Um tronco pulmonar bandagem modelo de sobrecarga de pressão induzida por falha e Hipertrofia Ventricular direita

Resumo

Apresentamos um método cirúrgico para induzir hipertrofia ventricular direita e falha em ratos.

Resumo

Ventrículo direito (RV) falha, que induzido pela sobrecarga de pressão sustentada é dos principais contribuintes para a morbidade e mortalidade em várias doenças cardiopulmonares. Confiáveis e reprodutíveis de modelos animais de falha de RV são garantidos, portanto, a fim de investigar os mecanismos da doença e os efeitos dos potenciais estratégias terapêuticas. Bandagem do tronco pulmonar é um método comum para induzir hipertrofia isolada de RV, mas em geral, modelos descritos anteriormente não conseguiram criar um modelo estável de hipertrofia de RV e falha.

Apresentamos um modelo do rato de pressão sobrecarga induzida RV hipertrofia causada pelo tronco pulmonar bandagem (PTB) que permite que diferentes fenótipos de hipertrofia RV com e sem falha de RV. Nós usamos um modificado ligating aplicador de clips para comprimir um clipe de titânio em torno do tronco pulmonar com um diâmetro interno pré-estabelecidos. Utilizamos diâmetros diferentes clip para induzir diferentes estágios de progressão da doença de leve hipertrofia RV descompensada de RV.

Hipertrofia de RV consistentemente desenvolve em ratos submetidos ao procedimento PTB e dependendo do diâmetro do clipe de bandas aplicado, pode com precisão reproduzimos gravidades diferentes da doença variando de hipertrofia compensada a RV descompensada grave falha com manifestações extra-cardíaca.

O modelo PTB apresentado é um modelo válido e robusto de sobrecarga de pressão induzida por hipertrofia de RV e falha que tem várias vantagens para outros modelos de bandas incluindo alta reprodutibilidade e a possibilidade de induzir a falha de RV grave e descompensada.

Introdução

Ventrículo direito (RV) pode se adaptar a uma sobrecarga de pressão persistente. Em tempo, no entanto, mecanismos adaptativos falharem sustentar o débito cardíaco, dilata o RV e eventualmente falha o RV. Função de RV é o principal fator prognóstico de vários distúrbios cardiopulmonares, incluindo hipertensão arterial pulmonar (HAP), hipertensão pulmonar tromboembólica (CP) e várias formas de cardiopatia congênita com uma sobrecarga de pressão (ou volume) da caravana. Apesar do intenso tratamento, falha de RV continua a ser uma causa predominante de morte nestas condições.

Como consequência as propriedades únicas de^1,2 e desenvolvimento embriológico³ do VD, conhecimento derivado da falha de coração esquerda simplesmente não pode ser extrapolado para certa insuficiência cardíaca. Modelos animais de certa insuficiência cardíaca, portanto, são necessários a fim de investigar os mecanismos de falha de RV e potenciais estratégias de tratamento farmacológico.

Existem experimental modelos de hipertensão pulmonar induzida pela SU5416 combinado com hipóxia (SuHx)⁴ ou monocrotaline (MCT)⁵, que induzem a RV falha devido à doença na vasculatura pulmonar. Estes modelos são usados para avaliar os efeitos terapêuticos de drogas que visam a vasculatura pulmonar. Tanto o SuHx e o modelo do MCT são modelos de pós-carga não fixa de falha de RV. Por conseguinte, não é possível concluir se uma melhoria na função de RV, após uma intervenção é secundária a pós-carga, reduzindo efeitos vasculares pulmonares ou se é causada por efeitos directos sobre a caravana. Além disso, o modelo MCT tem vários efeitos extra-cardíaca.

Em modelos de faixas de tronco pulmonar experimental, a pós-carga do VD é fixo devido a uma obstrução mecânica do tronco pulmonar. Isto permite a investigação de efeitos cardíacos directos de uma intervenção do trailer independente de quaisquer efeitos vascular pulmonar^6,7,8,9. Geralmente, a borda é realizada colocando uma agulha ao longo do tronco pulmonar. Em seguida, uma ligadura é colocada ao redor da agulha e o tronco pulmonar e amarrada com um nó, e a agulha é removida, deixando a sutura em torno do tronco pulmonar. Dependendo do calibre da agulha, diferentes graus de constrições podem ser aplicadas, mas apesar dessa abordagem ser amplamente utilizada, tem algumas desvantagens. Primeiro, o diâmetro da borda não é exatamente o mesmo como o diâmetro exterior da agulha como a ligadura é amarrada ao redor tanto a agulha e o tronco pulmonar. Em segundo lugar, pode haver variação significativa como firmemente o nó é amarrada, tornando-se difícil de reproduzir um certo grau de bandas. Isto levará a uma variação no diâmetro de bandas e, assim, uma maior dispersão. Enfim, o nó pode vir solta ao longo do tempo.

Um estudo aplica-se um clipe de tântalo entreabertos em torno do tronco pulmonar¹⁰. Eles comprimido o clipe em torno do tronco pulmonar para uma área interna de 1,10 mm² e comparou-a com ratos submetidos a borda com uma sutura usando uma agulha de 18 G. Em geral, faixas com o clipe foi associado com menos complicações peri-cirúrgicas e a variância de dados.

Baseada nos princípios descritos por Schou et al.¹¹, estamos ainda mais desenvolvido e caracterizado o tronco pulmonar (PTB) modelo de hipertrofia de RV e falha de borda. Aqui, apresentamos nossa experiência usando este modelo, com base nos resultados de anteriores estudos^12,13. Para este modelo, um clipe de titânio é compactado em torno do tronco pulmonar com um diâmetro interno exato predefinido, que pode ser regulado para induzir diferentes fenótipos de falha de RV.

Protocolo

Todos os ratos foram tratados de acordo com diretrizes nacionais dinamarquês, descritas na lei dinamarquesa em experiências com animais e Portaria Ministerial em experiências com animais. Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional ética e conduzidos de acordo com a legislação dinamarquesa para pesquisas com animais (número de autorização de 2012-15-2934-00384, Ministério da justiça dinamarquês).

1. ajuste de Ligating aplicador de clips

Nota: A bandagem do tronco pulmonar é realizada com um modificado aberto ligating aplicador de clips com uma mandíbula em ângulo. O aplicador é modificado com um mecanismo ajustável parar para parar a compressão, quando as mandíbulas alcançar uma distância exata do outro. Quando um pequeno titânio ligando clip é compactado com o aplicador modificado, um lúmen persiste entre as pernas do clipe com um diâmetro específico de acordo com o ajuste do mecanismo de paragem (Figura 1).

1. Escolher o diâmetro da borda desejada, por exemplo,, 0,6 mm.
2. Ajuste o aplicador de clips ligating 1,0 mm quando totalmente comprimida até que a distância entre as garras. Isto deixa um lúmen de 0,6 mm, como as pernas de dois clip tem uma espessura de 0,2 mm cada.

Figura 1: procedimento do PTB o. (A) o cirúrgico instrumentos utilizados para o procedimento PTB, incluindo ligating aplicador de clips (seta azul). Aplicador de clip-mecanismo (B) o batente ajustável do ligar. Girando a roda dentada (seta azul) irá ajustar a posição do pino (seta amarela), que impede o fechamento do aplicador quando as mandíbulas chegar a uma certa distância um do outro. A distância corresponde a duas vezes a espessura das pernas do clipe, além disso, o diâmetro interno do clipe, quando o clipe é comprimido e pode ser calibrado, usando por exemplo uma agulha com um diâmetro exterior conhecido. (C) o aplicador comprime um clip de titânio para um diâmetro interno exato previamente especificado pelo ajuste do aplicador. Diâmetro (D), o interior do clipe compactado pode ser ajustado para induzir diferentes severidades de hipertrofia de RV e falha. Para os dados apresentados, um diâmetro interno de 1,0 mm foi usado para induzir a hipertrofia suave de RV, um diâmetro interno de 0,6 mm foi usado para induzir moderada insuficiência de RV e um diâmetro interno de 0,5 mm foi usado para induzir insuficiência severa do RV. (E) o clipe após aplicação em torno do tronco pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. preparação do rato

Nota: Outros regimes de analgésicos podem ser aplicadas.

1. Use weanlings de rato Wistar pesando cerca de 100 a 120 g. A fim de manter a temperatura corporal durante a cirurgia, use uma almofada de aquecimento coberto.
2. Para a cirurgia, use um ventilador mecânico, definido como um tidal volume de aproximadamente 1,75 mL e frequência respiratória de 75 por min.
3. Anestesiar o rato com sevoflurano (mistura de 7% em 1,5 L de O₂) em uma câmara de indução por 5 minutos. Entube o rato usando uma cânula de 17 G IV, onde a 2mm distal da agulha foram cortados para que o cateter macio cobrir a ponta. Retire a agulha e conecte a cânula ao ventilador.
4. Coloque o rato sobre as costas da almofada de aquecimento. Certifique-se de que a intubação é correta observando os movimentos do tórax. Estes devem ser, sem diferenças de lado e em ritmo com o ventilador.
   Nota: Ausência de movimentos do tórax, contrações abdominais e inflação do estômago no abdômen superior esquerdo são sinais de um tubo de equivocada. Remover a cânula, ponha o rato na câmara de indução e re-intubar.
5. Após a intubação correta, reduzir o sevoflurano a concentração de manutenção (mistura de 3,5% em_2, O 1,5 L/min) e corrigir as patas do rato para a almofada de aquecimento.
6. Confirme anesthetization prober, verificando os reflexos de retirada das extremidades usando uma pinça para apertar as patas do rato.
7. Injetar os ratos com buprenorfina (0,1 mg/kg por via subcutânea (s.c.)) e carprofene (5 mg/kg s.c.) para aliviar a dor pós-operatória.
8. Depilar o peito e desinfectar com clorexidina.

3. isolamento do tronco pulmonar

1. Com uma tesoura, faça uma incisão de 2 cm na pele ao longo da parte média do esterno. Identificar o músculo peitoral maior e cortar sua fixação esternal. Identifica o 2^nd, 3^rde 4^th costa abaixo.
2. Opcionalmente, pegue o 2^nd costa com uma pinça de fixação, coloque uma sutura (4-0, multifilamento, absorvível) próximo a costa de 2^nd do^st 1 espaço intercostal para parte inferior medial do espaço intercostal 2^nd . Dar um nó firme para ligate artéria torácica anterior.
   Nota: Isso pode ser útil se sangramento da artéria torácica anterior é um problema recorrente.
3. Corte a 4^th, 3^rde 2^nd costa perto do esterno com um par de tesouras e dissecar cuidadosamente os músculos intercostais, até que seja executada uma toracotomia esquerda completa. Se qualquer sangramento da artéria torácica anterior ocorre, comprimir com um mento e ligate a artéria.
4. Inserir um retractor entre o esterno e as costelas e abri-lo para obter um bom campo operatório. Na parte superior do campo é o Timo cobrindo a aorta e o tronco pulmonar. Cuidadosamente, levantar o Timo usando um mento e lançá-lo para cima a fim de expor a aorta e o tronco pulmonar abaixo.
5. Introduza a ponta de um pequeno hooklet cirúrgico com um ângulo de 85° através do seio pericárdico transversal localizado atrás do apêndice atrial esquerdo. Puxe-a meio caminho através do seio e introduza a ponta do gancho da orelha para cima até que ele aparece entre a aorta ascendente e o tronco pulmonar.
   1. Remova qualquer tecido conjuntivo cobrindo a ponta com uma tesoura de íris a fim de separar o tronco pulmonar da aorta ascendente.
   2. Repita a etapa com um gancho maior (opcional).
6. Guie uma pinça músculo angular em torno do tronco pulmonar através da passagem feita com o hook(s). Pegue a ponta de uma cerca de 10 cm ligadura (4-0, multifilamento) e puxar metade da ligadura de volta através da passagem. Agora, o tronco pulmonar é separado da aorta ascendente e pode ser controlado pela ligadura em torno dele.

4. aplicação do clipe

1. Carrega o aplicador de clips ligating ajustado com um clipe. Guie cuidadosamente dentre as garras e uma perna do clipe mas a passagem em torno do tronco pulmonar. Use a ligadura para puxar delicadamente o tronco pulmonar para cima e para dentro do garfo do clipe.
2. Quando o tronco pulmonar está no garfo do clipe e as duas pontas das pernas clip são livres de qualquer tecido conjuntivo, comprima o clip com o aplicador para aplicar a borda.
3. Observar como a RV dilata imediatamente em resposta para a borda e remover a ligadura.

5. fechamento do tórax

1. Remover o mento do Timo e reposicionar o timo para sua posição natural. Remova o afastador.
2. Fechar o tórax em três camadas: a camada intercostal, o músculo peitoral maior e a pele com sutura (4-0, multifilamento, absorvível). Injete 2 mL de solução salina s.c. para substituir o líquido perdido durante a cirurgia.
3. Desligue o sevoflurano e e mantenha o rato sobre o ventilador (1,5 L de O2), até que ele começa a respirar espontaneamente. Em seguida, os tubos com o rato.
4. Tratar os ratos com buprenorfina na água potável para os três dias seguintes¹⁴ ou aplicar um protocolo analgésico semelhante. Depois de três dias, os ratos se recuperaram e estão sem desconforto.
5. Nas semanas seguintes, o bem-estar dos ratos e possíveis efeitos adversos deve ser avaliado em uma base diária. A cicatrização da ferida da toracotomia deve receber atenção especial durante a primeira semana a fim de detectar sinais de infecção ou insuficiência dos cicatrices. Se os ratos mostram sinais de falha prosperar incluindo pele hirsuta, mobilidade prejudicada, problemas respiratórios e perda de peso, deve ser acompanhadas de perto e sacrificados, se perder mais de 20% do seu peso corporal ou desenvolver fulminante respiratória insuficiência.

6. sham cirurgia

1. Fazer uma cirurgia de Souza, seguindo todos os passos acima, exceto para a aplicação do clip (passo 4).

Resultados

Usando o procedimento descrito do PTB em estudos anteriores de nosso grupo^12,13, induzimos hipertrofia RV (PTB suave) por bandas com um clipe de 1,0 mm, um grau moderado de falha de RV (PTB moderado) por bandas com um clipe de 0,6 mm e um grau severo de falha de RV (PTB grave) por bandas com um clipe de 0,5 mm. Os ratos submetidos a severas manifestações bandas desenvolvidas extra-cardíaca da falha de RV, incluindo insuficiênc...

Discussão

Nós descrevemos um método acessível e altamente reprodutível do tronco pulmonar de borda usando um aplicador de clip ligating modificados para comprimir um clipe de titânio em torno do tronco pulmonar. Ajustando o aplicador para comprimir a mola para diferentes diâmetros internos, fenótipos distintos de hipertrofia de RV e falha podem ser induzidos incluindo insuficiência severa da RV com manifestação extra-cardíaca de descompensação.

Apesar de simples, o protocolo contém alguns ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 G IV Venflon Cannula	Becton Dickinson, US	393228	Distal 2 mm of the needle have been cut off
1 mL syringe + 26 G needle	Becton Dickinson, US	303172 & 303800
4-0 absorbable multifilament suture	Covidien, US	GL-46-MG	Polysorb, violet, 5x18"
4-0 multifilament ligature	Covidien, US	LL-221	Polysorb, violet, 98"
Buprenorphine	Indivior UK Limited		Local procurement, Temgesic 0.3 mg/mL
Carprofene	ScanVet, DK	27693	Norodyl 50 mg/mL
Chlorhexidine	Faaborg Pharma, DK		Local procurement
Contractor	Aesculap, Germany	BV010R	Blunt, self retaining, 70 mm
Ear Hooklet	Lawton, Germany	66-0261	Small, 14 cm, tip modified to an angle of 85°
Eye gel	Decra, UK		Lubrithal, Local procurement
Forceps, Delicate Tissue	Lawton, Germany	09-0020
Forceps, Dissecting	Lawton, Germany	09-0013	1 regular, 1 with tip modified to an angle of 100°
Gas Anesthesia System	Penlon Limited, UK	SD0217SL	Sigma Delta Vaporizer
Hair trimmer	Oster	76998-320-051
Horizon Open Ligating Clip Applier	Teleflex, US	137085	Modified with adjustable stop mechanism
Horizon Titanium Clips	Teleflex, US	001200	Small
Induction chamber	N/A
Iris Scissor	Lawton, Germany	05-1450
Iris Scissor	Aesculap, Germany	BC060R
Mechanical ventilator	Ugo Basile, Italy	7025
Microscissor	Lawton, Germany	63-1406
Microscope	Carl Zeiss, Germany	303294-9903
Needle Holder	Lawton, Germany	08-0011	TITEGRIP
Pean	Lawton, Germany	06-0100	Halsted-Mosquito, straight
Pro-Optha	Lohmann & Rauscher, Germany	16515	Tampon
Saline 9 mg/mL	Fresenius Kabi, DK	209319
Sevoflurane	AbbVie, US		Sevorane, Local procurement
Surgical hook	Lawton, Germany	51-0665	Cushing, 19 cm, tip modified to an angle of 90°
Surgical Tape	3M, US	1530-0	Micropore
Temperature Controller	CMA Microdialysis; Sweden	8003760	CMA 450
Weighing machine	VWR, US
Wistar rat weanlings	Janvier Labs, France		RjHan:WI, 100-120 g