Un tronco pulmonar las bandas modelo de sobrecarga de presión inducida por el fracaso y la hipertrofia Ventricular derecha

Resumen

Presentamos un método quirúrgico para inducir hipertrofia ventricular derecha y el fracaso en ratas.

Resumen

Falta ventricular correcta (RV) inducida por sobrecarga de presión sostenida es un contribuyente importante a la morbilidad y mortalidad en varios desordenes cardiopulmonares. Confiables y reproducibles modelos animales de insuficiencia RV por lo tanto, están garantizados para investigar mecanismos de la enfermedad y los efectos de posibles estrategias terapéuticas. Anillado del tronco pulmonar es un método común para inducir la hipertrofia aislada de RV, pero en general, los modelos anteriormente descritos no han tenido éxito en la creación de un modelo estable de RV hipertrofia y falla.

Presentamos un modelo de rata de presión sobrecarga inducida por RV hipertrofia causada por el tronco pulmonar (PTB) de bandas permite que diferentes fenotipos de la hipertrofia de RV con y sin falta de RV. Utilizamos un aplicador de clips adherente modificado para comprimir un clip de titanio alrededor del tronco pulmonar a un diámetro interno preestablecido. Utilizamos diámetros diferentes de clip para inducir diferentes etapas de progresión de la enfermedad de la leve hipertrofia de RV a insuficiencia descompensada de RV.

Hipertrofia de RV se convierte constantemente en ratas sometidas al procedimiento de PTB y dependiendo del diámetro del clip bandas aplicado, podemos reproducir con precisión las gravedades diversas enfermedades desde hipertrofia compensada a RV descompensada severa falta con manifestaciones extra cardíacas.

El modelo PTB presentado es que un modelo válido y sólido de la sobrecarga de presión inducida RV hipertrofia y falla que tiene varias ventajas a otros modelos de bandas como alta reproducibilidad y la posibilidad de inducir falta de RV severa y descompensada.

Introducción

El ventrículo derecho (VD) puede adaptarse a una sobrecarga de presión persistente. En el tiempo, sin embargo, mecanismos adaptativos capaces de mantener el gasto cardiaco, Vd se dilata y finalmente falla el RV. Función de RV es el principal factor pronóstico de varios desordenes cardiopulmonares como la hipertensión arterial pulmonar (HAP), la hipertensión pulmonar tromboembólica (CTEPH) y diversas formas de cardiopatía congénita con sobrecarga de presión (o volumen) de la RV A pesar de un tratamiento intenso, falta de RV sigue siendo una causa predominante de muerte en estas condiciones.

Como consecuencia de las propiedades únicas^1,2 y³ de desarrollo embriológico de la RV, el conocimiento derivado de la insuficiencia cardíaca izquierda simplemente no pueden extrapolarse a paro cardíaco derecho. Modelos animales de insuficiencia cardíaca derecha por lo tanto son necesarios para investigar los mecanismos de falla de RV y posibles estrategias de tratamiento farmacológico.

Hay experimental modelos de hipertensión pulmonar inducida por el SU5416 combinación con hipoxia (SuHx)⁴ o monocrotaline (MCT)⁵, que inducen la falta RV secundaria a enfermedad de la vasculatura pulmonar. Estos modelos se utilizan para evaluar los efectos terapéuticos de los medicamentos orientados a la vasculatura pulmonar. El SuHx y el modelo MCT son modelos no fija la poscarga de la falta de RV. Por lo tanto, no es posible concluir si una mejora en la función del RV después de una intervención es secundaria a la reducción de efectos vasculares pulmonares de la poscarga o si es causada por efectos directos en la RV. Además, el modelo MCT tiene varios efectos extra cardiacas.

En modelos de bandas experimentales tronco pulmonar, la poscarga del Vd es fijo debido a una constricción mecánica del tronco pulmonar. Esto permite la investigación de efectos cardiacos directos de una intervención en la RV independiente de cualquier efectos vasculares pulmonares^6,7,8,9. Generalmente, las bandas se realizan colocando una aguja a lo largo del tronco pulmonar. Una ligadura se coloca alrededor de la aguja y el tronco pulmonar y atada con un nudo y se retira la aguja dejando la sutura alrededor del tronco pulmonar. Según el calibre de la aguja, pueden aplicar diferentes grados de limitaciones, pero a pesar de este enfoque es ampliamente utilizado, tiene algunas desventajas. En primer lugar, el diámetro de las bandas no es exactamente el mismo que el diámetro exterior de la aguja como la ligadura es atada alrededor de la aguja y el tronco pulmonar. En segundo lugar, puede haber una variación significativa a cómo firmemente el nudo se ata lo que es difícil reproducir un cierto grado de bandas. Esto dará lugar a una variación en el diámetro de las bandas y de tal modo una dispersión más grande. Por último, el nudo puede aflojarse con el tiempo.

Un estudio aplica a un clip de tantalio medio cerrado alrededor del tronco pulmonar¹⁰. Había comprimido el clip alrededor del tronco pulmonar a un área interno de 1,10 mm² y comparado a ratas sometidas a bandas con una sutura con una aguja de 18 G. En general, las bandas con el clip fue asociada con menos complicaciones peri quirúrgico y variación de datos.

Basado en los principios descritos por Schou et al¹¹, más desarrollado y caracterizado el tronco pulmonar bandas modelo (PTB) de RV hipertrofia y falla. Presentamos nuestra experiencia con este modelo basado en los resultados de anteriores estudios^12,13. Para este modelo, un clip de titanio se comprime alrededor del tronco pulmonar a un exacto diámetro interno preestablecido, que puede ajustarse para inducir fenotipos distintos de la falta de RV.

Protocolo

Todas las ratas fueron tratadas según las directrices nacionales danesas que se describe en la ley danesa en experimentos con animales y Orden Ministerial en experimentos con animales. Todos los experimentos fueron aprobados por la junta institucional de revisión ética y realizados de conformidad con la ley danesa para la investigación animal (número de autorización de 2012-15-2934-00384, Ministerio danés de Justicia).

1. Ajuste del adherente aplicador de clips

Nota: Las bandas del tronco pulmonar se realizan con un aplicador de clips adherente abierto modificado con una quijada angulosa. El aplicador se modifica con un mecanismo ajustable de parada para detener la compresión cuando las mordazas a una distancia exacta entre sí. Cuando un pequeño titanio clip la ligadura está comprimido con el aplicador modificado, un lumen persiste entre las piernas del clip con un diámetro específico según el ajuste del mecanismo de parada (figura 1).

1. Elegir el diámetro de las bandas deseada, por ejemplo,, 0,6 mm.
2. Ajuste el aplicador de clips adherente hasta que la distancia entre las mandíbulas es 1,0 mm cuando esté totalmente comprimida. Esto deja una luz de 0,6 mm como las piernas de dos clip tienen un grosor de 0,2 mm cada uno.

Figura 1: procedimiento de la PTB. (A) el quirúrgico instrumentos utilizados para el procedimiento PTB entre el aplicador de clips adherente (flecha azul). (B) el tope ajustable mecanismo de la ligadura de los acorte aplicador. Girando la rueda dentada (flecha azul) ajustará la posición del perno (flecha amarilla), que para el cierre del aplicador cuando las fauces llegan a una cierta distancia unos de otros. La distancia corresponde a dos veces el grosor de las patas de la pinza y el diámetro interior del clip cuando el clip está comprimido y puede ser calibrado usando por ejemplo una aguja con un diámetro exterior conocido. (C) el aplicador comprime un clip de titanio para un diámetro interno exacto previamente especificado por el ajuste del aplicador. Diámetro (D) el interior del clip comprimido puede ajustarse con el fin de inducir diversos severities de RV hipertrofia y falla. Los datos presentados, un diámetro interno de 1.0 mm se utiliza para inducir la hipertrofia leve de RV, un diámetro interno de 0,6 mm se utiliza para inducir la falta moderada de RV, y un diámetro interno de 0,5 mm se utiliza para inducir la falta severa de RV. (E) el clip después de la aplicación alrededor del tronco pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. preparación de la rata

Nota: Pueden aplicar otros regímenes de analgésicos.

1. Utilice weanlings de rata Wistar con aproximadamente 100-120 g de peso. Con el fin de mantener la temperatura corporal durante la cirugía, use una almohadilla de calefacción cubierto.
2. Para la cirugía, use un ventilador mecánico para un tidal volume de aproximadamente 1,75 mL y frecuencia respiratoria de 75 por minuto.
3. Anestesie la rata con sevoflurano (mezcla de 7% en 1,5 L de O₂) en una cámara de inducción durante 5 minutos. Intubación la rata usando una cánula IV de 17 G, donde han sido cortadas la 2 mm distal de la aguja en orden para el catéter suave cubrir la punta. Retire la aguja y conecte la cánula al ventilador.
4. Colocar la rata en su espalda en la almohada. Asegúrese de que la intubación es correcta mediante la observación de los movimientos del tórax. Estos deben ser sin diferencias de lado y en ritmo con el ventilador.
   Nota: Ausencia de movimientos del tórax, contracciones abdominales e inflación de estómago en el abdomen superior izquierdo son signos de un tubo fuera de lugar. Retire la cánula, vuelva a colocar la rata en la cámara de inducción y volver a intubar.
5. Después de la intubación correcta, reducir el sevoflurano a concentración de mantenimiento (3,5% mezcla de O_2, 1,5 L/min) y fijar las patas de la rata a la almohada.
6. Confirmar anestesia prober marcando los reflejos de retirada de las extremidades usando un fórceps para apretar las patas de la rata.
7. Las ratas se inyectan con buprenorfina (0.1 mg/kg por vía subcutánea (s.c.)) y carprofene (5 mg/kg s.c.) para aliviar el dolor postoperatorio.
8. Afeitarse el pecho y desinfectar con clorhexidina.

3. aislamiento del tronco pulmonar

1. Con un par de tijeras, haga una incisión de 2 cm en la piel a lo largo de la parte media del esternón. Identificar el músculo pectoral mayor y cortar su fijación esternal. Identificar los 2^nd, 3^rdy 4^th costa abajo.
2. Opcionalmente, agarrar la costa 2^nd con una pinzas de fijación, que una sutura (4-0, multifilamento absorbible) alrededor de la costa 2^nd 1^st espacio intercostal de la parte medial inferior del espacio intercostal 2^nd . Haga un nudo firme con el fin de ligar la arteria torácica anterior.
   Nota: Esto puede ser útil si el sangrado de la arteria torácica anterior es un tema recurrente.
3. Corte el 4^th3^rdy costa 2^nd cerca del esternón con un par de tijeras y diseccionar cuidadosamente los músculos intercostales hasta que se realiza una toracotomía izquierda completa. Si se presenta cualquier sangrado de la arteria torácica anterior, comprimir con una apli y ligar la arteria.
4. Insertar un separador entre el esternón y las costas y abrirlo para obtener un buen campo operatorio. En la parte superior del campo es el timo que cubre la aorta y el tronco pulmonar. Cuidadosamente levante el timo mediante una apli y voltear hacia arriba para exponer la aorta y el tronco pulmonar abajo.
5. Guía de la punta de un pequeño gancho quirúrgico con un ángulo de 85° a través del sino pericardial transversal situado detrás de la orejuela auricular izquierda. Tire a medio camino a través de los senos y guiar la punta del gancho hacia arriba hasta que aparezca entre la aorta ascendente y el tronco pulmonar.
   1. Quitar cualquier tejido conectivo que cubre la punta con una tijera de iris con el fin de separar el tronco pulmonar de la aorta ascendente.
   2. Repita el paso con un gancho más grande (opcional).
6. Guía de un fórceps de músculo angular alrededor del tronco pulmonar a través del paso con el hook(s). Sujete el extremo de una ligadura cm aproximadamente 10 (4-0, multifilamento) y tire de la mitad de la ligadura a través el paso. Ahora el tronco pulmonar está separado de la aorta ascendente y puede ser controlado por la ligadura alrededor de él.

4. aplicación del Clip

1. Cargar el aplicador de clips adherente ajustado con una abrazadera. Cuidadosamente la guía uno de los maxilares y una pierna del clip aunque el paso alrededor del tronco pulmonar. Usar la ligadura para Jale suavemente el tronco pulmonar hacia arriba en la horquilla de clip.
2. Cuando el tronco pulmonar es en la bifurcación de la pinza y las dos puntas de las patas de la pinza están libres de cualquier tejido conectivo, comprimir el clip con el aplicador para aplicar las bandas.
3. Observar cómo el RV inmediatamente se dilata en respuesta a las bandas y quitar la ligadura.

5. cierre del tórax

1. Retire el pean de timo y coloque el timo en su posición natural. Retire el retractor.
2. Cierra el tórax en tres capas: la capa intercostal, el músculo pectoral mayor y la piel con sutura (multifilamento absorbible de 4-0). Inyectar 2 mL de solución salina s.c. para reemplazar el líquido perdido durante la cirugía.
3. Apague el sevoflurane y y mantener la rata en el ventilador (1,5 L de O2) hasta que empiece a respirar espontáneamente. Entonces, Extube la rata.
4. Tratar las ratas con buprenorfina en el agua potable para los siguientes tres días¹⁴ o aplicar un protocolo analgésico similar. Después de tres días, las ratas se han recuperado y sin molestias.
5. En las semanas siguientes, el bienestar de las ratas y los posibles efectos adversos debe ser evaluado sobre una base diaria. La curación de la herida de la toracotomía debe recibir especial atención durante la primera semana para detectar cualquier signo de infección o insuficiencia de las cicatrices. Si las ratas muestran signos de retraso del desarrollo incluyendo el pelaje erizado, movilidad reducida, problemas respiratorios y pérdida de peso, deben ser supervisados de cerca y eutanasia si pierde más del 20% de su peso corporal o desarrollar fulminantes respiratoria escasez.

6. simulacro de cirugía

1. Realizar una cirugía simulada siguiendo todos los pasos anteriores excepto la aplicación de clip (paso 4).

Resultados

Utilizando el procedimiento descrito de PTB en estudios previos de nuestro grupo^12,13, indujo hipertrofia de RV (PTB suave) por las bandas con un clip de 1.0m m, un grado moderado de insuficiencia de RV (PTB moderada) por las bandas con un clip de 0,6 mm y un grado severo de la falta de RV (PTB grave) por las bandas con un clip de 0,5 mm. Las ratas sometidas a las manifestaciones extra cardíacas desarrolladas bandas graves de ins...

Discusión

Describimos un método accesible y altamente reproducible de tronco pulmonar bandas usando un aplicador de clips adherente modificado para comprimir un clip de titanio alrededor del tronco pulmonar. Ajustando el aplicador para comprimir el clip de diferentes diámetros internos, pueden inducir fenotipos distintos de RV hipertrofia e insuficiencia incluyendo insuficiencia grave de RV con manifestación extra cardiaco de la descompensación.

Aunque es simple, el protocolo contiene algunos pasos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 G IV Venflon Cannula	Becton Dickinson, US	393228	Distal 2 mm of the needle have been cut off
1 mL syringe + 26 G needle	Becton Dickinson, US	303172 & 303800
4-0 absorbable multifilament suture	Covidien, US	GL-46-MG	Polysorb, violet, 5x18"
4-0 multifilament ligature	Covidien, US	LL-221	Polysorb, violet, 98"
Buprenorphine	Indivior UK Limited		Local procurement, Temgesic 0.3 mg/mL
Carprofene	ScanVet, DK	27693	Norodyl 50 mg/mL
Chlorhexidine	Faaborg Pharma, DK		Local procurement
Contractor	Aesculap, Germany	BV010R	Blunt, self retaining, 70 mm
Ear Hooklet	Lawton, Germany	66-0261	Small, 14 cm, tip modified to an angle of 85°
Eye gel	Decra, UK		Lubrithal, Local procurement
Forceps, Delicate Tissue	Lawton, Germany	09-0020
Forceps, Dissecting	Lawton, Germany	09-0013	1 regular, 1 with tip modified to an angle of 100°
Gas Anesthesia System	Penlon Limited, UK	SD0217SL	Sigma Delta Vaporizer
Hair trimmer	Oster	76998-320-051
Horizon Open Ligating Clip Applier	Teleflex, US	137085	Modified with adjustable stop mechanism
Horizon Titanium Clips	Teleflex, US	001200	Small
Induction chamber	N/A
Iris Scissor	Lawton, Germany	05-1450
Iris Scissor	Aesculap, Germany	BC060R
Mechanical ventilator	Ugo Basile, Italy	7025
Microscissor	Lawton, Germany	63-1406
Microscope	Carl Zeiss, Germany	303294-9903
Needle Holder	Lawton, Germany	08-0011	TITEGRIP
Pean	Lawton, Germany	06-0100	Halsted-Mosquito, straight
Pro-Optha	Lohmann & Rauscher, Germany	16515	Tampon
Saline 9 mg/mL	Fresenius Kabi, DK	209319
Sevoflurane	AbbVie, US		Sevorane, Local procurement
Surgical hook	Lawton, Germany	51-0665	Cushing, 19 cm, tip modified to an angle of 90°
Surgical Tape	3M, US	1530-0	Micropore
Temperature Controller	CMA Microdialysis; Sweden	8003760	CMA 450
Weighing machine	VWR, US
Wistar rat weanlings	Janvier Labs, France		RjHan:WI, 100-120 g