Un tronco polmonare Banding modello di sovraccarico pressorio indotto da fallimento e ipertrofia ventricolare destra

Riepilogo

Presentiamo un metodo chirurgico per indurre l'ipertrofia ventricolare destra e insufficienza in ratti.

Abstract

Insufficienza ventricolare destra (RV) indotta dal sovraccarico di pressione costante è un contributore importante alla morbosità ed alla mortalità in parecchi disordini cardiopolmonari. Affidabili e riproducibili modelli animali di insufficienza di RV sono pertanto autorizzati al fine di indagare i meccanismi della malattia e gli effetti di potenziali strategie terapeutiche. Fascia del tronco polmonare è un metodo comune per indurre l'ipertrofia RV isolato ma in generale, modelli precedentemente descritti non sono riusciti a creare un modello stabile di RV ipertrofia e scompenso.

Vi presentiamo un modello del ratto dell'ipertrofia RV indotto sovraccarico di pressione causata da tronco polmonare banding (PTB) che consente diversi fenotipi dell'ipertrofia RV con e senza insufficienza di RV. Usiamo un applicatore ligating modificate per comprimere una clip di titanio intorno al tronco polmonare di un diametro interno pre-impostato. Usiamo i diametri diversi clip per indurre le diverse fasi della progressione di malattia da lieve ipertrofia RV per insufficienza di RV scompensata.

L'ipertrofia RV si sviluppa costantemente in ratti sottoposti alla procedura di PTB e a seconda del diametro della clip bendaggio applicato, siamo in grado di riprodurre con precisione severities differenti di malattia che vanno da ipertrofia compensata a grave scompensata RV guasto con manifestazioni extra-cardiache.

Il modello presentato PTB è che un modello valido e robusto di sovraccarico pressorio indotto RV ipertrofia e scompenso che presenta parecchi vantaggi ad altri modelli banding tra cui elevata riproducibilità e la possibilità di indurre guasto RV grave e scompensata.

Introduzione

Il ventricolo di destra (RV) può adattarsi ad un sovraccarico di pressione persistente. Nel tempo, tuttavia, meccanismi adattativi non riescono a sostenere la gittata cardiaca, dilata la RV e la RV non riesce alla fine. Funzione di RV è il fattore prognostico principale di parecchi disordini cardiopolmonari compreso ipertensione arteriosa polmonare (PAH), ipertensione polmonare tromboembolica (CTEPH) e varie forme di malattia di cuore congenita con un sovraccarico di pressione (o volume) di RV. Malgrado il trattamento intenso, RV fallimento rimane una causa predominante di morte in queste condizioni.

Come conseguenza la proprietà uniche^1,2 e sviluppo embriologico³ del RV, conoscenza derivata da infarto di sinistra semplicemente non può essere estrapolato per insufficienza cardiaca destra. Modelli animali di insufficienza cardiaca destra sono pertanto necessari al fine di indagare i meccanismi di guasto di RV e potenziali strategie di trattamento farmacologico.

Ci sono sperimentale modelli di ipertensione polmonare indotta da SU5416 combinato con ipossia (SuHx)⁴ o monocrotaline (MCT)⁵, che indurre indebolimento RV secondario alla malattia nel vasculature polmonare. Questi modelli vengono utilizzati per valutare gli effetti terapeutici di farmaci che hanno come destinazione il sistema vascolare polmonare. Sia il SuHx che il modello MCT sono modelli non fissa postcarico del fallimento di RV. Di conseguenza, non è possibile concludere se un miglioramento nella funzione RV dopo un intervento è secondario al postcarico riducendo gli effetti vascolari polmonari o se è causato da effetti diretti sul camper. Inoltre, il modello MCT ha parecchi effetti extra cardiaci.

Nei modelli Bordatrici tronco polmonare sperimentale, il postcarico del camper è stato risolto a causa di una riduzione meccanica del tronco polmonare. Questo consente per l'indagine degli effetti cardiaci diretti di un intervento sulla RV indipendente da eventuali effetti vascolari polmonare^6,7,8,9. Di solito, il bendaggio viene eseguito inserendo un ago lungo il tronco polmonare. Poi una legatura è collocata intorno l'ago e il tronco polmonare e legata con un nodo, e l'ago viene rimosso lasciando la sutura intorno al tronco polmonare. A seconda del calibro dell'ago, possono essere applicati diversi gradi di costrizioni, ma nonostante questo approccio viene ampiamente utilizzato, ha anche alcuni svantaggi. In primo luogo, il diametro del bendaggio non è esattamente lo stesso come il diametro esterno dell'ago come la legatura è legata intorno sia l'ago e il tronco polmonare. In secondo luogo, ci possono essere variazioni significative come strettamente il nodo è legato che lo rende difficile da riprodurre un certo grado di bendaggio. Questo porterà ad una variazione di diametro Bordatrici e quindi una maggiore dispersione. Infine, il nodo potrebbe allentarsi nel tempo.

Uno studio si applica una clip di tantalio chiusa a metà intorno al tronco polmonare¹⁰. Hanno compresso la clip intorno al tronco polmonare ad un'area interna di 1,10 mm² e rispetto a ratti sottoposti a banding con una sutura utilizzando un ago da 18 G. Nel complesso, banding con il clip è stato associato con meno complicanze peri-chirurgiche e la varianza dei dati.

Sulla base dei principi descritti da Schou et al.¹¹, abbiamo ulteriormente sviluppato e caratterizzato il tronco polmonare banding modello (PTB) di RV ipertrofia e scompenso. Qui, presentiamo la nostra esperienza nell'utilizzo di questo modello basato sui risultati di precedenti studi^12,13. Per questo modello, una clip di titanio viene compressa intorno al tronco polmonare per un esatto diametro interno preimpostato, che può essere regolato al fine di indurre i fenotipi distinti di fallimento RV.

Protocollo

Tutti i ratti sono stati trattati secondo le linee guida nazionali danesi descritte nella legge danese sulla sperimentazione animale e decreto ministeriale sugli esperimenti sugli animali. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato di revisione etica istituzionale e condotte in conformità con la legge danese per la ricerca sugli animali (numero di autorizzazione 2012-15-2934-00384, Ministero della giustizia danese).

1. adeguamento dell'applicatore Ligating

Nota: Il banding del tronco polmonare viene eseguito con un applicatore di clip ligating aperto modificate con una mascella angolato. L'applicatore è modificato con un meccanismo di arresto regolabile per interrompere la compressione quando le ganasce arriva una distanza esatta da altro. Quando un piccolo titanio legando il clip è stato compresso con l'applicatore modificata, un lume persiste tra le gambe della clip con un diametro specifico secondo la regolazione del meccanismo di arresto (Figura 1).

1. Scegliere il diametro del banding desiderata, ad esempio, 0,6 mm.
2. Regolare ligating applicatore fino a quando la distanza fra le ganasce è 1,0 mm quando completamente compressa. Questo lascia un lume di 0,6 mm, come le gambe di due clip hanno uno spessore di 0,2 mm ciascuno.

Figura 1: procedura il PTB. (A) il chirurgico strumenti utilizzati per la procedura PTB compreso applicatore ligating (freccia blu). Applicatore di clip (B) l'arresto regolabile meccanismo della legatura. Girando la ruota dentata (freccia blu) regolerà la posizione del perno (freccia gialla), che ferma la chiusura dell'applicatore quando le ganasce raggiungono una certa distanza gli uni dagli altri. La distanza corrisponde a due volte lo spessore delle gambe della clip più il diametro interno della clip, quando la clip è compresso e può essere calibrata utilizzando ad esempio un ago con un diametro esterno noto. (C) l'applicatore comprime una clip di titanio per un esatto diametro interno pre-specificato dall'adeguamento dell'applicatore. Diametro (D) all'interno della clip compressi possa essere regolato per indurre diversi livelli di gravità di RV ipertrofia e scompenso. Per i dati presentati, un diametro interno di 1,0 mm è stato utilizzato per indurre l'ipertrofia delicata di RV, un diametro interno di 0,6 mm è stato utilizzato per indurre insufficienza moderata di RV e un diametro interno di 0.5 mm è stato utilizzato per indurre il guasto severo di RV. (E) la clip dopo applicazione intorno al tronco polmonare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. preparazione del ratto

Nota: Altri regimi di analgesici possono essere applicati.

1. Utilizzare ristallo di ratto Wistar pesa circa 100 – 120 g. Al fine di mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico, è necessario utilizzare un termoforo coperto.
2. Per la chirurgia, utilizzare un ventilatore meccanico impostato su un tidal volume di circa 1,75 mL e frequenza respiratoria pari a 75 min.
3. Anestetizzare il ratto con sevoflurane (7% mix in 1,5 L di O₂) in una camera di induzione per 5 minuti. Intubare il ratto utilizzando una cannula IV 17 G, dove il 2 mm distale dell'ago sono state tagliate in modo che il catetere morbido coprire la punta. Rimuovere l'ago e collegare la cannula al ventilatore.
4. Posto il ratto sul dorso il termoforo. Assicurarsi che l'intubazione è corretto osservando i movimenti del torace. Questi dovrebbero essere senza differenze di lato e in pace con il ventilatore.
   Nota: Assenza di movimenti del torace, contrazioni addominali e inflazione dello stomaco nella parte superiore sinistra dell'addome sono segni di un tubo fuori luogo. Rimuovere la cannula, rimettere il ratto nella camera di induzione e ri-intubarla.
5. Dopo intubazione corretta, ridurre il sevoflurane per concentrazione di manutenzione (mix di 3,5% di O_2, 1,5 L/min) e fissare le zampe del ratto per il rilievo di riscaldamento.
6. Confermare amputate prober controllando i riflessi di ritiro delle estremità usando una pinza per spremere le zampe del ratto.
7. Iniettare i ratti con buprenorfina (0,1 mg/kg per via sottocutanea (s.c.)) e carprofene (5 mg/kg s.c.) per alleviare il dolore post-operatorio.
8. Radere il torace e disinfettare con clorexidina.

3. isolamento del tronco polmonare

1. Con un paio di forbici, praticare un'incisione di 2 cm in pelle lungo la parte centrale dello sterno. Identificare i principali muscoli pettorali e tagliare il suo attacco sternale. Identificare la 2^nd, 3^rde 4^th costa sottostante.
2. Facoltativamente, è possibile afferrare il costa 2^nd con una pinza di fissaggio, metta una sutura (4-0, multifilamento, assorbibile) tutto il costa 2^nd dallo spazio intercostale 1^st alla parte mediale inferiore dello spazio intercostale 2^nd . Fare un nodo costante al fine di legare l'arteria toracica anteriore.
   Nota: Questo può essere utile se l'emorragia dall'arteria toracica anteriore è un problema ricorrente.
3. Tagliare i 4^th, 3^rde costa 2^nd vicino allo sterno con un paio di forbici e attentamente sezionare i muscoli intercostali fino a quando è stato eseguito un thoracotomy di sinistra completo. Se qualsiasi emorragia dall'arteria toracica anteriore si verifica, comprimere con un pean e legare l'arteria.
4. Inserire un divaricatore tra lo sterno e la costae e aprirlo per ottenere un buon campo di funzionamento. Nella parte superiore del campo è il timo che copre l'aorta e il tronco polmonare. Attentamente sollevare il timo utilizzando un pean e girarla verso l'alto al fine di esporre l'aorta e il tronco polmonare sottostante.
5. Guidare la punta di un piccolo hooklet chirurgica con un angolo di 85° attraverso il seno pericardico trasversale situato dietro l'auricola sinistra. Tirare a metà strada attraverso il seno e guidare la punta del gancio verso l'alto fino a quando non appare fra l'aorta ascendente e tronco polmonare.
   1. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo che copre la punta con una forbice iris al fine di separare il tronco polmonare dall'aorta ascendente.
   2. Ripetere il passaggio con un gancio più grande (opzionale).
6. Guida un forcipe angolato muscolo intorno al tronco polmonare attraverso il passaggio fatto con il hook(s). Afferrare l'estremità di una legatura di circa 10 cm (4-0, multifilamento) e tirare la metà della legatura indietro attraverso il passaggio. Ora il tronco polmonare è separato dall'aorta ascendente e può essere controllato tramite la legatura intorno ad esso.

4. applicazione della Clip

1. Caricare l'applicatore ligating regolato con una clip. Guidare con attenzione una delle ganasce e una gamba del clip però il passaggio intorno al tronco polmonare. Utilizzare la legatura per tirare delicatamente il tronco polmonare verso l'alto e nella forcella della clip.
2. Quando il tronco polmonare è nella forcella della clip e le due punte delle gambe clip sono liberi di tutto il tessuto connettivo, comprimere il clip con l'applicatore per applicare il banding.
3. Osservare come la RV dilata immediatamente in risposta al banding e rimuovere la legatura.

5. chiusura del torace

1. Rimuovere il pean da timo e riposizionare il timo nella sua posizione naturale. Rimuovere il retrattore.
2. Chiudere il torace in tre strati: lo strato dell'intercostale, il grande muscolo pettorale e la pelle con sutura (4-0, multifilamento, assorbibile). Iniettare 2 mL di salino s.c. per sostituire il liquido perdita durante l'intervento chirurgico.
3. Spegnere il sevoflurano ed e tenere il ratto sul ventilatore (1,5 L di O2) fino a quando comincia a respirare spontaneamente. Quindi, estubare il ratto.
4. Trattare i ratti con buprenorfina nell'acqua potabile per i tre giorni seguenti¹⁴ o applicare un protocollo simile analgesico. Dopo tre giorni, i ratti hanno recuperato e sono senza disagio.
5. Nelle settimane successive, il benessere dei ratti e dei possibili effetti negativi dovrebbe essere valutato su una base quotidiana. La guarigione della ferita dalla toracotomia dovrebbe ricevere un'attenzione particolare durante la prima settimana al fine di rilevare eventuali segni di infezione o insufficienza delle cicatrici. Se i ratti mostrano segni di omissione di prosperare tra cui pelo ispido, difficoltà motorie, problemi respiratori e perdita di peso, devono essere strettamente monitorati ed eutanasia se perdono più del 20% del loro peso corporeo o sviluppare fulminante respiratoria insufficienza.

6. sham chirurgia

1. Eseguire un intervento chirurgico di sham seguendo tutti i passaggi sopra tranne per l'applicazione della clip (passaggio 4).

Risultati

Utilizzando la procedura descritta di PTB negli studi precedenti dal nostro gruppo^12,13, abbiamo indotto ipertrofia RV (PTB mite) dalla fascia con un clip di 1,0 mm, un moderato grado di insufficienza di RV (PTB moderato) di banding con una clip di 0,6 mm e un grado severo di guasto di RV (PTB grave) dalla fascia con un clip di 0,5 mm. I ratti sottoposti alle manifestazioni extra cardiache sviluppate Bordatrici severe di guasto di...

Discussione

Descriviamo un metodo accessibile e altamente riproducibile del tronco polmonare bendaggio utilizzando un applicatore ligating modificate per comprimere una clip di titanio intorno al tronco polmonare. Regolando l'applicatore per comprimere il clip per diametri interni differenti, possono essere indotta fenotipi distinti di RV ipertrofia e scompenso tra cui insufficienza grave di RV con manifestazione extra cardiaco di scompenso.

Anche se semplice, il protocollo contiene alcuni passaggi critic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 G IV Venflon Cannula	Becton Dickinson, US	393228	Distal 2 mm of the needle have been cut off
1 mL syringe + 26 G needle	Becton Dickinson, US	303172 & 303800
4-0 absorbable multifilament suture	Covidien, US	GL-46-MG	Polysorb, violet, 5x18"
4-0 multifilament ligature	Covidien, US	LL-221	Polysorb, violet, 98"
Buprenorphine	Indivior UK Limited		Local procurement, Temgesic 0.3 mg/mL
Carprofene	ScanVet, DK	27693	Norodyl 50 mg/mL
Chlorhexidine	Faaborg Pharma, DK		Local procurement
Contractor	Aesculap, Germany	BV010R	Blunt, self retaining, 70 mm
Ear Hooklet	Lawton, Germany	66-0261	Small, 14 cm, tip modified to an angle of 85°
Eye gel	Decra, UK		Lubrithal, Local procurement
Forceps, Delicate Tissue	Lawton, Germany	09-0020
Forceps, Dissecting	Lawton, Germany	09-0013	1 regular, 1 with tip modified to an angle of 100°
Gas Anesthesia System	Penlon Limited, UK	SD0217SL	Sigma Delta Vaporizer
Hair trimmer	Oster	76998-320-051
Horizon Open Ligating Clip Applier	Teleflex, US	137085	Modified with adjustable stop mechanism
Horizon Titanium Clips	Teleflex, US	001200	Small
Induction chamber	N/A
Iris Scissor	Lawton, Germany	05-1450
Iris Scissor	Aesculap, Germany	BC060R
Mechanical ventilator	Ugo Basile, Italy	7025
Microscissor	Lawton, Germany	63-1406
Microscope	Carl Zeiss, Germany	303294-9903
Needle Holder	Lawton, Germany	08-0011	TITEGRIP
Pean	Lawton, Germany	06-0100	Halsted-Mosquito, straight
Pro-Optha	Lohmann & Rauscher, Germany	16515	Tampon
Saline 9 mg/mL	Fresenius Kabi, DK	209319
Sevoflurane	AbbVie, US		Sevorane, Local procurement
Surgical hook	Lawton, Germany	51-0665	Cushing, 19 cm, tip modified to an angle of 90°
Surgical Tape	3M, US	1530-0	Micropore
Temperature Controller	CMA Microdialysis; Sweden	8003760	CMA 450
Weighing machine	VWR, US
Wistar rat weanlings	Janvier Labs, France		RjHan:WI, 100-120 g