Fabricação de um Nafion-revestido, reduzido grafeno óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH de Monitor em tempo real durante a fermentação microbiana

Resumo

Aqui, nós relatamos o protocolo para a preparação de um sensor de pH micro grafeno Nafion-revestido, acrescida de polianilina, eletroquimicamente reduzida de óxido de chemiresistive. Este sensor de estado sólido, baseado em chemiresistor, pH micro pode detectar mudanças de pH em tempo real durante o processo de fermentação Lactococcus lactis .

Resumo

Aqui, nós relatamos a engenharia de um sensor de estado sólido micro pH baseado no óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida, acrescida de polianilina (ERGO-PA). Óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida atua como a camada de condução e polianilina age como uma camada de sensíveis ao pH. A condutividade pH-dependente de polianilina ocorre por doping de buracos durante a protonação e o dedoping de buracos durante deprotonação. Nós achamos que um eletrodo de estado sólido de ERGO-PA não era funcional como tal em processos de fermentação. A espécie eletroquimicamente ativa que as bactérias produzem durante o processo de fermentação interfere com a resposta do eletrodo. Aplicamos com sucesso Nafion como uma camada de próton-conduzindo sobre ERGO-PA. Os eletrodos revestidos Nafion (ERGO-PA-NA) mostram uma boa sensibilidade de 1,71 Ω/pH (pH 4-9) para medições de sensor chemiresistive. Nós testamos o eléctrodo de ERGO-PA-em tempo real na fermentação de Lactococcus lactis. Durante o crescimento de L. lactis, o pH do meio alterado de pH 7,2 pH 4,8 e a resistência do eletrodo ERGO-PA-NA Solid-State mudado de Ω 294.5 para 288.6 Ω (5.9 Ω por unidade de pH 2,4). A resposta de pH do eléctrodo ERGO-PA-em comparação com a resposta de um eletrodo de pH com base em vidro convencional mostra que as matrizes de referência-menos estado sólido microsensor operam com sucesso em uma fermentação microbiológica.

Introdução

pH desempenha um papel vital em muitos processos químicos e biológicos. Mesmo as pequenas alterações no valor do pH alteram o processo e afectar negativamente o resultado do processo. Portanto, é necessário monitorar e controlar o valor de pH durante todas as fases dos experimentos. O eletrodo de pH com base em vidro tem sido utilizado com sucesso para monitorar o pH em muitos processos químicos e biológicos, embora a utilização de um eléctrodo de vidro representa várias limitações para medir o pH. O eletrodo de pH com base em vidro é relativamente grande, frágil, e as pequenas fugas do eletrólito para a amostra são possíveis. Além disso, o eletrodo e eletrônica é relativamente caras para aplicações em triagem de 96 poços sistemas de fermentação. Além disso, os sensores eletroquímicos são invasivos e consomem a amostra. Portanto, é mais vantajoso usar sensores não-invasivo, sem referência.

Hoje em dia, sistemas miniaturizados de reação são favorecidos em muitas aplicações de biotecnologia e engenharia química, como estes microsystems fornecem controle de processo avançado, juntamente com muitas outras vantagens sobre seu macro análogos de sistema. Para monitorar e controlar os parâmetros em um sistema miniaturizado é uma tarefa desafiadora, como os tamanhos do sensor para medir, por exemplo, pH e O₂, precisa ser minimizada também. O sucesso da produção de microreactors para sistemas biológicos requerem diferentes tipos de ferramentas analíticas para monitoramento de processo. Portanto, o desenvolvimento de Microssensores inteligente desempenha um papel significativo na realização de processos biológicos em microreactors.

Recentemente, tem havido várias tentativas de desenvolver sensores de pH inteligente usando chemiresistive sensoriamento materiais como nanotubos de carbono e realização de polímeros¹. Estes sensores de chemiresistive não exigem nenhum eletrodo de referência e são fáceis de integrar com circuitos eletrônicos. Sensores chemiresistive sucesso tornam possível para produzir sensores inteligentes que são de baixo custo e fácil de fabricar, requerem um volume pequeno para testes e são invasivos.

Aqui, nós relatamos um método para desenvolver um eletrodo com óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida, acrescida de polianilina. O eletrodo de chemiresistive funciona como um sensor de pH durante uma fermentação de L. lactis . L. lactis é uma bactéria produtoras de ácido láctico utilizada na fermentação de alimentos e processos de conservante de alimentos. Durante a fermentação, a produção de ácido lático diminui o pH, e a bactéria para de crescer em um baixo pH^2,3,4.

Um meio de fermentação é um complexo ambiente químico que contém peptídeos, sais e moléculas redox que tendem a interferir com o sensor de superfície^5,6,7,8,9. Este estudo mostra que um sensor de pH com base em material chemiresistive com uma camada de proteção de superfície adequada poderia ser usado para medir o pH neste tipo de mídia de fermentação complexo. Neste estudo, com sucesso usamos Nafion como a camada de proteção para óxido de grafeno polianilina-revestido, eletroquimicamente reduzida para medir o pH em tempo real durante uma fermentação de L. lactis .

Protocolo

1. preparação de óxido de grafite

Nota: Óxido de grafite é preparado de acordo com o método de^{10,11 dos Hummers}.

1. Adicione 3 g de grafite em 69 mL de concentrado H₂para₄ e agitar a solução até o grafite completamente se dispersou. Adicionar 1,5 g de nitrito de sódio e deixe por 1h, agitando. Então, coloque o recipiente em banho de gelo.
2. Adicionar 9 g de permanganato de potássio para a dispersão e remova o recipiente do banho de gelo. Permitir que a solução aquecer a temperatura ambiente.
3. Primeiro, adicione 138 mL de água destilada gota a gota. Em seguida, continue a adicionar 420 mL de água destilada. Manter a temperatura a 90 ° C por 15 min, usando uma placa de aquecimento. Adicione 7,5 mL de peróxido de hidrogênio 30% para a dispersão.
4. Recolher o produto por centrifugação a 10.000 x g por 20 min e descartar o sobrenadante. Lave o pellet 4 x com água bidestilada morna e 2x com uma solução de HCl (v/v) de 10%. Finalmente, lavá-lo 2 x com etanol e secar a 50 ° C no forno.

2. GO-depositado eletrodo preparação

1. Dispersar a 10 mg de óxido de grafite em 10 mL de água e em seguida proceda à sonicação isso em um banho ultra-sônico para 6 h.
2. Retire os flocos de óxido de grafite unexfoliated por centrifugação por 30 min em 2.700 x g. descartar as partículas sólidas após centrifugação e usar o sobrenadante para novas experiências.
   Nota: Usamos esta dispersão de flocos esfoliada GO como solução-mãe.
3. Dilua a solução-mãe ir duas vezes. Sempre prepare uma solução de trabalho de GO fresca de solução-mãe.
4. Adicione 2 µ l da solução de trabalho de ir em cima de um eletrodo ouro interdigitantes exposta (figura 1A e Figura 2). Após a queda de fundição, seque o eletrodo em temperatura ambiente por 12 h. Este é o eletrodo de GO-depositado.

3. redução de ir para óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida

1. Inserir o eletrodo no porta-eletrodo polydimethylsiloxane (PDMS) (parte inferior). Coloque a outra parte do porta-eletrodo, que serve como um reservatório de solução, em cima do eletrodo como mostrado na figura 1A - 1C. Monte os suportes por recorte as duas partes juntas, usando dois clipes de papel. Certifique-se de que o titular PDMS não abrange a parte do eletrodo GO-depositado.
2. Pipeta 300 µ l de tampão de fosfato 0,2 M (pH 7) no reservatório. Em seguida, coloque a referência e o eletrodo contador na solução de tal forma que os eléctrodos são colocados perto da superfície do filme GO, como mostrado na Figura 1. Esta afinação serve como uma célula eletroquímica para realizar redução eletroquímica de GO e para deposição de polianilina.
3. Conecte os eletrodos com o potentiostat ligado a um computador para aquisição de dados. Use voltametria cíclica de redução eletroquímica: Selecione 0 para -1,2 V como uma gama de potencial e 50 mV/s como a velocidade de varredura. Ciclo da tensão sobre o eletrodo entre 0 a -1,2 V 10 x (Figura 3).
4. Após o experimento, retire o eletrodo do porta e lavá-lo várias vezes com água bidestilada. Em seguida, seque o eletrodo em um forno a 101 ° C, durante 12 h.
5. Quando o eletrodo estiver seco, retire o eletrodo do forno e deixe-o arrefecer à temperatura ambiente. Em seguida, medir a condutividade do eléctrodo com um multímetro. O eletrodo é agora referido como um eletrodo de óxido (ERGO) grafeno eletroquimicamente reduzida.

4. a polianilina Functionalization do ERGO eletrodo

1. Prepare o monômero anilina de 10 mM para a polianilina functionalization. Dissolver 5 µ l de anilina de 10 mM em 5 mL de 1 M H₂então₄.
2. Para a polianilina functionalization, adicione 300 µ l de monômero anilina para o reservatório de solução. Coloque o eléctrodo ERGO-depositada no porta-eletrodo, conforme descrito no procedimento para redução de ir.
3. Use voltametria cíclica para a electropolymerization de anilina para funcionalizar ERGO em ERGA-polianilina (ERGO-PA): Selecione 0 para 0.9 V como uma gama de potencial e 50 mV/s como a velocidade de varredura. Ciclo da tensão sobre o eletrodo entre 0 a 0,9 V para 50 x (Figura 4).
4. Após a deposição de polianilina, remover o eléctrodo e lavá-lo várias vezes com água bidestilada. Em seguida, seque o eletrodo a 80 ° C no forno por 12 h.
5. Retire o eletrodo do forno e deixe-o arrefecer à temperatura ambiente antes de medir a condutividade do eléctrodo com um multímetro.
6. Prepare uma solução tampão de pH 5 pela adição de 0,2 M de NaOH a solução-tampão de Britton-Robinson até pH 5 (consulte a etapa 5.1). Mantenha o eletrodo no buffer pH 5 para 24h.
   1. Para preparar uma solução-tampão universal Britton-Robinson, misture 0,04 mol de ácido fosfórico, 0,04 mol de ácido acético e 0,04 mol de ácido bórico, 0,8 litros de água ultrapura. Adicione 0,2 M de hidróxido de sódio gota a gota à solução tampão até pH desejado é atingido⁴. Adicionar água ultrapura até o volume final é 1 L.

5. ERGO-PA eletrodo testes em diferente pH (pré-calibração antes Nafion revestimento)

1. Após condicionamento o eletrodo em uma solução tampão de pH 5, medir a resistência do eletrodo em soluções de pH diferente (de pH 4, pH 9; consulte a Figura 5).
   1. Para esta medição, mergulhe o eletrodo diretamente a solução-tampão e conecte a outra parte do eletrodo para a potentiostat controlada por computador para aquisição de dados. Altere o pH, titulada com 0,2 M de NaOH.
   2. Escolher a curva de t i chronopotentiometry ou amperometry na lista de técnicas e aplicar uma diferença de potencial 100 mV para o eletrodo.
      Nota: O potentiostat mede a corrente contra o tempo. O software que controla o potentiostat fornece uma representação gráfica da corrente contra o tempo.
   3. Usar a lei de Ohm (resistência é igual a tensão dividida pela corrente) para calcular o valor da resistência da tensão de medição atual e aplicado.
2. Após as medições, seca o eletrodo em temperatura ambiente por 12 h.

6. preparação do eléctrodo revestido Nafion ERGO-PA

1. Adicionar 5 µ l de 5% em peso Nafion em cima o eletrodo ERGO-PA e seque o eletrodo em temperatura ambiente por 12 h.
2. Após o revestimento de Nafion, manter o eletrodo na solução tampão a pH 5 para 24h antes de medições de pH.
3. Após o condicionamento em pH 5, remover o eletrodo revestido Nafion ERGO-PA (ERGO-PA-NA) e medir a resistência do eletrodo de pH 4 pH 9 conforme mencionado na seção 5.1 (Figura 6).

7. preparação de meio de cultura de L. lactis

1. Adicione 9,3 g de M17 pó em 250 mL de água ultrapura. Agite lentamente a solução até que o pó se dissolva completamente. Autoclave a solução a 121 ° C por 15 min.
2. Pegue um balão de 250 mL esterilizado com uma barra de agitador magnético e adicionar 50 mL de meio de M17 esterilizado no balão. Em seguida, adicione 8 mL de solução de glicose 1m esterilizada. Inocule a solução com 10 µ l de uma cultura de L. lactis , anteriormente cultivada em meio de cultura mesmo.
   Nota: A estirpe bacteriana foi obtida Jan Kok, Genética Molecular, Universidade de Groningen.
3. Colocar o balão com o meio de cultura inoculado por 18 h em um prato de agitador magnético em um forno de incubação a 30 ° C, agitando e monitorar o pH.

8. teste do pH ERGO-PA-NA resposta em um experimento de fermentação de L. lactis

1. Coloque o eléctrodo de ERGO-PA-para a cultura de L. lactis e fechá-lo com um tampão de algodão. Em seguida, coloque o set-up para o termostato a 30 ° C a crescer L. lactis.
2. Aplicar 100 mV para o eletrodo e a medida da corrente contra o tempo.
3. Colher amostras de 0,5 mL em pontos diferentes do tempo (ver, por exemplo, a Figura 7) off-line medir a densidade óptica em 600 nm e o pH com um eletrodo de vidro convencional. Continue as medições até que a densidade óptica da cultura torna-se constante, indicando que as bactérias não crescem mais.

Resultados

A aparência de um pico de forte redução em torno de -1,0 V (Figura 3) ilustrado a redução de ir para o ERGO^12,13,14,22. A intensidade do pico depende do número de camadas GO sobre o eletrodo. Uma película preta grossa coberta completamente os fios de ouro sobre o eletrodo. Nesse ponto, os dois eletrodos de ouro isolados foram...

Discussão

É essencial que o GO camadas completamente cobrir os fios de ouro eletrodo após a deposição de GO. Se os eletrodos de ouro não são cobertos com GO, polianilina não só depositará na ERGO, mas também sobre os fios do eletrodo de ouro visível diretamente. Deposição de polianilina sobre os fios de ouro eletrodo pode ter implicações sobre o desempenho do eletrodo. Após a redução de ir para o ERGO, o eletrodo é seca a 100 ° C, para reforçar a ligação entre a camada ERGO e os fios de ouro do eletrodo. A r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Graphite flakes	Sigma Aldrich
Sulfuric acid (H2SO4)	Merck
Sodium nitrite (NaNO2)	Sigma Aldrich
Potassium permanganate (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Aniline	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 powder	BD Difco
Phosphoric acid (H3PO4)	Sigma Aldrich
Boric acid (HBO3)	Merck
Acetic acid	Merck
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Dipostassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Au Interdigitated electrodes	BVT technology - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)