Ein pulmonaler Stamm Streifenbildung Modell der Drucküberlastung induzierte rechtsventrikuläre Hypertrophie und Versagen

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine chirurgische Methode, um rechtsventrikuläre Hypertrophie und Versagen bei Ratten zu induzieren.

Zusammenfassung

Rechtsventrikuläre (RV) Scheitern induziert durch nachhaltige Drucküberlastung ist ein wesentlicher Faktor für die Morbidität und Mortalität in mehreren Herz-Lungen-Erkrankungen. Zuverlässige und reproduzierbare Tiermodellen der RV Fehler sind daher geboten, um Krankheitsmechanismen und Auswirkungen der möglichen therapeutischen Strategien zu untersuchen. Banding der pulmonalen Stamm ist eine gängige Methode um isolierte RV-Hypertrophie zu induzieren, aber in der Regel zuvor beschriebenen Modelle nicht gelungen ein stabiles Modell RV-Hypertrophie und Versagen.

Wir präsentieren einem Rattenmodell der Druck induzierten Überlastung RV Hypertrophie verursacht durch pulmonale Stamm Streifenbildung (PTB) ermöglicht, die verschiedenen Phänotypen von RV-Hypertrophie mit und ohne RV-Versagen. Wir verwenden eine modifizierte selbstligierendes Clip Klammer um einen Titan-Clip um den pulmonalen Stamm zu einer voreingestellten Innendurchmesser zu komprimieren. Wir verwenden verschiedene Clip Durchmessern um zu verschiedene Phasen des Fortschreitens der Krankheit von milden RV-Hypertrophie dekompensierten RV-Versagen zu induzieren.

RV-Hypertrophie entwickelt sich konsequent in Ratten ausgesetzt, um die PTB-Verfahren und je nach Durchmesser des angewandten Streifenbildung Clips, wir können genau reproduzieren, andere Krankheit Schweregrade von kompensierten Hypertrophie bis hin zu schweren dekompensierten RV Fehler mit extra kardiale Manifestationen.

Das vorgestellte Modell der PTB ist eine gültige und robuste Modell der Drucküberlastung induzierte RV Hypertrophie und Versagen, die mehrere Vorteile zu anderen banding-Modelle einschließlich hohe Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit des Verursachens ernsthafter und dekompensierten RV Missachtung hat.

Einleitung

Der Rechte Ventrikel (RV) kann eine anhaltende Drucküberlastung anpassen. In der Zeit jedoch Anpassungsmechanismen nicht Herzzeitvolumen, stützen die RV weitet und schließlich die RV schlägt fehl. RV-Funktion ist der wichtigste prognostische Faktor für mehrere Herz-Lungen-Erkrankungen einschließlich pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH), thromboembolische pulmonale Hypertonie (CTEPH) und verschiedene Formen von angeborenen Herzerkrankungen mit Druck (oder Volumen) Überlastung der RV. Trotz intensiver Behandlung bleibt RV Ausfall eine vorherrschende Ursache des Todes unter diesen Bedingungen.

Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften^1,2 und Embryonalentwicklung³ des RV werden nicht einfach Erkenntnisse aus Linksherzinsuffizienz, Rechtsherzinsuffizienz extrapoliert. Tiermodelle der Rechtsherzinsuffizienz sind daher notwendig, um die Mechanismen der RV Fehler und mögliche pharmakologische Behandlungsstrategien zu untersuchen.

Es gibt experimentelle Modelle der pulmonalen Hypertonie induziert durch SU5416 kombiniert mit Hypoxie (SuHx)⁴ oder Monocrotaline (MCT)⁵, die RV Scheitern sekundär zu Krankheit in der pulmonalen Gefäßsystem zu induzieren. Diese Modelle werden verwendet, um die therapeutischen Wirkungen von Drogen das Ziel der pulmonalen Gefäßsystems bewerten. Die SuHx und die MCT-Modell sind nicht feste Nachlast Modelle der RV-Versagen. Infolgedessen ist es nicht möglich festzustellen, ob eine Verbesserung in der RV-Funktion nach einer Intervention sekundär zu Nachlast-Senkung pulmonalen vaskulären Effekte ist oder ob es durch direkte Auswirkungen auf die RV verursacht wird Darüber hinaus hat das MCT-Modell mehrere extra kardialen Effekte.

In experimentelle pulmonale Stamm Streifenbildung Modelle ist die Nachlast des RV durch eine mechanische Verengung des pulmonalen Kofferraum fixiert. Dies ermöglicht die Untersuchung der direkte kardiale Auswirkungen einer Intervention auf der RV unabhängig von einer pulmonalen vaskulären Effekte^6,7,8,9. In der Regel ist die Streifenbildung durchgeführt, indem man eine Nadel entlang der pulmonalen Stamm. Dann ist eine Ligatur um die Nadel und der pulmonalen Stamm gelegt und mit einem Knoten gebunden, und die Nadel wird entfernt, so dass die Naht um den pulmonalen Stamm. Abhängig von der Gradmesser für die Nadel verschiedene Grade von Verengungen können angewendet werden, aber trotz dieser Ansatz wird am meisten benutzt, es hat einige Nachteile. Erstens ist der Durchmesser des die Streifenbildung nicht genau dasselbe wie der Außendurchmesser der Nadel wie die Ligatur um die Nadel und der pulmonalen Stamm gebunden ist. Zweitens gibt es möglicherweise erhebliche Unterschiede, wie eng der Knoten gebunden ist, macht es schwierig, ein gewisses Maß an Streifenbildung zu reproduzieren. Dies führt zu einer Variation Streifenbildung Durchmesser und damit eine größere Streuung. Zu guter Letzt kann der Knoten im Laufe der Zeit lockern.

Eine Studie gilt einen halbgeschlossene Tantal Clip rund um die pulmonale Stamm¹⁰. Sie komprimiert den Clip um den pulmonalen Stamm zu einem inneren Bereich von 1,10 mm² und verglich sie mit Ratten Streifenbildung mit einer Naht mit einer Nadel 18 G ausgesetzt. Alles in allem war die Streifenbildung mit dem Clip mit weniger Peri-operativen Komplikationen und Varianz der Daten in Verbindung gebracht.

Basierend auf den Prinzipien von Schou beschrieben Et Al.¹¹, weiter entwickelt und charakterisiert die pulmonalen Stamm Streifenbildung (PTB) Modell RV-Hypertrophie und Versagen. Hier präsentieren wir Ihnen unsere Erfahrung mit diesem Modell basierend auf Ergebnissen aus früheren Studien^12,13. Für dieses Modell ist ein Titan-Clip um den pulmonalen Stamm eine genaue voreingestellten Innendurchmesser komprimiert, was angepasst werden kann, um unterschiedliche Phänotypen der RV-Versagen zu induzieren.

Protokoll

Alle Ratten wurden nach dänischen nationalen Richtlinien in das dänische Gesetz über Tierversuche und ministerielle Verordnung von Tierversuchen beschrieben behandelt. Alle Experimente wurden von der institutionellen Ethik Review Board genehmigt und im Einklang mit dem dänischen Gesetz für Tierforschung (RMA-Nummer 2012-15-2934-00384, dänischen Ministerium für Justiz).

1. Anpassung der Ligation Clip Klammer

Hinweis: Die Streifenbildung des pulmonalen Rumpfes erfolgt mit einer modifizierten offen selbstligierendes Clip Präger mit einem abgewinkelten Kiefer. Die Klammer wird modifiziert, mit einem verstellbaren Anschlag-Mechanismus, die Kompression zu beenden, wenn die Kiefer exakte Abstände voneinander zu erreichen. Wenn eine kleine Titan Ligation Clip mit der modifizierten Präger komprimiert wird, besteht ein Lumen zwischen die Beine des Clips mit einem bestimmten Durchmesser je nach Einstellung des Stopp-Mechanismus (Abbildung 1).

1. Wählen Sie den Durchmesser der gewünschten Banding, z.B., 0,6 mm.
2. Stellen Sie die Ligation Clip Klammer der Abstand zwischen den Backen 1,0 mm bei vollständig komprimiert. Dies lässt ein Lumen von 0,6 mm, wie die zwei Clips Beine eine Dicke von 0,2 mm haben.

Abbildung 1: die PTB Verfahren. (A) die chirurgische Instrumente für die PTB-Verfahren einschließlich der Ligation Clip Klammer (blauer Pfeil). (B) die einstellbaren Anschlag Mechanismus der die Ligation clip Klammer. Drehen das Zahnrad (blauer Pfeil) passen die Position des Stiftes (gelber Pfeil), der das Schließen der Klammer hält, wenn der Kiefer einen bestimmten Abstand voneinander zu erreichen. Der Abstand entspricht zweimal die Dicke der Beine des Clips und der Innendurchmesser des Clips, wenn der Clip komprimiert ist und kann z.B. durch Verwendung einer Nadel mit einem bekannten Außendurchmesser kalibriert werden. (C) komprimiert die Klammer einen Titan-Clip zu einem genauen Innendurchmesser vorgegeben durch Anpassung der die Klammer. (D) der innere Durchmesser des komprimierten Clips kann eingestellt werden, um verschiedene Schweregrade von RV-Hypertrophie und Misserfolg zu induzieren. Für die vorgelegten Daten ein Innendurchmesser von 1,0 mm wurde verwendet, um milde RV-Hypertrophie zu induzieren, ein Innendurchmesser von 0,6 mm wurde verwendet, um moderate RV-Versagen zu induzieren und ein Innendurchmesser von 0,5 mm wurde verwendet, um schwere RV-Versagen zu induzieren. (E) den Clip nach dem Auftragen um den pulmonalen Stamm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Vorbereitung der Ratte

Hinweis: Andere Therapien von Analgetika können angewendet werden.

1. Verwenden Sie Wistar Ratten Jungtiere mit einem Gewicht von ca. 100 – 120 g. Um Körpertemperatur während der Operation zu erhalten, verwenden Sie eine überdachte Heizkissen.
2. Verwenden Sie für die Chirurgie einen mechanischen Entlüfter auf eine Tidal volume von etwa 1,75 mL und Atemfrequenz von 75 / min eingestellt.
3. Betäuben Sie die Ratte mit Sevofluran (7 %-Mix in 1,5 L O₂) in einer Induktion Kammer für 5 Minuten. Intubation die Ratte mit einem 17 G IV Kanüle, wo die distalen 2 mm der Nadel sind abgeschnitten worden in Reihenfolge für die weiche Katheter um die Spitze zu decken. Entfernen Sie die Nadel und verbinden Sie die Kanüle mit den Ventilator.
4. Legen Sie die Ratte auf seinem Rücken auf das Heizkissen. Stellen Sie sicher, dass die Intubation korrekt ist, durch die Beobachtung der Bewegungen des Brustkorbs. Diese sollte ohne Seite Unterschiede und im Tempo mit dem Ventilator.
   Hinweis: Fehlen von Bewegungen des Thorax, Bauch Kontraktionen und Inflation des Magens im linken Oberbauch sind Anzeichen für ein verlegtes Rohr. Entfernen der Kanüle, setzen Sie die Ratte wieder in die Induktion Kammer und erneute Intubation.
5. Nach dem korrekten Intubation, reduzieren die Sevofluran Wartung Konzentration (3,5 % Mischung in O_2, 1,5 L/min) und die Pfoten der Ratte, das Heizkissen zu beheben.
6. Bestätigen Sie Prober Anesthetization durch Überprüfung Rückzug Reflexe der Extremitäten mit einer Pinzette, um die Pfoten der Ratte zu quetschen.
7. Die Ratten mit Buprenorphin zu injizieren (0,1 mg/kg subkutan (s.c.)) und Carprofene (5 mg/kg s.c.), postoperative Schmerzen zu lindern.
8. Die Brust zu rasieren und desinfizieren mit Chlorhexidin.

3. Isolation der pulmonalen Kofferraum

1. Machen Sie mit einer Schere einen 2 cm Schnitt in die Haut entlang der mittlere Teil des Brustbeins. Identifizieren Sie dem großen Brustmuskel zu und schneiden Sie ihr sternale festhalten. 2^Nd, 3^rdund 4^th Costa unten zu identifizieren.
2. Optional greifen Sie 2^Nd Costa mit einer Fixierung Pinzette, setzen eine Naht (4: 0, Multifilament, resorbierbaren) nahe der 2^Nd Costa vom 1^St Intercostalneuralgie Raum mit dem medialen Unterteil 2^Nd Intercostalneuralgie Platz. Knoten Sie einen festen um die vorderen Brust-Arterie zu verbinden.
   Hinweis: Dies kann nützlich sein, wenn Blutungen aus der vorderen Brust-Arterie ein wiederkehrendes Thema ist.
3. Schneiden Sie 4^th, 3^rdund 2^Nd Costa in der Nähe des Brustbeins mit der Schere und sezieren Sie sorgfältig die Zwischenrippenmuskeln zu, bis eine komplette linke Thorakotomie durchgeführt wurde. Tritt eine Blutung aus der vorderen Brust-Arterie, mit einem europäischen komprimieren Sie und verbinden Sie die Arterie.
4. Legen Sie einen Retraktor zwischen dem Brustbein und der besteht und zu öffnen Sie, um eine gute Operationsfeld zu bekommen. An der Spitze des Feldes ist die Thymusdrüse in der Aorta und der pulmonalen Stamm. Sorgfältig mit einem europäischen Thymus heben Sie und drehen Sie sie nach oben um die Aorta und die pulmonale Stamm unten offen zu legen.
5. Führen Sie die Spitze des einen kleinen chirurgischen Hooklet mit 85° Winkel durch den transversalen Herzbeutel Sinus befindet sich hinter der linken atrial Appendage. Ziehen Sie es auf halbem Weg zurück durch den Sinus und führen Sie die Spitze des Ohrbügels nach oben, bis es zwischen der Aorta ascendens und der pulmonalen Stamm erscheint.
   1. Entfernen Sie alle Bindegewebe über die Spitze mit einer Iris-Schere um den pulmonalen Stamm aus der Aorta ascendens zu trennen.
   2. Wiederholen Sie den Schritt mit einem größeren Haken (optional).
6. Führen Sie eine abgewinkelte Muskel Zange um den pulmonalen Stamm durch die Passage mit der Hook(s) gemacht. Schnappen Sie sich am Ende eine ca. 10 cm Ligatur (4-0, Multifilament) und ziehen Sie die Hälfte der Ligatur zurück durch die Passage. Jetzt die pulmonale Stamm ist getrennt von der Aorta ascendens und gesteuert werden, indem die Ligatur um ihn herum.

4. Anwendung des Clips

1. Die bereinigte selbstligierendes Clip Klammer mit einem Clip zu laden. Führen Sie eines der Kiefer und einem Bein des Clips vorsichtig aber den Durchgang um den pulmonalen Stamm. Verwenden Sie die Ligatur um die pulmonale Stamm nach oben und in die Gabel des Clips ziehen.
2. Wenn der pulmonale Stamm in der Gabel des Clips ist und die beiden Spitzen der Clip Beine frei von jeder Bindegewebe sind, komprimieren Sie den Clip mit der Klammer, die Streifenbildung anzuwenden.
3. Beobachten Sie, wie die RV sofort als Reaktion auf die Streifenbildung weitet und entfernen Sie die Ligatur zu.

5. Abschluss des Thorax

1. Entfernen Sie die europäischen aus dem Thymus und positionieren Sie Thymus an seiner natürlichen Position neu zu. Entfernen Sie die Aufrollvorrichtung.
2. Schließen Sie den Brustkorb in drei Schichten: die Intercostalneuralgie Schicht, dem großen Brustmuskel und die Haut mit Naht (4-0, Multifilament, resorbierbaren). Spritzen Sie 2 mL Kochsalzlösung s.c., während der Operation verlorene Flüssigkeit zu ersetzen.
3. Die Sevofluran ausschalten und und halten Sie die Ratte auf den Ventilator (1,5 L von O2) bis es beginnt spontan atmen. Dann Extubate der Ratte.
4. Die Ratten mit Buprenorphin in das Trinkwasser für die folgenden drei Tage¹⁴ zu behandeln oder ein vergleichbares analgetische Protokoll anwenden. Nach drei Tagen die Ratten erholt haben und ohne Beschwerden.
5. In den folgenden Wochen sollte das Wohlergehen der Ratten und mögliche Nebenwirkungen auf einer täglichen Basis bewertet werden. Die Heilung der Wunde von der Thorakotomie sollte besondere Aufmerksamkeit während der ersten Woche erhalten, um irgendwelche Anzeichen einer Infektion oder Insuffizienz der Narben zu erkennen. Wenn die Ratten einer Gedeihstörung einschließlich borstigen Fell, eingeschränkter Mobilität, Atmungsprobleme und Gewichtsverlust Anzeichen, sie sollten engmaschig überwacht und eingeschläfert, wenn sie mehr als 20 % ihres Körpergewichts verlieren oder entwickeln fulminante Atemwege Insuffizienz.

6. Sham Chirurgie

1. Führen Sie eine Schein-OP folgen all die oben genannten Schritte, außer für die Anwendung des Clips (Schritt 4).

Ergebnisse

Verwenden das beschriebene Verfahren der PTB in früheren Studien von unserer Gruppe^12,13, induziert wir durch Streifenbildung mit einem 1,0 mm-Clip, ein gewisses Maß an RV scheitern (PTB moderate) durch Streifenbildung mit einem 0,6 mm-Clip und einem schweren Grad RV Hypertrophie (PTB mild) RV Verstoß (PTB schwere) mit einem 0,5 mm Clip Streifenbildung. Die Ratten, die schweren Streifenbildung entwickelten extra kardialen Manif...

Diskussion

Wir beschreiben eine zugänglich und hoch reproduzierbare Methode zur pulmonalen Stamm Streifenbildung mit einer modifizierten selbstligierendes Clip Klammer um einen Titan-Clip um den pulmonalen Stamm komprimieren. Durch die Anpassung der Klammer um den Clip zu unterschiedlichen Innendurchmesser zu komprimieren, können unterschiedliche Phänotypen von RV-Hypertrophie und Ausfall einschließlich schweren RV mit extra kardiale Manifestation der Dekompensation induziert werden.

Trotz ihrer Einf...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 G IV Venflon Cannula	Becton Dickinson, US	393228	Distal 2 mm of the needle have been cut off
1 mL syringe + 26 G needle	Becton Dickinson, US	303172 & 303800
4-0 absorbable multifilament suture	Covidien, US	GL-46-MG	Polysorb, violet, 5x18"
4-0 multifilament ligature	Covidien, US	LL-221	Polysorb, violet, 98"
Buprenorphine	Indivior UK Limited		Local procurement, Temgesic 0.3 mg/mL
Carprofene	ScanVet, DK	27693	Norodyl 50 mg/mL
Chlorhexidine	Faaborg Pharma, DK		Local procurement
Contractor	Aesculap, Germany	BV010R	Blunt, self retaining, 70 mm
Ear Hooklet	Lawton, Germany	66-0261	Small, 14 cm, tip modified to an angle of 85°
Eye gel	Decra, UK		Lubrithal, Local procurement
Forceps, Delicate Tissue	Lawton, Germany	09-0020
Forceps, Dissecting	Lawton, Germany	09-0013	1 regular, 1 with tip modified to an angle of 100°
Gas Anesthesia System	Penlon Limited, UK	SD0217SL	Sigma Delta Vaporizer
Hair trimmer	Oster	76998-320-051
Horizon Open Ligating Clip Applier	Teleflex, US	137085	Modified with adjustable stop mechanism
Horizon Titanium Clips	Teleflex, US	001200	Small
Induction chamber	N/A
Iris Scissor	Lawton, Germany	05-1450
Iris Scissor	Aesculap, Germany	BC060R
Mechanical ventilator	Ugo Basile, Italy	7025
Microscissor	Lawton, Germany	63-1406
Microscope	Carl Zeiss, Germany	303294-9903
Needle Holder	Lawton, Germany	08-0011	TITEGRIP
Pean	Lawton, Germany	06-0100	Halsted-Mosquito, straight
Pro-Optha	Lohmann & Rauscher, Germany	16515	Tampon
Saline 9 mg/mL	Fresenius Kabi, DK	209319
Sevoflurane	AbbVie, US		Sevorane, Local procurement
Surgical hook	Lawton, Germany	51-0665	Cushing, 19 cm, tip modified to an angle of 90°
Surgical Tape	3M, US	1530-0	Micropore
Temperature Controller	CMA Microdialysis; Sweden	8003760	CMA 450
Weighing machine	VWR, US
Wistar rat weanlings	Janvier Labs, France		RjHan:WI, 100-120 g