Fabricación de una cubierta de Nafion, reduce el óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH Monitor en tiempo real durante la fermentación microbiana

Resumen

Aquí, Divulgamos el protocolo para la fabricación de un sensor de pH micro de chemiresistive de óxido grafeno recubierto de Nafion, polianilina funcionalizados, reducidos electroquímicamente. Este sensor de estado sólido, basada en chemiresistor pH micro puede detectar cambios de pH en tiempo real durante un proceso de fermentación de Lactococcus lactis .

Resumen

Aquí, divulgamos la ingeniería de un sensor de estado sólido pH micro basado en óxido de grafeno funcionalizados de polianilina, electroquímicamente reducida (ERGO-PA). De oxido de grafeno electroquímicamente reducida actúa como la capa conductora y polianilina actúa como una capa sensible al pH. La conductividad pH-dependiente de polianilina se produce por dopaje de agujeros durante la protonación y por la dedoping de los orificios durante el deprotonation. Encontramos que un electrodo de estado sólido de ERGO-PA no era funcional como tal en los procesos de fermentación. La especie electroquímicamente activa que producen las bacterias durante el proceso de fermentación interfiere con la respuesta del electrodo. Se aplicó con éxito Nafion como una capa conductora de protones sobre ERGO-PA. Los electrodos recubiertos de Nafion (ERGO-PA-NA) muestran una buena sensibilidad de 1.71 Ω/pH (pH 4-9) para las mediciones del sensor chemiresistive. Probamos el electrodo ERGO-PA-NA en tiempo real en la fermentación de Lactococcus lactis. Durante el crecimiento de L. lactis, el pH del medio cambia de pH 7.2 a pH 4.8 y la resistencia del electrodo de estado sólido de ERGO-PA-NA cambiado de 294.5 Ω a Ω 288.6 (5,9 Ω por unidad de pH 2,4). La respuesta del pH del electrodo ERGO-PA-NA en comparación con la respuesta de un electrodo de pH de vidrio-basado convencional muestra que los arreglos de discos de estado sólido microsensor de referencia menos operan con éxito en un proceso de fermentación microbiológica.

Introducción

pH desempeña un papel vital en muchos procesos químicos y biológicos. Incluso pequeños cambios en el valor de pH alteran el proceso y afectar negativamente el resultado del proceso. Por lo tanto, es necesario supervisar y controlar el pH durante cada etapa de los experimentos. El electrodo de pH de vidrio-basado se ha utilizado con éxito para controlar pH en muchos procesos químicos y biológicos, aunque el uso de un electrodo de vidrio presenta varias limitaciones para medir pH. El electrodo de pH de vidrio-basados es relativamente grande, frágil, y pequeñas fugas del electrólito en la muestra son posibles. Además, el electrodo y la electrónica es relativamente cara para aplicaciones en la detección de 96 pocillos sistemas de fermentación. Por otra parte, los sensores electroquímicos son invasivos y consumen la muestra. Por lo tanto, es más ventajoso usar sensores no invasivos, sin referencia.

Hoy en día, los sistemas miniaturizados de la reacción son favorecidos en ingeniería química y aplicaciones de la biotecnología como estos microsistemas proporcionan control de proceso mejorado, junto con muchas otras ventajas sobre su macro análogos del sistema. Para monitorear y controlar los parámetros en un sistema miniaturizado es una tarea difícil como los tamaños de los sensores para medir, por ejemplo, el pH y el O₂, deben reducirse al mínimo, así. La exitosa producción de microreactores para sistemas biológicos requieren diferentes tipos de herramientas analíticas para el monitoreo de procesos. Por lo tanto, el desarrollo de microsensores inteligente juega un papel importante en la realización de los procesos biológicos en microreactores.

Recientemente, ha habido varios intentos de desarrollar sensores de pH inteligente usando chemiresistive detección de materiales como los nanotubos de carbono y la realización de polímeros¹. Estos sensores de chemiresistive no requieren ningún electrodo de referencia y son fáciles de integrar con circuitos electrónicos. Sensores de chemiresistive éxito hacen posible producir sensores inteligentes que sean rentables y fáciles de fabricar, requiere un volumen pequeño para probar y son no invasivos.

Aquí, Divulgamos un método para desarrollar un electrodo con óxido de grafeno funcionalizados de polianilina, reducidos electroquímicamente. El electrodo de chemiresistive funciona como un sensor de pH durante una fermentación de L. lactis . L. lactis es una bacteria productora de ácido láctico utilizada en la fermentación de alimentos y procesos conservante de alimentos. Durante la fermentación, la producción de ácido láctico disminuye el pH, y la bacteria deja de crecer a un pH bajo^2,3,4.

Un medio de fermentación es un ambiente complejo químico que contiene péptidos, sales y moléculas redox que tienden a interferir con el sensor superficial^5,6,7,8,9. Este estudio muestra que un sensor de pH basado en material de chemiresistive con una capa de protección superficial adecuada podría utilizarse para medir el pH en este tipo de medios de fermentación compleja. En este estudio, con éxito utilizamos Nafion como la capa de protección de óxido de grafeno recubierto de polianilina, electroquímicamente reducida para medir el pH en tiempo real durante una fermentación de L. lactis .

Protocolo

1. preparación de óxido de grafito

Nota: El óxido de grafito está preparado según el método de^{10,11 de Hummers}.

1. Añadir 3 g de grafito en 69 mL de concentrado H₂para₄ y agitar la solución hasta el grafito ha dispersado totalmente. Añadir 1,5 g de nitrito de sodio y dejarlo durante 1 hora mientras revuelve. Luego, coloque el recipiente en un baño de hielo.
2. Añadir 9 g de permanganato de potasio en la dispersión y retire el recipiente del baño de hielo. Deje que la solución se caliente a temperatura ambiente.
3. En primer lugar, añadir 138 mL de agua destilada gota a gota. Luego, continúe añadiendo 420 mL de agua destilada. Mantener la temperatura a 90 ° C durante 15 minutos usando una placa. Añadir 7,5 mL de peróxido de hidrógeno 30% a la dispersión.
4. Recoger el producto mediante centrifugación a 10.000 x g por 20 min y eliminar la solución sobrenadante. Lavar el precipitado 4 x con agua destilada doble y 2 x con una solución de ácido clorhídrico (v/v) de 10%. Por último, lavar 2 x con etanol y secar a 50 º C en el horno.

2. preparación del electrodo GO-depositado

1. Dispersar a 10 mg de óxido de grafito en 10 mL de agua y luego someter a lo ultrasonidos en un baño ultrasónico durante 6 h.
2. Quitar las escamas de óxido de grafito unexfoliated por centrifugación durante 30 min a 2.700 x g. descarte las partículas sólidas después de la centrifugación y utilice el sobrenadante para experimentos adicionales.
   Nota: Utilizamos esta dispersión de escamas exfoliada de ir como la solución.
3. Diluir la solución madre de ir dos veces. Siempre preparar una solución fresca de trabajo ir de la solución.
4. Añadir 2 μl de la solución de trabajo de ir en la parte superior un descubierto oro de electrodos interdigitados (figura 1A y figura 2). Después de la caída de fundición, seque el electrodo a temperatura ambiente durante 12 h. Este es el electrodo depositado ir.

3. reducción de ir a electroquímicamente reducción de oxido de grafeno

1. Introducir el electrodo en el portaelectrodo de polidimetilsiloxano (PDMS) (pieza de la parte inferior). Coloque la otra parte de la pinza portaelectrodos, que sirve como un reservorio de solución, en la parte superior del electrodo como se muestra en la figura 1A - 1C. Montar los soportes por recortar las dos partes con dos clips de papel. Asegúrese de que el titular PDMS no cubre la parte de electrodo deposita ir.
2. Pipeta 300 μL de tampón de fosfato 0.2m (pH 7) en el depósito. Luego, coloque la referencia y el electrodo de contador en la solución de tal manera que los electrodos se colocan cerca de la superficie de la película GO, como se muestra en la figura 1. Esta configuración sirve como una celda electroquímica para llevar a cabo la reducción electroquímica de GO y para deposición de polianilina.
3. Conectar los electrodos con el potenciostato conectado a un ordenador para la adquisición de datos. Uso de voltametría cíclica para la reducción electroquímica: seleccione 0 para -1,2 V como una oferta potencial y 50 mV/s como la frecuencia de barrido. Ciclo de la tensión sobre el electrodo entre 0 a -1,2 V 10 x (figura 3).
4. Después del experimento, retire el electrodo del soporte y lávelo varias veces con agua destilada doble. A continuación, seque el electrodo en un horno a 101 ° C por 12 h.
5. Cuando el electrodo está seco, retire el electrodo del horno y déjelo enfriar a temperatura ambiente. Luego, se mide la conductividad del electrodo con un multímetro. El electrodo se conoce ahora como un electrodo de óxido (ERGO) de grafeno electroquímicamente reducida.

4. polianilina funcionalización de la ERGO electrodo

1. Preparar anilina monómero de 10 mM para la funcionalización de la polianilina. Disolver 5 μl de anilina de 10 mM en 5 mL de 1 M H₂hasta₄.
2. Para la funcionalización de la polianilina, añadir 300 μL de monómero anilina para el depósito de solución. Coloque el electrodo ERGO-depositado en el soporte de electrodo como se describe en el procedimiento para la reducción de GO.
3. Uso de voltametría cíclica para la electropolymerization de anilina para funcionalizar ERGO en ERGA-polianilina (ERGO-PA): seleccione 0 y 0,9 V como una oferta potencial y 50 mV/s como la frecuencia de barrido. Ciclo de la tensión sobre el electrodo entre 0 y 0,9 V por 50 x (figura 4).
4. Después de la deposición de polianilina, quitar el electrodo y lavar varias veces con agua destilada doble. Luego, seque el electrodo a 80 ° C en el horno durante 12 h.
5. Retire el electrodo del horno y déjelo enfriar a temperatura ambiente antes de medir la conductividad del electrodo con un multímetro.
6. Preparar una solución amortiguadora de pH 5 añadiendo 0,2 M NaOH a la solución de tampón de Britton-Robinson hasta pH 5 (consulte el paso 5.1). Mantener el electrodo en el buffer a pH 5 durante 24 h.
   1. Para preparar una solución de buffer universal Britton-Robinson, mezcla de 0,04 mol de ácido fosfórico 0,04 mol de ácido acético y 0,04 mol de ácido bórico en 0.8 L de agua ultrapura. Añadir hidróxido de sodio de 0.2 M gota a gota a la solución tampón hasta alcanzar el pH deseado⁴. Añadir agua ultrapura hasta el volumen final es de 1 L.

5. ERGO-PA electrodo pruebas a diferentes pH (calibración previa antes de la capa de Nafion)

1. Luego de acondicionar los electrodos en solución amortiguadora de pH 5, mida la resistencia del electrodo en soluciones de diferentes pH (de pH 4 a pH 9; ver figura 5).
   1. Para esta medición, sumergir el electrodo directamente en la solución tampón y conecte la otra parte del electrodo el potenciostato controlado por ordenador para la adquisición de datos. Cambiar el pH por valoración con NaOH M 0,2.
   2. Elegir la lista de técnicas de redisolución o Amperometría curva i-t y se aplica una diferencia potencial de 100 mV al electrodo.
      Nota: El potenciostato mide la corriente contra el tiempo. El software controla el potenciostato proporciona una representación gráfica de la corriente contra el tiempo.
   3. Utilizar la ley de Ohm (resistencia iguala Voltaje dividido por la corriente) para calcular el valor de la resistencia de la tensión medida actual y aplicada.
2. Después de las mediciones, seque el electrodo a temperatura ambiente durante 12 h.

6. preparación del electrodo revestido de Nafion ERGO-PA

1. Añadir 5 μl de 5 wt % Nafion en la parte superior del electrodo de ERGO-PA y seque el electrodo a temperatura ambiente durante 12 h.
2. Después de la capa de Nafion, mantener el electrodo en la solución tampón a pH 5 durante 24 h antes de las mediciones de pH.
3. Después de condicionar en pH 5, quitar el electrodo revestido de Nafion ERGO-PA (ERGO-PA-NA) y mida la resistencia del electrodo de pH 4 a pH 9, como se mencionó en la sección 5.1 (figura 6).

7. preparación de medio de cultivo de L. lactis

1. Añadir 9,3 g de M17 polvo en 250 mL de agua ultrapura. Poco a poco agite la solución hasta que el polvo se disuelva completamente. Autoclave de la solución a 121 ° C durante 15 minutos.
2. Tomar un matraz de 250 mL esterilizado con una barra agitadora por imán y añadir 50 mL del medio M17 esterilizado al matraz. Entonces, añada 8 mL de solución de glucosa de 1 M esterilizado. Inocular la solución con 10 μl de un cultivo de L. lactis , previamente crecido en el mismo medio de cultivo.
   Nota: Se obtuvo la cepa bacteriana de Jan Kok, Genética Molecular, Universidad de Groningen.
3. Coloque el matraz con el medio de cultivo inoculado para 18 h sobre una placa de agitador magnético en una estufa de incubación a 30 ° C mientras que revuelve y vigilar el pH.

8. prueba del pH ERGO-PA-NA respuesta en un experimento de fermentación de L. lactis

1. Coloque el electrodo de ERGO-PA-NA en la cultura L. lactis y cierre con un tapón de algodón. Luego, coloque el ajuste el termostato a 30 º C para crecer L. lactis.
2. Aplicar 100 mV para el electrodo y la medida de la corriente contra el tiempo.
3. Tomar muestras de 0.5 mL en diferentes puntos temporales (ver, por ejemplo, figura 7) off-line Mida la densidad óptica a 600 nm y el pH con un electrodo de vidrio convencional. Continúe las mediciones de la densidad óptica de la cultura se convierte en constante, lo que indica que las bacterias no crecen más.

Resultados

La aparición de un pico de reducción fuerte alrededor -1,0 V (figura 3) muestra la reducción del ir a ERGO^12,13,14,22. La intensidad del pico depende del número de capas de ir sobre el electrodo. Una película gruesa de negro totalmente cubierto los hilos de oro sobre el electrodo. En ese momento, los dos electrodos de oro aisla...

Discusión

Es esencial que el ir capas totalmente cubierta de los cables de electrodo de oro después de la deposición de GO. Si los electrodos de oro no están cubiertos con GO, polianilina no sólo depositarán en ERGO sino también en los cables de electrodo de oro visible directamente. Deposición de polianilina en los cables de electrodo de oro puede tener implicaciones en el rendimiento del electrodo. Después de la reducción del ir a ERGO, el electrodo se seca a 100 ° C para fortalecer la vinculación entre la capa ERGO y...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Graphite flakes	Sigma Aldrich
Sulfuric acid (H2SO4)	Merck
Sodium nitrite (NaNO2)	Sigma Aldrich
Potassium permanganate (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Aniline	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 powder	BD Difco
Phosphoric acid (H3PO4)	Sigma Aldrich
Boric acid (HBO3)	Merck
Acetic acid	Merck
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Dipostassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Au Interdigitated electrodes	BVT technology - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)