proviennent de virus, mais ils n’ont pas le matériel génétique viral initial, ce qui les rend non infectieuses protéinacées nanoparticules. Comme les caractéristiques de la surface sont génétiquement programmés et chaque capside est exprimée identiquement à ceux avant et après elle, il est possible de connaître l’emplacement et le nombre de chaînes de réactif latérales des acides aminés avec précision des atomes. Dans de nombreux cas, des surfaces extérieures et intérieures possèdent beaucoup de genres de résidus de solvant exposés d’acides aminés, qui peuvent facilement être fonctionnalisés par bioconjugaison réactions - réactions qui forment des liaisons covalentes entre une biomolécule et synthétique molécule^4,5.

Bioconjugaison réactions aident biomolécules d’intérêt ont des fonctionnalités plus diversifiées de façon relativement simple. Molécules d’intérêt, tels que les médicaments thérapeutiques⁶, étiquettes fluorescentes⁷ et polymères^8,9 peuvent être préalablement synthétisés et caractérisés avant ils sont attachés à la surface du PPV. Un PPV particulièrement courante en recherche biomédicale et recherche des biomatériaux a été le VLP basé sur Qβ de bactériophage, qui, comme inoculation exprimée, est un de capside icosaédrique nm 28¹⁰. Sites de réaction les plus communs sur Qβ sont des lysines par une large marge, bien que nous avons récemment communiqué la conjugaison réussie¹¹ de dibromomaleimide composés pour les disulfures réduites qui tapissent les pores du Qβ par une réaction de Haidar-Baker. La réaction se produit avec un bon rendement et, tout aussi important, sans perdre la stabilité thermique des particules. Dans le même temps, cette réaction génère la fluorescence induite sur la conjugaison, qui peut être utilisée pour suivre l’absorption de ces particules dans des cellules. Dans ce travail, nous démontrons la conjugaison de polyéthylène glycol (PEG) sur la surface de Qβ grâce à la réaction de Haidar-Baker, qui se traduit par un fluorophore jaune vif. Ces particules puis peuvent être suivis que comme elles sont recueillies par les cellules. Le protocole ci-après aidera les chercheurs à générer de nouveau pégylé fluorescent nanoparticules protéiques basés sur Qβ, bien que ses principes sont applicables à l’un des nombreux autres PPV du contenant le solvants disulfures exposées.

Protocole

1. préparation

1. Faire agar de lysogénie bouillon (LB) et verser des plaques¹².
2. Transformer BL21 (DE3) avec un plasmide pET28 qui contient la séquence de protéine de manteau de wtQβ.
   1. Décongelez les cellules compétentes d’Escherichia coli BL21 (DE3) dans un bain de glace. Place 50 μL de cellules dans un tube de microcentrifuge.
   2. Ajouter 2 μL de plasmide dans un tube et effleurer doucement le tube. Puis incuber sur glace pendant 30 min.
   3. Choc thermique les cellules pour 45 s dans un bain d’eau à 42 ° c exactement. Placer le tube dans le bain de glace immédiatement après la chaleur-choquant et incuber pendant 5 min.
   4. Ajouter 950 μL de médias LB qui ne contient pas de n’importe quel antibiotique.
   5. Secouez la culture à 200 tr/min pendant 60 min à 37 ° C.
   6. Plaque de 100 μL de la culture sur plaques de gélose LB (avec kanamycine) et incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C. Sélectionner les colonies blanches lorsque nécessaire.
3. Faire des médias de Super optimale bouillon (SOB).
   1. Autoclave deux 2 L déconcerté Erlenmeyers selon un cycle de superdry.
   2. En milieu aseptique, peser et ajouter 20,0 g de tryptone, extrait de 5,0 g de levure, 2,469 g de sulfate de magnésium anhydre, 0,584 g de chlorure de sodium et 0,186 g de chlorure de potassium dans chaque fiole.
   3. Compléter le volume à 1 L avec de l’eau ultrapure dans chaque fiole et autoclave sur le cycle de liquid.
   4. Une fois que les médias de SOB a atteint la température ambiante après la stérilisation, ajouter 1 mL de kanamycine (100 mg/mL) à chaque litre de médias et conserver à 4 ° C.
4. Faire le tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
   1. Faire 1 M potassium monobasique solution en dissolvant 68,045 g de potassium monobasique dans 500 mL d’eau ultrapure.
   2. Faire 1 M potassium dibasique solution en dissolvant 87,09 g de potassium dibasique dans 500 mL d’eau ultrapure.
   3. Ajouter 38,5 mL de solution de potassium monobasique et 61,5 mL de potassium dibasique à une bouteille de 1 L.
   4. Ajuster le pH à 7,00 si nécessaire et porter à un volume de 1 L.
5. Faites 5 à 40 % de gradients de sucrose à tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
   1. En tubes de 50 mL de centrifugeuse, préparer les solutions avec 5 – 40 % (augmentation par paliers de 5 %) de saccharose dissous dans le tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
   2. Déposez 3,3 mL de solution de 5 % de saccharose au fond d’un tube à fond rond en polycarbonate 38 mL à l’aide d’une seringue de longue aiguille et répétez cette opération pour cinq autres tubes.
   3. Déposer soigneusement 3,3 mL de solution de saccharose de 10 % dans le bas du tube et retirer délicatement l’aiguille quant à ne pas déranger le gradient. Répétez pour les cinq autres tubes.
       
6. Continuer à déposer des couches de 3,3 mL des solutions de saccharose, passant de 15 % à 40 % dans chaque tube, tout en étant prudent ne pas déranger le gradient.
7. Lorsque vous avez terminé, couvrir le dessus des gradients d’aluminium et conserver à-80 ° C.

2. expression de Qβ

1. Essuyer la zone de banc avec 1:1 eau de Javel et de l’éthanol.
2. Faire deux ferments de 3 mL en milieu aseptique en ajoutant des colonies individuelles de e. coli BL21 (DE3) dans 3 mL de médias SOB en milieu aseptique.
3. Se développer sur un agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % d’humidité relative (HR) durant la nuit.
4. Ensemencer la culture starter dans les médias de SOB :
   1. Décoller les deux ferments de 3 mL de l’agitateur et, dans un environnement aseptique, verser chaque culture starter dans un des deux 2 L dérouté Erlenmeyers avec 1 L de supports neufs de SOB dans chacune.
   2. Placer les médias inoculés sur un agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % rH.
5. Cultiver les bactéries sur un agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % rH OD₆₀₀ jusqu'à 0,9 à 1,0.
6. Ajouter 1 mL de 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à l’aide d’une pipette P1000 pour induire l’expression de la protéine.
7. Laisser les médias sur l’agitateur à 250 tr/min dans une chambre de 37 ° C et 0 % rH du jour au lendemain.
8. Enlevez média le shaker le lendemain matin et centrifuger à l’aide de bouteilles de 1000 mL à 20 621 × g pendant 1 h à 4 ° C de récolter les cellules.
9. Jeter le surnageant et recueillir le culot cellulaire.
   1. Versez le liquide surnageant dans une fiole avec environ 5 mL d’eau de Javel pour tuer les bactéries. Il s’agit des déchets.
   2. Utilisez une spatule pour gratter le culot du fond de la bouteille de la centrifugeuse et mettre la pastille dans un tube à centrifuger 50 mL.

3. purification de Qβ

1. Resuspendre le culot cellulaire avec environ 20 à 30 mL de tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
2. Assurez-vous que la remise en suspension n’a aucun morceaux et lyser les cellules à l’aide d’un processeur microfluidiseur selon le protocole du fabricant (voir Table des matières). Lyse des cellules au moins deux fois pour augmenter le rendement des particules.
3. Centrifuger le lysat en bouteilles de 250 mL centrifugeuse à 20 621 x g pendant 1 h à 4 ° C.
4. Jeter le culot et mesurer le volume du liquide surnageant dans mL. Multipliez cette valeur par 0,265 et ajouter ce montant de g de sulfate d’ammonium au surnageant.
5. Remuer à 4 ° C pendant au moins 1 h sur une plaque de remuer à 200 tr/min à précipiter les protéines.
6. Centrifuger en bouteilles de 250 mL à 20 621 x g pendant 1 h à 4 ° C.
7. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot avec environ 10 mL de tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).
8. Ajouter des volumes égaux de 1:1 chloroforme/n-butanol à l’échantillon brut et mélanger au Vortex pendant quelques secondes.
9. Centrifuger en tube 38 mL à 20 621 × g pendant 30 minutes à 4 ° C.
10. Récupérer la couche aqueuse à l’aide d’une pipette Pasteur. Soyez prudent ne pas de prendre du gel comme couche qui s’est formé entre la couche aqueuse et organique.
11. Décongeler les six gradients de sucrose pré-faites de 5 à 40 % et charger environ 2 mL de l’extrait sur chacune.
12. Ultracentrifugeuse à 99 582 x g pendant 16 h à 4 ° C, avec une décélération gratuite.
13. Briller un feu émettant une lumière diode électroluminescente (del) dans chaque tube et une bande bleue devienne visible. Récupérer ces particules avec une longue aiguille seringue.
14. Ultrapellet les particules à 370 541 x g pendant 2,5 heures à 4 ° C.
15. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot transparent de particules purifiés avec tampon de phosphate de potassium 0,1 M (pH 7.00).

4. quantification et Confirmation du produit

1. Analyse de Bradford permet de quantifier les produits¹³.
2. Réduction de l’exécution et non réductrice de dodécylsulfate de sodium sulfate sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) pour confirmer le produit¹⁴.
   NOTE : Réduction de SDS-PAGE est utilisé pour confirmer le poids moléculaire de la protéine de capside ; SDS-PAGE non réducteur est de confirmer la structure d’ordre supérieure.

5. conjugaison des composés de la DB sur Qβ

1. Réduire les disulfures sur Qβ.
   1. Dissoudre 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) dans 1 mL d’eau ultrapure pour faire une solution stock de 100 x.
      NOTE : Préparez PTCE fraîche avant réduction.
   2. Ajouter 200 µL de Qβ (5 mg/mL) dans un tube de microcentrifuge.
   3. Suivre en ajoutant 20 µL de solution étalon de 100 x TCEP.
   4. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
2. Nouveau pont disulfure réduit à l’aide de dibromomaleimide polyéthylène glycol (PEG-DB).
   1. Dissoudre 0,0017 g de dibromomaleimide-polyéthylène glycol (PEG-DB) dans 100 µL de DMF.
   2. Ajouter 680 µL de solution de phosphate de sodium 10 mM (pH 5.00).
   3. Ajouter Qβ a réduit dans la solution de DB-PEG et observer le processus de mixage sous une lampe à UV 365 nm. La fluorescence jaune vif peut être visualisée immédiatement avec une lampe à UV poche 365 nm à mélanger.
   4. Laissez la réaction passez une nuit à température ambiante (RT) sur une rôtissoire.
3. Purifier le mélange réactionnel par filtre centrifuge (OCMV = 10 kDa) trois fois à l’aide de solution 1 PBS x à 3 283 x g pendant 20 min à 4 ° C.
4. Surveiller la conjugaison non réducteur SDS-PAGE et électrophorèse sur gel d’agarose native.
   Remarque : VLP couler comme des particules intactes en gel d’agarose native, et elles sont séparées selon leur charge, la taille et la forme.

Résultats

Les dérivés de dibromomaleimide peuvent être synthétisés par la réaction de condensation entre l’anhydride dibromomaleimide et des amines primaires,¹⁵. Par ailleurs, une méthode synthétique doux¹⁶ à l’aide de N-méthoxycarbonyl activé 3,4-dibromomaleimide a été exploitée ici en réagissant avec le MÉTHOXYPOLYÉTHYLÈNE glycol (PEG) au rendement DB-PEG (Figure 1). La RMN a été utilisés pour i...

Discussion

Par rapport à la purification de protéines plus petite, une étape unique en épurant bactériophage Qβ est la centrifugation en gradient de saccharose. Après l’étape d’extraction chloroforme/n-butanol, Qβ est ensuite purifiée à l’aide de gradients de sucrose de 5 à 40 %. Lors de la centrifugation, les particules sont séparées selon leur taille. Grosses particules rendront dans la région de densité plus élevée, alors que les plus petites particules restent dans la région de densité plus faible. Qβ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, Poweder	Research Products International	T60060-1000.0
Yeast Extract, Poweder	Research Products International	Y20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfate	P212121	CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System	Fisher Scientific	4474524
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	P288-500
Sucrose	Fisher Scientific	S25590B
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor	Fisher Scientific	096-041053
Ammonium Sulfate	P212121	KW-0066-5KG
Chloroform	Alfa Aesar	32614-M6
1-Butanol	Fisher Scientific	A399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum	Beckman Coulter	342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,	Beckman Coulter	337922
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Fisher Scientific	PI23200
TRIS Hydrochloride	Research Products International	T60050-1000.0
Tetramethylethylenediamine	Alfa Aesar	J63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma Aldrich	C4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polythylene Glycol	Alfa Aesar	41561-22
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamide/bis-Acrylamide	P212121	RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771-100G
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Labnet Revolver Adjustable Rotator	Thomas Scientific	1190P25
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap	Thermo Scientific	010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer	Thermo Scientific	3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC	Thermo Scientific	3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim	Pyrex	4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	Millipore Sigma	UFC801024
M-110P Microfluidizer Materials Processor	Microfluidics	M-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate	Beckman Coulter	41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL	PolyLab	80005
533LS-E Series Steam Sterilizers	Getinge	533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid	LabSource	D36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 Orbital Shaker	VWR Scientifc Products	14005-830
Tetra Handcast systems	Bio-Rad	1658000FC
Polypropylene, 250 mL	Beckman Coulter	41121703
Spectrofluorometer NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	3300
Long Needle	Hamilton	7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock	Fisher Scientific	14-841-46
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl	Bio-Rad	456-1084