Produzione di Nafion rivestite, ridotto grafene ossido/Polyaniline Chemiresistive sensore al pH Monitor in Real-Time durante la fermentazione microbica

Riepilogo

Qui, segnaliamo il protocollo per la realizzazione di un sensore di pH micro di Nafion-rivestito, polyaniline-funzionalizzati, elettrochimicamente ridotta grafene ossido chemiresistive. Questo sensore a stato solido, basato su chemiresistor di pH micro in grado di rilevare variazioni di pH in tempo reale durante un processo di fermentazione di Lactococcus lactis .

Abstract

Qui, segnaliamo l'ingegnerizzazione di un sensore di pH micro a stato solido basato su polyaniline-funzionalizzati, elettrochimicamente ridotta grafene ossido (ERGO-PA). Elettrochimicamente ridotta grafene ossido agisce come lo strato conduttivo e polianilina agisce come un livello di pH sensibili. La conducibilità di pH-dipendente di polyaniline si verifica dal doping dei fori durante protonazione e da dedoping dei fori durante deprotonazione. Abbiamo trovato che un elettrodo a stato solido di ERGO-PA non era funzionale come tale nei processi di fermentazione. Le specie elettrochimicamente attive che i batteri producono durante il processo di fermentazione interferiscano con la risposta dell'elettrodo. Abbiamo applicato con successo Nafion come uno strato di conduzione di protone sopra ERGO-PA. Gli elettrodi rivestiti di Nafion (ERGO-PA-NA) mostrano una buona sensibilità di 1,71 Ω/pH (pH 4-9) per le misure dei sensori chemiresistive. Abbiamo testato l'elettrodo ERGO-PA-NA in tempo reale in fermentazione di Lactococcus lactis. Durante la crescita di L. lactis, il pH del terreno è cambiato da pH 7.2 a pH 4.8 e la resistenza dell'elettrodo a stato solido ERGO-PA-NA cambiato da Ω 294.5 a 288,6 Ω (5,9 Ω per unità di pH 2.4). La risposta di pH dell'elettrodo ERGO-PA-NA rispetto alla risposta di un elettrodo di pH di base di vetro convenzionale mostra che le matrici di riferimento-meno a stato solido microsensor operano con successo in una fermentazione microbiologica.

Introduzione

pH svolge un ruolo fondamentale in molti processi chimici e biologici. Anche piccoli cambiamenti nel valore pH alterare il processo e influenzare negativamente l'esito del processo. Quindi, è necessario monitorare e controllare il pH durante ogni fase di esperimenti. L'elettrodo pH di base di vetro è stato utilizzato con successo per monitorare il pH in molti processi chimici e biologici, anche se l'uso di un elettrodo di vetro pone diverse limitazioni per misurare il pH. L'elettrodo pH di base di vetro è relativamente grande, fragile, e piccole perdite di elettroliti nel campione sono possibili. Inoltre, l'elettrodo e l'elettronica è relativamente costosi per applicazioni nello screening di 96 pozzetti sistemi di fermentazione. Inoltre, i sensori elettrochimici sono invasivi e consumano il campione. Quindi, è più vantaggioso utilizzare sensori non invasivi, senza riferimento.

Al giorno d'oggi, sistemi di reazione miniaturizzati sono favoriti in molte applicazioni di biotecnologia e ingegneria chimica come questi microsistemi forniscono il controllo di processo avanzato, insieme a molti altri vantaggi rispetto loro macro analoghi di sistema. Per monitorare e controllare i parametri in un sistema miniaturizzato è un compito impegnativo come le dimensioni del sensore per la misura, per esempio, pH e O₂, devono essere ridotti al minimo anche. Il successo della produzione di microreattori per sistemi biologici richiedono diversi tipi di strumenti analitici per il monitoraggio del processo. Quindi, lo sviluppo di microsensori intelligenti gioca un ruolo significativo nello svolgimento dei processi biologici in microreattori.

Recentemente, ci sono stati diversi tentativi per sviluppare sensori di pH intelligente utilizzando chemiresistive rilevamento materiali come i nanotubi di carbonio e la conduzione di polimeri¹. Questi sensori di chemiresistive non richiedono nessun elettrodo di riferimento e sono facili da integrare con circuiti elettronici. Successo chemiresistive sensori rendono possibile la produzione di sensori intelligenti che sono convenienti e facili da produrre, richiedono un piccolo volume per il test e sono non invasivi.

Qui, segnaliamo un metodo per sviluppare un elettrodo con ossido di graphene polyaniline-funzionalizzati, elettrochimicamente ridotta. L'elettrodo di chemiresistive funziona come un sensore di pH durante una fermentazione di L. lactis . L. lactis è un batterio lattico-acido-produttori usato nei processi conservante alimentare e fermentazione degli alimenti. Durante la fermentazione, la produzione di acido lattico abbassa il pH e il batterio smette di crescere a un basso pH^2,3,4.

Un mezzo di fermentazione è un complesso ambiente chimico che contiene peptidi, sali e molecole redox che tendono ad interferire con il sensore di superficie^5,6,7,8,9. Questo studio indica che un sensore di pH basato su materiale chemiresistive con uno strato di protezione superficiale adeguata potrebbe essere utilizzato per misurare il pH in questo tipo di fermentazione complessi supporti. In questo studio, utilizziamo con successo Nafion come lo strato di protezione per ossido di graphene polyaniline-rivestito, elettrochimicamente ridotta per misurare il pH in tempo reale durante una fermentazione di L. lactis .

Protocollo

1. preparazione di ossido di grafite

Nota: Ossido di grafite è preparato secondo il metodo^{10,11 degli Hummer}.

1. Aggiungere 3 g di grafite in 69 mL di concentrato H₂così₄ e mescolare la soluzione fino a quando la grafite ha completamente dispersa. Aggiungere 1,5 g di nitrito di sodio e lasciare per 1 h continuando a mescolare. Quindi, mettere il recipiente in un bagno di ghiaccio.
2. Aggiungere 9 g di permanganato di potassio in dispersione e togliere il contenitore dal bagno di ghiaccio. Lasciare la soluzione di riscaldare a temperatura ambiente.
3. In primo luogo, aggiungere 138 mL di acqua distillata goccia a goccia. Quindi, continuare ad aggiungere 420 mL di acqua distillata. Mantenere la temperatura a 90 ° C per 15 min utilizzando una piastra riscaldante. Aggiungere 7,5 mL di perossido di idrogeno 30% la dispersione.
4. Raccogliere il prodotto mediante centrifugazione a 10.000 x g per 20 minuti e scartare il supernatante. Lavare la pallina 4 x con acqua bidistillata calda e 2x con una soluzione di HCl (v/v) 10%. Infine, lavarlo 2x con etanolo e asciugarla a 50 ° C nel forno.

2. GO-depositato Elettrodo preparazione

1. Disperdere 10 mg di ossido di grafite in 10 mL di acqua e quindi sottoporre ad ultrasuoni in un bagno ad ultrasuoni per 6 h.
2. Rimuovere le scaglie di ossido di grafite unexfoliated mediante centrifugazione per 30 min a 2.700 x g. gettare le particelle solide dopo centrifugazione e utilizzare il surnatante per ulteriori esperimenti.
   Nota: Abbiamo usato questa dispersione di fiocchi GO esfoliata come soluzione di riserva.
3. Diluire la soluzione madre di andare due volte. Sempre preparare una soluzione di lavoro GO fresca dalla soluzione stock.
4. Aggiungere 2 µ l di soluzione di lavoro di andare sulla cima di un elettrodo d'oro interdigitating esposta (Figura 1A e Figura 2). Dopo la discesa di colata, asciugare l'elettrodo a temperatura ambiente per 12 h. Questo è l'elettrodo GO-depositati.

3. riduzione dei andare in elettrochimicamente riduttrice dell'ossido di Graphene

1. Inserire l'elettrodo nel portaelettrodo polidimetilsilossano (PDMS) (parte inferiore). Inserire l'altra parte della porta elettrodi, che funge da serbatoio soluzione, in cima l'elettrodo come mostrato in Figura 1A - 1C. Assemblare i titolari fissando le due parti insieme con due graffette. Assicurarsi che il titolare PDMS non copre la parte di GO-depositato elettrodo.
2. Dispensare 300 µ l di tampone fosfato 0,2 M (pH 7) nel serbatoio. Quindi, inserire il riferimento e il controelettrodo nella soluzione in modo tale che gli elettrodi siano posizionati vicino alla superficie del film GO, come mostrato in Figura 1. Questo set-up serve come una cella elettrochimica per eseguire la riduzione elettrochimica di GO e per deposizione polyaniline.
3. Collegare gli elettrodi con il potenziostato collegato ad un computer per l'acquisizione dati. Utilizzare voltammetria ciclica per la riduzione elettrochimica: selezionare 0 a -1,2 V come un'autonomia potenziale e 50 mV/s come la velocità di scansione. La tensione del ciclo sopra l'elettrodo compreso tra 0 e -1,2 V 10 x (Figura 3).
4. Dopo l'esperimento, rimuovere l'elettrodo dal supporto e lavare ripetutamente con acqua bidistillata. Quindi, asciugare l'elettrodo in un forno a 101 ° C per 12 h.
5. Quando l'elettrodo è asciutto, rimuovere l'elettrodo dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Quindi, misurare la conducibilità dell'elettrodo con un multimetro. L'elettrodo è ora definita da un elettrodo di elettrochimicamente ridotta grafene ossido (ERGO).

4. polianilina funzionalizzazione della ERGO elettrodo

1. Preparare il monomero dell'anilina 10 mM per la funzionalizzazione di polyaniline. Sciogliere 5 µ l di anilina di 10 mM in 5 mL di 1 M H₂così₄.
2. Per la funzionalizzazione di polyaniline, aggiungere 300 µ l di anilina monomero il serbatoio di soluzione. Inserire l'elettrodo ERGO-depositati pinza porta elettrodo, come descritto nella procedura per la riduzione del GO.
3. Utilizzare voltammetria ciclica per l'elettropolimerizzazione di anilina per funzionalizzare ERGO in ERGA-polyaniline (ERGO-PA): 0-0,9 V, selezionare come un'autonomia potenziale e 50 mV/s come la velocità di scansione. La tensione del ciclo sopra l'elettrodo tra 0-0,9 V per 50 x (Figura 4).
4. Dopo la deposizione di polyaniline, rimuovere l'elettrodo e lavare ripetutamente con acqua bidistillata. Quindi, asciugare l'elettrodo a 80 ° C in forno per 12 h.
5. Rimuovere l'elettrodo dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di misurare la conducibilità dell'elettrodo con un multimetro.
6. Preparare una soluzione tampone a pH 5 aggiungendo 0,2 M NaOH alla soluzione tampone Britton-Robinson fino a pH 5 (Vedi punto 5.1). Mantenere l'elettrodo nel buffer a pH 5 per 24 h.
   1. Per preparare una soluzione di tampone universale Britton-Robinson, mescolare 0,04 mol di acido fosforico, 0,04 mol di acido acetico e 0,04 mol di acido borico in 0,8 L di acqua ultrapura. Aggiungere 0,2 M di idrossido di sodio goccia a goccia di soluzione tampone fino a pH desiderato⁴. Aggiungere acqua distillata fino a quando il volume finale è 1 L.

5. ERGO-PA elettrodo test a diversi pH (pre-calibrazione prima di Nafion rivestimento)

1. Dopo il condizionamento l'elettrodo in una soluzione tampone a pH 5, misurare la resistenza dell'elettrodo in soluzioni di pH differenti (da pH 4 a pH 9; Vedi Figura 5).
   1. Per questa misurazione, immergere l'elettrodo direttamente nella soluzione tampone e connettersi l'altra parte dell'elettrodo il potenziostato computerizzato per l'acquisizione dati. Modificare il pH di titolazione con 0.2 M NaOH.
   2. Scegliere cronopotenziometria o amperometria curva i-t dall'elenco delle tecniche e applicare una differenza di potenziale 100 mV all'elettrodo.
      Nota: Il potenziostato misura la corrente contro il tempo. Il software che controlla il potenziostato fornisce una rappresentazione grafica della corrente contro il tempo.
   3. Utilizzare la legge di Ohm (resistenza equivale a tensione diviso dalla corrente) per calcolare il valore di resistenza dalla tensione applicata e corrente misurata.
2. Dopo le misurazioni, asciugare l'elettrodo a temperatura ambiente per 12 h.

6. preparazione dell'elettrodo rivestito di Nafion ERGO-PA

1. Aggiungere 5 µ l del 5% in peso Nafion in cima l'elettrodo ERGO-PA e asciugare l'elettrodo a temperatura ambiente per 12 h.
2. Dopo il rivestimento di Nafion, tenere l'elettrodo nella soluzione tampone a pH 5 per 24 h prima di misurazioni del pH.
3. Dopo il condizionamento a pH 5, rimuovere l'elettrodo rivestito di Nafion ERGO-PA (ERGO-PA-NA) e misurare la resistenza dell'elettrodo da pH 4 a pH 9 come indicato nella sezione 5.1 (Figura 6).

7. preparazione del terreno di coltura di L. lactis

1. Aggiungere 9,3 g di polvere di M17 in 250 mL di acqua ultrapura. Agitare lentamente la soluzione fino a quando la polvere si dissolve completamente. Sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 15 min.
2. Prendere un pallone sterilizzato da 250 mL con un bar di agitatore magnetico e aggiungere 50 mL di terreno sterilizzato M17 al pallone. Quindi, aggiungere 8 mL di soluzione di glucosio 1 M in autoclave. Inoculare la soluzione con 10 µ l di una cultura di L. lactis , precedentemente coltivata in terreno di coltura stessa.
   Nota: Il ceppo batterico è stato ottenuto da Jan Kok, genetica molecolare, Università di Groninga.
3. Collocare la beuta con coltura inoculato per 18 h su un piatto di agitatore magnetico in un forno di incubazione a 30 ° C mescolando e monitorare il pH.

8. test del pH ERGO-PA-NA risposta in un esperimento di fermentazione di L. lactis

1. Inserire l'elettrodo di ERGO-PA-NA la cultura di L. lactis e chiudere con un tappo di cotone. Quindi, inserire il set-up il termostato a 30 ° C a crescere L. lactis.
2. Applicare 100 mV all'elettrodo e misurare la corrente contro il tempo.
3. Prelevare campioni di 0,5 mL in diversi momenti (Vedi, per esempio, nella figura 7) off-line misurare la densità ottica a 600 nm e il pH con un elettrodo di vetro convenzionali. Continuare le misurazioni fino a quando la densità ottica della coltura diventa costante, che indica che i batteri non crescono piu '.

Risultati

Illustrato l'aspetto di un picco di forte riduzione circa -1,0 V (Figura 3) la riduzione del GO al ERGO^12,13,14,22. L'intensità del picco dipende dal numero di strati di andare sull'elettrodo. Una spessa pellicola nera completamente coperto i fili d'oro sull'elettrodo. A quel punto, i due elettrodi d'oro isolati erano conduttivi pe...

Discussione

È essenziale che il GO strati completamente coprire i cavi degli elettrodi d'oro dopo la deposizione del GO. Se gli elettrodi d'oro non sono coperti con GO, polianilina non solo depositare ERGO ma anche i cavi degli elettrodi d'oro visibile direttamente. Deposizione di polyaniline sui cavi degli elettrodi d'oro può avere implicazioni sulle prestazioni dell'elettrodo. Dopo la riduzione di Vai a ERGO, l'elettrodo viene essiccato a 100 ° C per rafforzare il legame tra lo strato ERGO e i cavi degli elettrodi d'oro. La res...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Graphite flakes	Sigma Aldrich
Sulfuric acid (H2SO4)	Merck
Sodium nitrite (NaNO2)	Sigma Aldrich
Potassium permanganate (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Aniline	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 powder	BD Difco
Phosphoric acid (H3PO4)	Sigma Aldrich
Boric acid (HBO3)	Merck
Acetic acid	Merck
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Dipostassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Au Interdigitated electrodes	BVT technology - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)