JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, fluorescently Qβ VIP üzerinde disulfides dibromomaleimide ile functionalize için bir yordam mevcut. Biz Qβ ifade ve arıtma, molekülleri dibromomaleimide functionalized sentezi ve dibromomaleimide ve Qβ arasında konjugasyon tepki açıklanmaktadır. Elde edilen Sarı floresan konjuge parçacık bir floresan sonda hücrelere olarak kullanılabilir.

Özet

Virüs gibi parçacıklar (VIP) Biyomedikal son artış ve malzeme araştırma onların kolaylığı biyosentezi, ayrık boyut, genetik programlama ve biodegradability atfedilen. Onlar onların yüzeyine sentetik ligandlar eklemek için bioconjugation reaksiyonlar için son derece uysal, bioconjugation yöntemleri bu sulu d. capsids tarih aralığında göreceli olarak sınırlı iken. Fonksiyonel Biyomalzeme araştırma yönünü kolaylaştırmak için geleneksel olmayan bioconjugation tepkileri dikkate alınmalıdır. Bu protokol için açıklanan tepki dibromomaleimides solvent bazlı bir VIP maruz disülfür bağları bakteriyofaj Qβ yeni işlevsellik tanıtmak için kullanır. Ayrıca, nihai ürün piyasada bulunan filtre seti kullanarak izlenebilir vitro sonda üreten yararı olan flüoresan,.

Giriş

Nano ölçekli viral capsids kullanarak uygulamaları Biyomedikal araştırma1,2,3' te kapsamını genişletmek hedefliyor heyecan verici bir alan olarak ortaya çıkmıştır. Recombinantly ifade virüs benzeri parçacıklar (VIP) yapısal olarak virüslere karşı elde edilen ama orijinal viral genetik materyal bulaşıcı olmayan proteinaceous nano tanecikleri geliştirmelerde eksik. Yüzey özellikleri genetik programlı ve her kapsid aynı şekilde önce ve sonrasında olanlar için ifade gibi reaktif yan zincirli amino asitlerin atomistic hassasiyetle sayısını ve konumunu öğrenmek mümkündür. Birçok durumda, iç ve dış yüzeyleri pek çok feasibly bioconjugation tepkiler - Kovalent bağlar arasında bir biomolecule ve sentetik reaksiyonlar yoluyla functionalized solvent maruz amino asit kalıntıları sahip. molekül4,5.

Bioconjugation reaksiyonlar ilgi daha farklı işlevleri nispeten basit bir moda var biomolecules yardım. Molekülleri tedavi uyuşturucu6, floresan Etiketler7 ve polimerler8,9 gibi ilgi önceden sentezlenmiş ve onlar VIP'ler yüzeyinde eklenmeden önce ile karakterizedir. Özellikle ortak bir VIP içinde biyomedikal ve biyomalzeme araştırma bakteriyofaj Qβ, recombinantly olarak ifade, 28 nm icosahedral viral kapsid10temel VIP oldu. Son zamanlarda Qβ gözenekleri Haddleton-Baker tepki ile satır azaltılmış disulfides için dibromomaleimide bileşiklerin başarılı konjugasyon11 tebliğ var olsa Qβ en yaygın tepki sitelerinde geniş bir farkla lysines vardır. Reaksiyon gelirleri ile iyi verim ve eşit olarak da önemlisi, olmadan parçacıkların termal kararlılık kaybetme. Aynı zamanda, bu parçacıklar alımını hücrelere izlemek için kullanılan fiil kaynaklı floresans bu reaksiyon oluşturur. Bu çalışmada, Qβ yüzeyine bir parlak sarı fluorophore sonuç Haddleton-Baker tepki ile Polietilen glikol (PEG) konjugasyon göstermektedir. Hepsi hücreleri tarafından alınır gibi bu parçacıklar daha sonra izlenebilir. İletişim kuralı burada araştırmacılar kendi ilkeleri bir çözelti maruz disulfides içeren diğer birçok VIP'ler için uygulanabilir olmasına rağmen proteinaceous nano tanecikleri Qβ dayalı yeni floresan pegile oluşturmak yardımcı olur.

Protokol

1. hazırlık

  1. Lysogeny suyu (LB) agar yapmak ve tabak12dökün.
  2. bl21(de3) wtQβ kat protein içeren bir pET28 plazmid ile dönüşümü.
    1. E. coli BL21(DE3) yetkili hücrelerde bir buz banyosu çözülme. Hücre microcentrifuge tüp içinde yer 50 μL.
    2. Plazmid 2 μL bir tüpün içine ekleyin ve hafifçe tüpü hafifçe vur. O zaman 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    3. Isı şok hücreler için 45 s tam olarak 42 ° C'de olduğu bir su banyosunda Sonra hemen Isı-şok buz banyosunda tüpü yerleştirin ve 5 min için kuluçkaya.
    4. 950 μL herhangi bir antibiyotik içeren LB medya ekleyin.
    5. 37 ° C'de 60 dk için 200 devirde kültür sallamak
    6. 100 μL LB agar plakaları kültürünün (sefaloridin) plaka ve plaka gecede 37 ° C'de kuluçkaya Gerektiğinde beyaz kolonileri seçin.
  3. Süper en iyi suyu (SOB) medya olun.
    1. Otoklav iki 2 L Erlenmeyer şişeler superdry bir döngüsü şaşkın.
    2. Aseptik ortamında, tartmak ve tryptone 20.0 g ekleyin, 5.0 g maya ekstresi, susuz magnezyum sülfat, 2,469 g 0,584 g sodyum klorür ve 0,186 g potasyum klorür her şişesi için.
    3. Birim için 1 L Ultrasaf Su ile her şişesi ve basınçlı kap sıvı döngüsü getirmek.
    4. Bir kez SOB medya ısıyla sonra oda sıcaklığında ulaştı, sefaloridin (100 mg/mL) 1 mL medya her litre için ekleyin ve 4 ° C'de depolayın
  4. 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) olun.
    1. 1 M potasyum Yem mono çözüm 68.045 g potasyum 500 mL Ultrasaf Su Yem mono çözülerek olun.
    2. 1 M potasyum dibasic çözüm 87.09 g potasyum Ultrasaf Su 500 mL dibasic çözülerek olun.
    3. 38,5 mL potasyum Yem mono çözüm ve potasyum dibasic 61,5 mL 1 L şişe ekleyin.
    4. PH gerekirse 7,00 için ayarlamak ve 1 L. bir birime getirmek
  5. 5-%40 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) sükroz degradeler olun.
    1. 50 mL santrifüj tüplerde 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) çözünmüş % 5-40 (% 5'lik artışlarla artan) sükroz ile çözümleri hazırlayın.
    2. 3.3 mL % 5 sükroz çözeltisi alt kısmındaki uzun iğne kullanarak 38 mL yuvarlak alt Polikarbonat tüp kasası ve beş diğer tüpler için bu işlemi yineleyin.
    3. Dikkatle 3.3 mL % 10 sükroz çözeltisi tüpün dibinde mevduat ve degrade rahatsız değil gibi iğne dikkatli bir şekilde çıkarın. Diğer beş tüpler için yineleyin.
       
  6. 3.3 mL katmanları sükroz çözümleri, rahatsız etmeyin degradenin dikkatli olurken her tüpün içinde % 40'a %15 artan yatırmak devam edin.
  7. Tamamlandığında, folyo degradelerle üst kısımları kapak ve-80 ° C'de depolayın

2. Qβ ifadesidir

  1. 1:1 çamaşır suyu/etanol ile tezgah alanı silin.
  2. İki 3 mL starter kültür aseptik ortamında aseptik bir ortamda E. coli BL21(DE3) tek kolonileri SOB medya 3 mL içine ekleyerek getirin.
  3. Bir shaker bir 37 ° C ve %0 bağıl nem (rH) odada 250 rpm'de üzerinde bir gecede büyümek.
  4. SOB medya Starter kültürü aşılamak:
    1. Her iki 3 mL starter kültürler shaker alın ve aseptik bir ortamda, her starter kültür iki birinin içine dökün 2 L Erlenmeyer şişeler taze SOB medya her 1 litre ile şaşkın.
    2. Bir shaker bir 37 ° C ve % 0 rH odada 250 rpm'de inoculated medya yerleştirin.
  5. OD600 0,9-1.0 ulaşıncaya kadar bir shaker bir 37 ° C ve % 0 rH odada 250 rpm'de bakteri büyümek.
  6. 1 mL 1 M izopropil β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) protein ifade ikna etmek için P1000 pipet kullanarak ekleyin.
  7. Medya bir 37 ° C ve % 0 rH odada 250 rpm'de shaker üzerinde gece bırakın.
  8. Medya shaker ertesi sabah ve santrifüj 1000 ml'lik şişe de 20,621 × g 4 ° C'de 1 h için hücreleri hasat için kullanarak kaldırın.
  9. Süpernatant atın ve hücre Pelet toplamak.
    1. Süpernatant yaklaşık 5 mL bakterileri öldürmek için çamaşır suyu ile bir şişe içine dökün. Bu atık.
    2. Santrifüj şişe altındaki hücre Pelet scrape ve Pelet 50 mL santrifüj tüpüne koymak için bir spatula kullanın.

3. Qβ arınma

  1. Hücre Pelet ~ 20-30 ile resuspend mL 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00).
  2. Resuspension yok parçalar olduğundan emin olun ve bir microfluidizer işlemci üreticisinin protokolüne göre kullanarak hücreleri parçalayıcı ( Tablo malzemelerigörmek). Parçacıklar verimini artırmak için en az iki kez hücreleri parçalayıcı.
  3. Lysate 20,621 x g de 250 mL santrifüj şişelerde 4 ° C'de 1 saat için santrifüj kapasitesi
  4. Pelet atın ve süpernatant ml hacmi ölçmek. Bu değeri 0.265 tarafından çarpar ve bu miktarın g amonyum sülfat süpernatant için.
  5. En az 1 h protein çökelti 200 devirde heyecan tabakta için 4 ° C'de karıştırın.
  6. 20,621 x g 4 ° C'de 1 h için 250 mL şişe santrifüj kapasitesi
  7. Süpernatant atın ve Pelet yaklaşık 10 mL 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) ile resuspend.
  8. 1:1 kloroform/n-butanol eşit miktarda ham örnek için vortexing tarafından bir kaç saniyeliğine ekleyip karıştırın.
  9. 4 ° C'de 30 dakika 20,621 × g de 38 mL tüpler santrifüj kapasitesi
  10. Pasteur pipet kullanarak üst sulu katmanı yeniden elde etmek. Sulu ve organik katmanı arasında kurdu tabaka gibi jel almak değil dikkatli olun.
  11. Altı % 5-40 önceden yapılmış sükroz degradeler çözülme ve 2 mL her ekstresinin yükleyin.
  12. Ultracentrifuge 99,582 x g ücretsiz yavaşlama ile 4 ° C'de 16 h için de.
  13. Bir ışık yayan diyot (LED) ışık her tüpün altında Parlatıcı ve bir mavi bant görünür olmalıdır. Bu parçacıklar uzun iğne şırınga ile yeniden elde etmek.
  14. Ultrapellet 370,541 x g 4 ° C'de 2,5 h için parçacıklar
  15. Süpernatant atın ve 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) ile arıtılmış parçacıkların şeffaf Pelet resuspend.

4. miktar ve ürün onayı

  1. Bradford tahlil ürün13ölçmek için kullanın.
  2. Polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ürün14onaylamak için çalışma azaltılması ve sigara azaltılması Sodyum Lauryl Sülfat.
    Not: SDS-sayfa azaltarak kat protein molekül ağırlığı onaylamak için kullanılır; Sigara azaltılması-SDS-sayfa daha yüksek sipariş yapısı emin olmaktır.

5. Qβ DB bileşikler conjugating

  1. Disulfides Qβ üzerinde azaltmak.
    1. 0.0020 gram dissolve tris(2-carboxyethyl) fosfamin (TCEP) 1 mL 100 x hisse senedi çözüm yapmak Ultrasaf Su içine.
      Not: azaltma önce taze TCEP hazırlayın.
    2. Qβ (5 mg/mL) 200 µL microcentrifuge tüp içine ekleyin.
    3. 100 x TCEP hisse senedi çözüm 20 µL ekleyerek izleyin.
    4. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  2. Azaltılmış disülfür dibromomaleimide Polietilen glikol (DB-PEG) kullanarak yeniden köprü.
    1. 0.0017 g dibromomaleimide-Polietilen glikol (DB-PEG) DMF 100 µL geçiyoruz.
    2. 10 mM sodyum fosfat çözüm (pH 5,00) 680 µL ekleyin.
    3. Qβ DB-PEG çözüm içine azaltılmış ekleyin ve karıştırma işlemi bir 365 nm UV lambası altında gözlemlemek. Parlak sarı floresan lambalı karıştırma üzerine bir 365 nm el UV hemen görüntülenmeyecektir.
    4. Gecede bir et lokantası (RT) Oda sıcaklığında devam tepki ver.
  3. Santrifüj filtre tarafından tepki karışımı arındırmak (COMW = 10 kDa) üç kez 1 x PBS de 3,283 x g 4 ° C'de 20 dk için kullanma
  4. Konjugasyon olmayan-SDS-sayfa ve yerel özel jel elektroforez azaltarak monitör.
    Not: Yerel özel jel sağlam parçacıklar olarak VIP çalıştırın ve onların ücret, boyutu ve şekli bağlı ayrılır.

Sonuçlar

Dibromomaleimide türevleri ile yoğunlaşma tepki dibromomaleimide anhidrit ve Birincil aminler15arasında sentez. Alternatif olarak, N-methoxycarbonyl aktif 3,4-dibromomaleimide kullanarak bir hafif sentetik yöntemi16 burada methoxypolyethylene glikol (PEG) için verim DB-PEG (Şekil 1) ile tepki tarafından istismar edildi. NMR Bileşik yapı (Şekil 2) tanımlamak için kullan?...

Tartışmalar

Daha küçük protein arıtma için karşılaştırıldığında, bakteriyofaj Qβ arındırıcı bir benzersiz sükroz degrade Santrifüjü adımdır. Kloroform/n-butanol ayıklama adım sonra Qβ daha fazla % 5-40 sükroz degradeler kullanarak saf. Santrifüjü sırasında parçacıklar kendi boyutları göre ayrılır. Daha küçük partiküller daha düşük yoğunluklu bölgede kalırken daha büyük partiküller yüksek yoğunluk bölgesine seyahat. Qβ için geçişin üçüncü alt seyahat ve daha küçük protei...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

J.J.G. verdikleri destek için Ulusal Bilim Vakfı (DMR-1654405) ve kanser önleme Araştırma Enstitüsü of Texas (CPRIT) (RP170752s) kabul eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth (Miller) EMD Millipore1.10285.0500
Tryptone, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Yeast Extract, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfateP212121CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-10
Potassium ChlorideFisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification SystemFisher Scientific4474524
Potassium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP362-1
Potassium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificP288-500
SucroseFisher ScientificS25590B
EthanolFisher ScientificBP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor Fisher Scientific096-041053
Ammonium SulfateP212121KW-0066-5KG
ChloroformAlfa Aesar32614-M6
1-ButanolFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, AluminumBeckman Coulter342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,Beckman Coulter337922
Coomassie (Bradford) Protein AssayFisher ScientificPI23200
TRIS HydrochlorideResearch Products InternationalT60050-1000.0
TetramethylethylenediamineAlfa AesarJ63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma AldrichC4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97%Sigma Aldrich553603-5G
Polythylene GlycolAlfa Aesar41561-22
Sodium PhosphateFisher ScientificAC424375000
Acrylamide/bis-AcrylamideP212121RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfateSigma AldrichL3771-100G
Ammonium PersulfateFisher ScientificBP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscopeOlympus FV3000 
Labnet Revolver Adjustable Rotator Thomas Scientific 1190P25 
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap Thermo Scientific010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene CopolymerThermo Scientific3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PCThermo Scientific3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty RimPyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitsMillipore SigmaUFC801024
M-110P Microfluidizer Materials ProcessorMicrofluidicsM-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge TubesThermo Scientific3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, PolycarbonateBeckman Coulter41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mLPolyLab80005
533LS-E Series Steam SterilizersGetinge533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with LidLabSourceD36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubeFisher Scientific14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mLFisher Scientific05-408-129
VWR Os-500 Orbital ShakerVWR Scientifc Products14005-830
Tetra Handcast systemsBio-Rad1658000FC
Polypropylene, 250 mLBeckman Coulter41121703
Spectrofluorometer NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Long Needle Hamilton 7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilsonF144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory BalanceIntelligent Weighting TechnologyIWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubeFisher Scientific14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µlBio-Rad456-1084

Referanslar

  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
  3. Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
  4. Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
  5. Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
  6. Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
  7. Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
  8. Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
  10. Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
  11. Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
  12. . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
  13. Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
  14. Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
  15. Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
  16. Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
  17. Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksorunu 135Nanomalzemelervir s gibi par ac klarbakteriyofaj Q Qbetafunctionalizing capsidsfloresanbioconjugation tepkidibromomaleimide t revleriPolietilen glikol PEG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır