Aislamiento y la incorporación de recolección de luz las antenas de la diatomea Cyclotella Meneghiniana en liposomas con lípidos de tilacoides

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar fucoxantina clorofila/c proteínas de unión (FCP) de diatomeas y los incorpore a liposomas con composiciones de lípidos naturales para el estudio de transferencia de energía de excitación a cambios en la composición de iones.

Resumen

El desempeño fotosintético de las plantas, algas y diatomeas depende en la regulación rápida y eficiente de la luz cosecha energía y procesos de transferencia en la membrana de los tilacoides de los cloroplastos. Transferencia eficiente a la reacción fotosintética centros así como en cuanto a la fotoprotección de la luz excesiva y la luz cosecha antena de diatomeas, el llamado fucoxantina clorofila/c proteínas de unión (FCP), son necesarios para la absorción de la luz. El interruptor entre estas dos funciones es una cuestión de muchos años de investigación. Muchos de estos estudios se llevan a con FCP en micelas de detergente. Estudios de interacción, se han eliminado los detergentes, que condujo a una agregación inespecífica de los complejos FCP. En este enfoque, es difícil discriminar entre artefactos y datos fisiológicamente relevantes. Por lo tanto, puede obtenerse información más valiosa acerca de la FCP y otra luz de membrana destino cosecha complejos mediante el estudio de las interacciones proteína-proteína, transferencia de energía y otras características espectroscópicas si están integrados en su entorno nativo del lípido. La principal ventaja es que los liposomas tienen un tamaño definido y una proporción de lípidos/proteínas definidas por el cual se controla el grado de clustering de FCP. Además, fácilmente se pueden simular cambios en la composición de pH y de iones que regulan la luz en vivo . En comparación con la membrana de los tilacoides, los liposomas son más homogénea y menos compleja, que resulta más fácil obtener y entender datos espectroscópicos. El protocolo describe el procedimiento de aislamiento de FCP, purificación, preparación de liposomas e incorporación de FCP en liposomas con composición lipídica natural. Resulta de una aplicación típica se da y se discuten.

Introducción

Organismos fotosintéticos tales como diatomeas deben lidiar con condiciones de luz cambiantes y responder con mecanismos sofisticados de aclimatación que mantener alta eficiencia fotosintética y protegen de daño foto-oxidativo causado por la luz excesiva. Un importante proceso de luz protectora en eucariotas fotosintéticos es la alta energía amortiguamiento (q_E) de la luz absorbida que se presenta como la principal contribución a la Temple no fotoquímica (NPQ) bajo condiciones de estrés ligero^{1,2 ,3}. Los complejos antena cosecha luz (LHC) están implicados en la regulación de vías de transferencia de energía de excitación. En respuesta a la luz alta inducida por el bajo pH en el lumen del cloroplasto, los interruptores del sistema de antena de la cosecha de estado al estado apagando la luz. Este estado disipativo de energía protege fotosistemas (PS) y otros complejos en la membrana del thylakoid de la foto-oxidación. En eucariotas fotosintéticos, q_E es generalmente inducida por dos factores^1,2,3. Un factor es la luz especializada recolección proteína que responde a bajo pH. La proteína subsidiarios induce la q_E en las plantas superiores⁴. LhcSRs⁵, modulado por la actividad de subsidiarios, inducir la q_E en algas verdes⁶. Las diatomeas poseen Lhcx-como proteínas relacionadas estructuralmente con LHCSRs^7,8,9,10.

El segundo factor de q_E es el ciclo de la xantofila donde los carotenoides de la antena son convertidos en forma de foto protección de-epoxidación y revertidos por epoxidación. En plantas y algas verdes, violaxantina se convierte en zeaxantina. En diatomeas, diadinoxanthin se convierte en diatoxanthin, que luego se correlaciona con el grado de NPQ¹¹. La luz de la diatomea cosecha antena posee algunas peculiaridades aunque es evolutivo relacionado con plantas y algas LHCs. El interruptor de la luz cosecha a fotoprotección es enormemente rápido y la capacidad NPQ es superior comparada con las plantas¹². Esta podría ser una razón por la cual las diatomeas muy exitosas en diferentes nichos ecológicos de manera que son responsables de hasta un 45% de la producción primaria neta oceánico¹³. Por lo tanto, luz cosecha sistemas de diatomeas son un interesante objeto de investigación de la fotosíntesis.

Diatomeas, como las centradas en especies de Cyclotella meneghiniana, poseen tilacoides luz intrínseca cosecha sistemas nombrados después de los pigmentos unen - fucoxantina, clorofila (chl) a y c, por lo tanto luz FCP. recolección de proteínas, como la FCPs, son incrustado en el sistema de membranas de tilacoides que comprende varias capas de membrana. Las diatomeas forman bandas de tres tilacoides. Este complejo situación dificulta estudiar en el nivel molecular en la membrana de los tilacoides. Además, muchos componentes contribuyen a la regulación de la luz cosecha (véase arriba). Por lo tanto, en muchos enfoques, los complejos fueron aislados de la membrana usando detergentes suaves, tales como n-dodecil-β-D-maltopyranoside (β-DDM), que solubilizan la membrana pero mantener intacto los complejos FCP. Se realizaron muchos estudios espectroscópicos uso FCP solubilizado para investigar energía intramolecular transferencia^14,15,16,17. Sin embargo, este enfoque anterior era limitada ya que la regulación de la transferencia de energía necesita interacción excitonic con otros complejos de antena o fotosistemas. Por lo tanto, este tipo de estudios no se puede realizar con complejos solubles debido a la interacción entre complejos se pierde.

Una característica importante en la regulación de la antena es la "apretadura molecular" de la antena y fotosistemas en la membrana tilacoides del¹⁸. Anteriormente, se llevó a cabo un enfoque simple para simular este efecto en vitro. El detergente fue quitado, que conduce a la agregación aleatoria de complejos antena. Aunque se obtuvieron algunos datos razonables por este enfoque^17,19, detergente no refleja la situación en vivo y tiene algunas limitaciones ya que los complejos no están interactuando en los terciarios regulares estructura.

El uso de liposomas supera varias de las limitaciones anteriores. La estructura terciaria sigue siendo totalmente intacta. La membrana del liposoma proporciona un entorno cuasi-nativo para los complejos de antena. La membrana separa el interior de la liposoma del ambiente exterior. Por estos medios, liposomas proporcionan dos compartimientos de la reacción para estudios de gradientes de iones y pH, así como por procesos de transporte. Además, pueden controlarse más fácilmente los parámetros del sistema experimental de estudios de la membrana del thylakoid. Liposomas ya fueron demostrados para ser una excelente herramienta para el estudio de complejos fotosintéticos. Un enfoque principal en el pasado fue en la planta donde se probó el efecto de la composición lipídica alterada en LHC II²⁰LHC. En otros enfoques, interacción de la proteína-proteína entre diferentes LHC II fueron investigados²¹. También, algunos en algas verdes se realizaron estudios que describen la agrupación espontánea entre el LHC²². Considerando la importancia de las diatomeas para los ecosistemas acuáticos, relativamente pocos estudios se realizaron con los complejos antena de diatomeas. Dos estudios investigaron los complejos antena de la centrada en la Cyclotella meneghiniana, donde se muestra el agrupamiento de la FCP antena²³ y capacidad de respuesta de FCP a gradientes electroquímicos²⁴ . Así, los liposomas son una excelente herramienta para el estudio de diatomeas antenas y su interacción y regulación en condiciones casi nativas. Los liposomas son versátiles desde muchas condiciones tales como la composición de lípido, liposomas tamaño, densidad de la proteína y la fase acuosa circundante puede ser controlada. Además, el método requiere pequeñas cantidades de muestras. El sistema experimental es robusto y altamente reproducibles. Permite la compartimentalización de liposomas para el estudio de pH y los gradientes de iones, que son importantes factores en la regulación de los complejos antena.

Aquí, describimos el aislamiento de complejos de antena FCP de C. meneghiniana y su incorporación en los liposomas con composición de lípido natural tilacoides. También, proporcionamos datos ejemplares para la caracterización espectroscópica de FCP solubilizado y compararlos con FCP en liposomas. El método resume conocimientos y protocolos estandarizados de las mejoras de Gundermann y Büchel 2012²³, Natali et al 2016²²y Ahmad y Dietzel 2017²⁴.

Figura 1: representación esquemática del flujo de trabajo. (1) se refiere al párrafo 1 que describe el crecimiento celular, desorganización y aislamiento de tilacoides con la siguiente separación de FCP en gradientes de densidad de sacarosa; M. C. -Células deCyclotella meneghiniana . (2) preparación de la mezcla de lípidos naturales tilacoides (MGDG, DGDG y SQDG) había descrito en el párrafo 2 y creación de micelas de detergente de lípidos con octylglycoside (OG). Se consigue un tamaño de micela de lípidos definidos por extrusión utilizando membranas de diámetro de poro definido. FCP y lípido micelas se unifican en un lípido predefinido: relación y los detergentes OG y β-DDM son quitado vía controlado diálisis formando proteoliposomes FCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Nota: Complejos fotosintéticos como FCPs son altamente vulnerables a la luz y el calor. Trabaje siempre en el hielo y bajo una luz muy tenue.

1. aislamiento de FCP de células

1. Aislamiento de tilacoides de las células C. meneghiniana
   1. Crecer meneghiniana C. en cinco matraces de 500 mL que cada una llena con 300 mL de medio de ASP^23,25 y 50 millones de células. Conecte los matraces con un tapón de algodón y permita que las células a crecer hasta la fase de crecimiento exponencial durante aproximadamente una semana en un agitador a 120 rpm con una 16 h luz y fase oscura 8 h 40 μmol photons/(m²s) blanca luz y una temperatura entre 15-18 ° C. Verifique que el numero de celular es entre 1,5 millones de células/mL con una cámara del contador de célula.
   2. Centrifugar las células a 4.000 x g en un rotor preenfriado con frascos de 500 mL centrífuga (4 ° C) durante 15 minutos en una centrifugadora de alta velocidad. Resuspender el pellet celular en 12 mL de buffer de homogenización (HB, tabla 1) mediante pipeteo.
      1. Transferir la suspensión a un tubo de plástico de 50 mL solo. Almacenar las muestras a-80 ° C o proceda al paso 1.1.3.
   3. Pre-enfriar el molino de grano y el equipo. Llenar el vaso de precipitados de 50 mL del molino de grano hasta un 75% con una mezcla de grano de cristal y añadir la suspensión de células. Para la interrupción de la célula, utiliza pulsos de 7 x 45 s a toda velocidad con 30 s de enfriamiento entre cada pulso. Tomar 20 μl de células interrumpidas por los controles de calidad en el paso 1.1.6.
   4. Filtrar las células interrumpidas sobre un embudo de filtro de cristal y lavado vertiendo la HB en los granos de cristal hasta que aparezcan claros. La fracción de lavado con el filtrado de la piscina. Mantener el volumen final menor de 150 mL.
   5. Centrifugar la muestra durante 15 min a 140 x g utilizando tres tubos de plástico de 50 mL para que sedimenten los restos celulares. Transferir el sobrenadante a viales de 20 mL policarbonato ultracentrifugación y descartar el precipitado.
      1. Llenar los frascos con HB, equilibrar el peso y centrífuga de un rotor adecuado para 1 h en 300.000 x g y 4 ° C para que sedimenten las membranas tilacoides.
   6. Utilizar el tiempo de centrifugación para comprobar la proporción de células interrumpidas por microscopia con 400 aumentos con la 20 μl de muestra en 1.1.3. Calcular la relación libre de cloroplasto cloroplasto que contiene frustules (conchas de sílice).
      Nota: Las paredes celulares de diatomeas están hechas de sílice, que es visible como altamente diffracting la sustancia en el microscopio. Cloroplastos que ocurren puntos como verdes deben han sido liberados de las células si trabajó la interrupción de la célula.
   7. Resuspenda el sedimento de membrana con buffer de lavado poco como sea posible (0.5-1 mL) con pincel de un pintor pequeño. Llene los frascos de la ultracentrifugación de policarbonato lavado tampón (tabla 1), equilibre su peso y centrifugar durante 20 min a 200.000 x g a 4 ° C.
      1. Vuelva a suspender las membranas lavadas con cepillo de pintor. Añadir tampón de lavado sólo si es necesario para mantener la concentración de tilacoides más alta posible. Los tilacoides en frasco (15 mL) de una muestra de la piscina.
   8. Pre-diluir las muestras con 10 μl de la muestra de 90 μl de acetona al 100%. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten los precipitados de la proteína. Tomar 10 μl de la dilución y se mezcla con 990 μl de acetona al 90%.
      1. Medir la absorbancia (ABS) de clorofila a y c a 664 nm y 630 nm en acetona al 90%. Reste el ABS_750nm de ambos valores. Determinar el contenido de clorofila total usando la siguiente fórmula:²⁴
         1)
         2)
   9. Alícuotas tilacoides en porciones de 0,5 mg de clorofila total en un tubos de reacción de 1,5 mL, congelar en nitrógeno líquido y almacenarlas a-80 ° C hasta su uso posterior.
2. Separación y concentración de complejos FCP
   1. Preparar una solución de gradiente de sacarosa y llenar los tubos de la ultracentrífuga hasta la parte superior menos el volumen de carga (300 – 500 μl). Se congelan los tubos a-20 ° C hasta que estén completamente congelados. Permita que los tubos descongelar a + 4 ° C, que toma 3-4 h de un tubo de 17 mL.
      1. Repetir el ciclo de congelación-descongelación dos veces para refinar el gradiente para la mejor resolución.
   2. Utilizar las muestras obtenidas en 1.1.9 correspondientes a 0,5 mg de clorofila y ajustar con el almacenador intermediario B1 (tabla 1) hasta un volumen final de 2 mL. Para la solubilización, añadir n-dodecil-β-D-maltopyranoside (b-DDM) a una concentración final de 20 mM.
      1. Invertir el tubo 3 veces y coloque en hielo por 20 min con agitación suave para evitar la espuma. Centrifugar durante 5 min, a 12.000 x g en una centrífuga de mesa previamente enfriado a + 4 ° C.
   3. El sobrenadante en el gradiente de carga. No cargue más de 125 μg de clorofila total por gradiente si se utilizan frascos de 17 mL. Centrífuga de 22 h a 100.000 x g y + 4 ° C.
      1. Recuperarse las fracciones deseadas de FCP marrón degradado utilizando una jeringa (figura 2A). Tomar la alícuota de 5 μl y diluirlo con 995 μl de B1a.
   4. Medir el espectro de absorbancia (ABS) entre 370-750 nm en un espectrofotómetro UV-VIS. Utilizar cubetas semi-micro vidrio óptico.
      1. Abra el software de administrador de espectros, modo de espectro y registrar una línea base de 370 a 750 nm seguido por medidas de muestra. Utilice la siguiente configuración: scan velocidad, 200 nm/min; campo de datos, 0,5 nm; respuesta, medio.
   5. Medir el volumen de la muestra recuperada con una micropipeta. Lave los complejos FCP añadiendo dos veces el volumen recuperado con tampón de B1 (tabla 1). Se concentran en un concentrador de membrana con un corte a 1.000 x g y + 4 ° C a un ABS_672nm de al menos 20 kDa 30.
      Nota: La concentración de b-DDM podría aumentar debido al enriquecimiento de la micela en el compartimiento de muestra. ¡Esto podría llevar a la mayor solubilización de los complejos FCP! Evitar exceso de solubilización mediante la adición de detergente búferes libres B1 si lava más pasos son necesarios para extraer la sacarosa residual.
   6. Tomar la alícuota para los controles de 20 μl. Descarga congelar las muestras en nitrógeno líquido y almacenarlas a-80 ° C.

Figura 2: purificación de FCP, controles espectroscópicos y comprobar pureza. (A) aspecto típico de un gradiente de densidad de sacarosa después de la centrifugación durante la noche. Todas las bandas de color marrón contienen la piscina FCP consisten en pigmentos FCPa y FCPb.. - pigmentos, PS - espectros de absorción (B) de fotosistemas de FCP antes (línea azul) y después de concentración (línea naranja discontinua) con dispositivos de filtro centrífugo de 30 kDa de corte . Particularmente, los carotenoides son propensos a la pérdida de la FCP, que daría como resultado menor absorbancia en la región entre 500-550 nm. Los gráficos se normalizan para la clorofila Q_y máximo a ~ 670 nm. Espectros de emisión de clorofila a (C) con excitación de chl c (465 nm) para las pruebas de la transferencia de energía de excitación funcional. Si la transferencia de energía de chl c a chl a es obstaculizado, una banda de fluorescencia adicional en ~ 640 nm (chl c) tendría lugar. Los gráficos se normalizan para la emisión máxima. (D) espectros de excitación grabado en 675 nm (chl una fluorescencia máxima) para probar la transferencia de energía a chl un de los pigmentos de absorción entre 370 nm y 600 nm. Si la transferencia de energía a chl a es menos eficiente, lo que disminuiría el rendimiento de fluorescencia especialmente entre 465 y 550 nm. Los gráficos se normalizan al máximo alrededor de 440 nm. Los espectros (B), (C) y (D) son casi idénticos si la concentración funcionó bien. (E) Compruebe la pureza de la FCP aislada usando un gel Tris-Tricina del²⁸. FCPa y FCPb tienen subunidades entre 18-19 kDa. Todas visibles plata-manchados las proteínas más grandes que 20 kDa son contaminantes. Thyl. -Tilacoides haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Controles basados en gel y espectroscópicos
   1. Registre la absorbancia entre 370-750 nm de 5 μl de FCP en 995 μl de B1a después paso 1.2.5. Compararlo con el espectro obtenido en el paso 1.2.4. Utiliza la misma instrumentación y configuración como se describe en el paso 1.2.4.
      1. Exportar datos a *.csv e importar los datos en una hoja de cálculo. Normalizar ambos espectros hasta el máximo de chl un en la banda_y Q unos 672 nm como se muestra en la figura 2B.
   2. Calcular el factor de dilución de las muestras del paso 1.2.4 y 1.3.1 dividiendo la medida ABS_672nm de la deseada ABS_672nm de 0.03. Diluir las muestras en consecuencia con B1a para cubetas de vidrio especial de la fluorescencia.
   3. Grabar chl un espectro de emisión de fluorescencia con un spectrofluorometer a revelar la transferencia de energía de la luz intacta de chl c a chl (figura 2).
      1. Utilizar el software de espectrómetro y vaya al modo de medición de espectro con los siguientes parámetros: modo, emisión; corte ancho excitación y emisión, 3 nm; sensibilidad, medio; velocidad de escaneo, 100 nm/min; campo de datos, 0,5 nm; longitud de onda de excitación, 465 nm; emisión, 600-800 nm. Realizar AUTOCERO y medida.
   4. Registrar espectros de excitación con la misma muestra y equipos para la transferencia de la energía intacta de todos los pigmentos a chl (Figura 2D). Cambiar configuración: modo, excitación; longitud de onda de emisión, 675 nm; excitación, 370-600 nm. Registrar los espectros.
      1. Corregir con un espectro de rodamina en el mismo rango de propiedades espectrales de la luz – cf. instrucciones en el manual del usuario.
   5. Las muestras de mezcla FCP corresponde a 1 μg de chl una con 10 μl de tampón de carga SDS. Incubar 10 min a 25 ° C. Centrifugar durante 5 minutos a 12000 x g en una centrífuga de mesa.
      1. Cargar el sobrenadante en un Tris-Tricina gel²⁸. Separadas por 2 h a 150 V y plata mancha lo después de los⁴⁰de la separación.
         Nota: Las subunidades FCP separan en dos bandas prominentes de proteína entre 18-19 kDa, que son constituyentes de la FCPa y FCPb²⁹ (Figura 2E).

2. preparación de liposomas e incorporación de FCP

1. Preparación de la mezcla de lípidos y micelas de detergente de lípidos
   Nota: lípidos son susceptibles a las cálidas temperaturas combinadas con condiciones oxidativas. Trate de mantener los lípidos refrigerados y bajo atmósfera de N₂ .
   1. Calcular las proporciones de lípidos tilacoides deseada para C. meneghiniana según Vieler et al. 2007³⁰. Consulte el ejemplo en suplementales tabla 1. Preparar el lípido soluciones recomendadas por el fabricante en un contenedor de prueba solvente.
   2. Pipetear la cantidad deseada de lípidos en un tubo de ensayo 2 mL y evaporar el cloroformo utilizando un flujo suave de nitrógeno y tratar de difundir los lípidos sobre el área entero de la base del tubo. Que el flujo de₂ N hasta que se evapora el solvente todos.
   3. Solubilizar la mezcla de lípidos en 29 μl de solución de β-D-glucopyranoside de n-octilo (OG) a 4 ° C por 4 h. Incubar la mezcla de lípidos durante 10 minutos a 30 ° C. Incubar los lípidos en un baño sonicador para 3 x 3 min a 25 ° C interrumpido por 30 s en el hielo.
      1. Añadir 221 μl de tampón tricino y 250 μl de buffer de diálisis de 4 x.
   4. Utilizar una extrusora con membranas de policarbonato de 0,1 μm para el de 50-70 nm de diámetro definido liposoma. Montar la extrusora con el apoyo de membrana y filtro. Evitar las burbujas de aire y apriete el conjunto de fondo.
   5. Llene una jeringa con buffer de diálisis de 4 x y Humedezca previamente el estirador hasta que las burbujas no se pueden ver en la segunda jeringa.
   6. Aplicar las micelas de detergente de lípidos a la extrusora y presione la solución de una jeringa al otro adelante y atrás. Repita este paso 5 veces hasta que la solución aparece homogénea.
      Nota: Esta solución puede conservarse a 4 ° C durante varios días. ¡No lo congele!
2. Incorporación de complejos FCP y eliminación de detergentes y agregados
   Nota: En este ejemplo utilizamos un lípido/chl la proporción 12:1, que corresponde a una relación proteína/lípidos de aproximadamente 100: 1.
   1. Añadir FCP igual a 20 μg de chl una en un volumen total de 500 μl de tampón de B1a a 250 μL de las micelas de lípidos extruidas y 250 μl de buffer de diálisis 4. Incubar las muestras por 3 x 3 min a 25 ° C en un Termomezcladores a 1.500-3.000 rpm interrumpido por una pausa 30 de s sobre el hielo.
   2. Cortar la tapa del tubo de reacción de 1,5 mL cuatro justo debajo de la parte superior dando un anillo que todavía cabe en la tapa. Preparar piezas de 1,5 cm x 1,5 cm de la membrana de diálisis y lávelos con 20 mL de buffer de diálisis x 1
   3. Llenar 250 μl de la muestra para cada tapa. Cuidadosamente, coloque la membrana sobre la tapa para que el compartimiento se llena completamente con la muestra y sin burbujas de aire se producen. Apriete el anillo del tubo de reacción en la Asamblea con el fin de tener un compartimento cerrado.
   4. Dializan las muestras en 50 mL de 1 x de buffer de diálisis durante la noche (12-16 h) en el hielo en una coctelera de agitación. El buffer de diálisis usado con uno nuevo y se añade 7 mg de adsorbente granos para quitar los restos de detergente durante al menos 6 h.
   5. Vuelva a colocar el buffer de diálisis y dializarse para otro 12 h. recuperar los liposomas por la perforación de la membrana de diálisis con una punta de micropipeta de 200 μl y aspirar los liposomas de la tapa del tubo de reacción.
   6. Paso opcional: si de alta pureza (> 95%) es necesario. Preparar un gradiente de densidad discontinuo en 17 mL frascos de ultracentrifugación con pasos que contiene copolímero epichlorhydrin de sacarosa 6%, 10%, 15% y 20% en buffer de diálisis. Los liposomas y ultracentrífuga a 100.000 x g durante 4 horas en un rotor que hace pivotar del cubo de la carga.
      1. Recuperar la banda superior de color marrón con una jeringa, diluir la muestra 1:5 con DP y proceder al siguiente paso.
   7. Centrifugue los liposomas FCP en al menos 2 mL de 1 x de buffer de diálisis durante 1,5 h a 100.000 x g a 4 ° C. Recuperar los liposomas girando el tubo de centrífuga en un ángulo de 45°. Permita que los liposomas para abajo durante 1 minuto (Figura 3A).
   8. Recuperar los liposomas FCP en un volumen final de 25-50 μl. evitar perturbar el precipitado.
3. Controles 1: absorbancia, espectroscopia de fluorescencia
   1. Añadir una alícuota de 3 μl de los liposomas de FCP a un volumen final de 1 mL de 1 x de buffer de diálisis y centrifugar durante 5 min a 12.000 x g.
      1. Registre la absorbancia entre 370 y 750 nm de FCP-liposomas con el mismo equipo como se describe en 1.2.4. Normalizar el espectro al máximo en la región_y de Q de chl un (670-680 nm) y se compara con el espectro normalizado de FCP solubilizado (figura 3).
   2. Preparar liposomas FCP en 1 mL de DP con una absorbancia (ABS) = 0.03 con respecto a la máxima entre 670-680 nm. Ajustar la FCP solubles en detergente de paso 1.2.6 el mismo ABS diluir con B1a.
   3. Registrar los espectros de absorbancia de ambas muestras como se describe en 1.2.4. Grabar chl un espectro de emisión de fluorescencia de ambas muestras como se describe en 1.3.3.
      Nota: El rendimiento de fluorescencia está disminuido en la muestra de FCP-liposoma (figura 3D y CF. discusión.)

Figura 3: aislamiento de FCP proteoliposomes seguido por controles espectroscópicos y proyección de imagen confocal. (A) recuperación de liposomas FCP después de la centrifugación. Gire el tubo de centrifugación a 45° y espere aproximadamente 1 minuto, los liposomas se moverá hacia abajo mientras que el FCP agregados que no están incorporados en liposomas se adhieren a la pared del tubo. (B) comparación de espectros de absorbancia de FCP solubles en detergente (azul) y FCP en liposomas (naranja) (C) los mismos espectros como en (B) normalizaron a chl un máximo en la región roja (~ 670 nm - Qy pico); FCP solubles en detergente (azul) y FCP en liposomas (naranja). Potencialmente, podría haber una pérdida de pigmento principalmente de carotenoides visible en la región de 500-550 nm. El agrupamiento de FCP en los liposomas puede conducir a una ampliación de pico y un cambio leve de la chl un máximo (~ 670 nm) al rojo. (D) espectros de emisión de FCP solubles en detergente y FCP en liposomas. Agrupamiento de FCP en el liposoma mejora energéticas interacciones de complejos FCP que baja el rendimiento de fluorescencia (curva naranja) y cambia los máximos de emisión ligeramente al rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

El protocolo describe el aislamiento de la fracción total de FCP de Cyclotella meneghiniana e incorporación de liposomas con composición de lípido nativo. El aislamiento de thylakoid es altamente reproducible, pero puede cambiar el rendimiento de tilacoides. El resultado es aceptable si más del 50% de todos los pigmentos son recuperado en el paso 1.1.4. Más del 80% es óptima.

La solubilización de los tilacoides ...

Discusión

Liposomas FCP con la composición de lípido natural proporcionan una herramienta práctica, simple y reproducible para investigar propiedades espectroscópicas in vitro. El medio lipídico en liposomas FCP se asemeja a la situación dentro de la membrana del thylakoid, dando lugar a resultados experimentales que están más cercanos de las condiciones naturales.

Hay varias ventajas de utilizar meneghiniana C. como sistema modelo para antena FCP. Crece relativamente rápido y...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 ml centrifuge vials
high speed centrifuge	Heraeus
Bead Mill VI 2	Edmund-Bühler (edmund-buehler.de)		newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6
Silibeads S 400 µm	Sigmund-Lindner.com	5223-7
Silibeads S 1,-1,3 mm	Sigmund-Lindner.com	4504
VitraPOR filter funnel - por1	ROBU GmbH	21121
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	314348
Ultracentrifuge Discovery 90SE	Sorvall	n.a.
rotor T 865	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	51411
Neubauer Cell Counter Chamber (improved)	Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)	T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7)	Optik-Pro (optik-pro.de)	51428
optical glass cuvettes (6040-OG)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	"6040-10-10"
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)	Jasco (jasco.de)	V-630
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	D310LA
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	344061
rotor AH629-17-mL	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	54285
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff	Millipore (merckmillipore.com)	4307
Biometra Minigel-Twin	Analytik Jena AG (analytik-jena.de)	846-010-100
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad (bio-rad.com)	1610449
libre office spread sheet	The document foundation	https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	101-10-20
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)	Jasco (jasco.de)	FP-6500
SDS-loading buffer Roti-Load	ROTH (carlroth.com)	K929.1
n-octyl β-D-glucopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	O311
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1300	make stock solution in chloroform
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1310	make stock solution in chloroform
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1230	make stock solution in chloroform
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)	Larodan AB (larodan.com)	37-0150	make stock solution in chloroform
L-α-Phosphatidylcholine	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	P3782 SIGMA	make stock solution in chloroform
sonicator bath S-50TH	Sonicor (getmedonline.com	SONICOR-S-50TH
mini-Extruder	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610000
Nuleopore polycarbonate membrane	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610005
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff	ROTH (carlroth.com)	0653.1	boil in destilled water before use
Biobeads SM2 Adsorbent	Biorad (Bio-rad.com)	152-3920
sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	F4375
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	252150
rotor TFT 80.4	Millipore (merckmillipore.com)	54356
material listed in order of appearance			For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. Standard lab material and substances are not listed.