Fabrication d’un enduit Nafion, réduit le graphène oxyde/Polyaniline Chemiresistive capteur de pH de moniteur en temps réel au cours de la Fermentation microbienne

Résumé

Nous rapportons ici le protocole pour la fabrication d’un capteur de pH micro graphène Nafion-enduit, polyaniline fonctionnalisés, électrochimiquement réduit l’oxyde chemiresistive. Ce capteur de pH micro axée sur la chemiresistor, à l’état solide peut détecter des changements de pH en temps réel au cours d’un processus de fermentation de Lactococcus lactis .

Résumé

Nous rapportons ici le génie d’un capteur à semi-conducteur micro pH basé sur l’oxyde de graphène fonctionnalisés polyaniline, réduction électrochimique (ERGO-PA). L’oxyde de graphène électrochimiquement réduite agit comme la couche conductrice et polyaniline agit comme une couche sensibles au pH. La conductivité dépend du pH de polyaniline se produit par le dopage des trous au cours de la protonation et par la dedoping des trous au cours de la déprotonation. Nous avons trouvé qu’une électrode à l’état solide de l’ERGO-PA ne fonctionnait pas comme telle dans les procédés de fermentation. Les espèces électrochimiquement actives que les bactéries produisent pendant le processus de fermentation interfèrent avec la réponse de l’électrode. Nous avons appliqué avec succès Nafion comme une couche conductrice protonique sur ERGO-PA. Les électrodes Nafion-enduit (ERGO-PA-NA) montrent une bonne sensibilité de 1,71 Ω/pH (pH 4-9) pour les mesures de capteur chemiresistive. Nous avons testé l’électrode ERGO-PA-NA en temps réel dans la fermentation de Lactococcus lactis. Durant la croissance de L. lactis, le pH du milieu est passée de pH 7,2 à pH 4,8 et la résistance de l’électrode à l’état solide ERGO-PA-NA changé de 294,5 Ω à 288,6 Ω (5,9 Ω par unité de pH 2,4). La réponse de pH de l’électrode ERGO-PA-NA par rapport à la réponse d’une électrode de pH de base de verre classiques montre que sans référence à l’état solide microcapteur tableaux fonctionnent avec succès dans une fermentation microbiologique.

Introduction

pH joue un rôle essentiel dans de nombreux processus chimiques et biologiques. Même les petits changements dans la valeur du pH modifient le processus et porter atteinte à l’issue du processus. Par conséquent, il est nécessaire surveiller et contrôler le pH pendant toutes les étapes des expériences. L’électrode de verre a été utilisé avec succès pour contrôler le pH dans de nombreux processus chimiques et biologiques, bien que l’utilisation d’une électrode de verre présente plusieurs limites à la mesure de pH. L’électrode de verre est relativement grande, fragile et petite fuite de l’électrolyte dans l’échantillon est possibles. En outre, l’électrode et l’électronique sont relativement coûteux pour des applications dans le dépistage de 96 puits systèmes de fermentation. En outre, les capteurs électrochimiques sont envahissantes et consomment l’échantillon. Par conséquent, il est plus avantageux d’utiliser des capteurs non invasif, sans référence.

De nos jours, les systèmes miniaturisés de réaction sont favorisés dans beaucoup de génie chimique et applications de la biotechnologie car ces microsystèmes fournissent le contrôle de processus améliorés, ainsi que de nombreux autres avantages par rapport à leur macro analogues du système. Pour surveiller et contrôler les paramètres dans un système miniaturisé est une tâche difficile tant que la taille du capteur pour mesurer, par exemple, pH et O₂, doivent être réduits au minimum aussi bien. La production réussie de microréacteurs pour systèmes biologiques nécessitent différents types d’outils analytiques pour la surveillance du processus. Par conséquent, le développement de microcapteurs intelligent joue un rôle important dans l’exécution des processus biologiques en microréacteurs.

Récemment, il y ont eu plusieurs tentatives pour développer des capteurs intelligents pH à l’aide de chemiresistive détection de matériaux tels que les nanotubes de carbone et de tenue de polymères¹. Ces capteurs chemiresistive ne nécessitent aucune électrode de référence et sont faciles à intégrer dans des circuits électroniques. Chemiresistive réussie capteurs permettant de produire des capteurs intelligents qui sont rentables et faciles à fabriquer, nécessitent un petit volume pour tester et sont non invasifs.

Nous rapportons ici une méthode pour développer une électrode avec l’oxyde de graphène fonctionnalisés polyaniline, réduction électrochimique. L’électrode chemiresistive fonctionne comme un capteur de pH au cours d’une fermentation de L. lactis . L. lactis est une bactérie lactique productrices d’acide utilisée dans la fermentation des aliments et des processus de conservation des aliments. Pendant la fermentation, la production d’acide lactique abaisse le pH et la bactérie arrête sa croissance à un faible pH^2,3,4.

Un milieu de fermentation est un milieu chimique complexe qui contient des peptides, des sels et des molécules d’oxydo-réduction qui ont tendance à interférer avec le capteur surface^5,6,7,8,9. Cette étude montre qu’un capteur de pH sur une matière chemiresistive avec une couche de protection de surface adéquate pourrait servir à mesurer le pH dans ce genre de médias de fermentation complexes. Dans cette étude, nous utilisons avec succès Nafion sous la couche de protection pour l’oxyde de graphène polyaniline-enduit, réduction électrochimique pour mesurer le pH en temps réel au cours d’une fermentation de L. lactis .

Protocole

1. préparation de l’oxyde de Graphite

NOTE : Oxyde de Graphite est établi selon méthode^{10,11 des Hummers}.

1. Ajouter 3 g de graphite dans 69 mL de concentré H₂donc₄ et remuer la solution jusqu'à ce que le graphite a complètement dispersée. Ajouter 1,5 g de nitrite de sodium et le laisser pendant 1 h en remuant. Ensuite, placez le récipient dans un bain de glace.
2. Ajouter 9 g de permanganate de potassium dans la dispersion et retirer le récipient du bain de glace. Laisser la solution se réchauffer à température ambiante.
3. Tout d’abord, ajouter goutte à goutte le 138 mL d’eau distillée. Ensuite, continuez à ajouter 420 mL d’eau distillée. Maintenir la température à 90 ° C pendant 15 min à l’aide d’une plaque chauffante. Ajouter 7,5 mL de peroxyde d’hydrogène 30 % à la dispersion.
4. Recueillir le produit par centrifugation à 10 000 x g pendant 20 min et le surnageant. Laver le culot 4 x avec l’eau bidistillée tiède et 2 x avec une solution de HCl (v/v) de 10 %. Enfin, laver 2 x avec l’éthanol et séchez-le à 50 ° C dans le four.

2. préparation de l’électrode GO-dépôt

1. Disperser les 10 mg d’oxyde de graphite dans 10 mL d’eau et ensuite il ultrasons dans un bain ultrasonique pendant 6 h.
2. Retirer les flocons d’oxyde de graphite unexfoliated par centrifugation pendant 30 min à 2 700 x g. jetez les particules solides après centrifugation et utiliser le surnageant pour d’autres expériences.
   NOTE : Nous avons utilisé cette dispersion de flocons GO exfoliée comme la solution.
3. Diluer la solution mère de GO double. Toujours préparer une nouvelle solution de travail vont de la solution mère.
4. Ajouter 2 µL de la solution d’aller au sommet d’une électrode d’or interdigitée exposée (Figure 1 et Figure 2). Après la chute de coulée, sécher l’électrode à température ambiante pendant 12 h. Il s’agit de l’électrode de GO-déposés.

3. réduction de passer de l’oxyde de graphène électrochimiquement réduit

1. Insérer l’électrode dans le porte-électrode polydiméthylsiloxane (PDMS) (pièce de fond). Placer l’autre partie de la porte-électrode, qui sert comme un réservoir de solution, sur le dessus de l’électrode, comme illustré dans la Figure 1 a - 1C. Assembler les détenteurs en agrafant les deux parties ensemble à l’aide de deux trombones. Assurez-vous que le support PDMS ne couvre pas la partie électrode GO-déposés.
2. Pipeter 300 µL de tampon de phosphate de 0,2 M (pH 7) dans le réservoir. Puis, placer la référence et l’électrode de compteur dans la solution de telle façon que les électrodes sont placées près de la surface du film GO, comme illustré à la Figure 1. Cette configuration sert une cellule électrochimique pour effectuer la réduction électrochimique de GO et pour les dépôts de polyaniline.
3. Connecter les électrodes avec le potentiostat connecté à un ordinateur pour l’acquisition de données. Utiliser la voltampérométrie cyclique pour la réduction électrochimique : sélectionnez 0 à -1,2 V comme une aire de répartition potentielle et 50 mV/s comme la vitesse de balayage. Cycle de la tension sur l’électrode entre 0 à -1,2 V 10 x (Figure 3).
4. Après l’expérience, retirez l’électrode du support et lavez-le plusieurs fois avec de l’eau bidistillée. Ensuite, séchez l’électrode dans une étuve à 101 ° C pendant 12 h.
5. Lorsque l’électrode est sec, retirez l’électrode du four et laissez-le refroidir à température ambiante. Ensuite, mesurer la conductivité de l’électrode avec un multimètre. L’électrode est maintenant dénommé une électrode d’oxyde (ERGO) graphène électrochimiquement réduite.

4. Polyaniline fonctionnalisation de l’ERGO électrode

1. Préparer la fonctionnalisation de polyaniline monomère aniline de 10 mM. Dissoudre 5 µL de l’aniline de 10 mM dans 5 mL de 1 M H₂SO₄.
2. Pour la fonctionnalisation de polyaniline, ajouter 300 µL de monomère de l’aniline dans le réservoir de solution. Placer l’électrode de ERGO-déposés dans le porte-électrode, comme décrit dans la procédure de réduction de GO.
3. Utiliser la voltampérométrie cyclique pour l’électropolymérisation de l’aniline pour fonctionnaliser ERGO dans ERGA-polyaniline (ERGO-PA) : sélectionnez 0 à 0,9 V comme une aire de répartition potentielle et 50 mV/s comme la vitesse de balayage. Cycle de la tension sur l’électrode entre 0 à 0,9 V pour 50 x (Figure 4).
4. Après la déposition de polyaniline, retirez l’électrode et lavez-le plusieurs fois avec de l’eau bidistillée. Ensuite, séchez l’électrode à 80 ° C au four pendant 12 h.
5. Retirer l’électrode du four et laissez-le refroidir à température ambiante avant de mesurer la conductivité de l’électrode avec un multimètre.
6. Préparer une solution tampon de pH 5 en ajoutant 0,2 M NaOH à la solution tampon de Britton-Robinson jusqu'à pH 5 (voir l’étape 5.1). Tenir l’électrode dans la mémoire tampon à pH 5 pendant 24 h.
   1. Pour préparer une solution de tampon universel de Britton-Robinson, mélanger 0,04 mol d’acide phosphorique, 0,04 mol d’acide acétique et 0,04 mol d’acide borique dans 0,8 L d’eau ultrapure. Ajouter quelques gouttes d’hydroxyde de sodium 0,2 M à la solution tampon jusqu'à ce que le pH désiré est atteint⁴. Ajouter l’eau ultrapure, jusqu'à ce que le dernier volume est de 1 L.

5. ERGO-PA électrode test à différents pH (étalonnage préalable avant Nafion revêtement)

1. Après conditionnement l’électrode dans une solution tampon de pH 5, mesurer la résistance de l’électrode dans des solutions de différent pH (pH 4 à pH 9 ; voir Figure 5).
   1. Pour cette mesure, plongez l’électrode directement dans la solution tampon et branchez l’autre partie de l’électrode sur le potentiostat informatisé d’acquisition de données. Modifier le pH en titrant avec 0,2 M NaOH.
   2. Choisissez chronopotentiométrie ou ampérométrie courbe i-t dans la liste des techniques et d’appliquer une différence de potentiel 100 mV à l’électrode.
      Remarque : Le potentiostat mesure le courant contre la montre. Le logiciel contrôlant le potentiostat fournit une représentation graphique du courant contre la montre.
   3. Utiliser la loi d’Ohm (résistance égale tension divisée par le courant) pour calculer la valeur de résistance de la tension mesurée en courante et appliquée.
2. Après les mesures, séchez l’électrode à température ambiante pendant 12 h.

6. préparation de l’électrode Nafion-enduit ERGO-PA

1. Ajouter 5 µL de 5 % en poids Nafion sur le dessus de l’électrode ERGO-PA et sécher l’électrode à température ambiante pendant 12 h.
2. Après le revêtement Nafion, laissez l’électrode dans la solution tampon à pH 5 pendant 24 h avant les mesures de pH.
3. Après conditionnement à pH 5, retirer l’électrode Nafion-enduit ERGO-PA (ERGO-PA-NA) et mesurer la résistance de l’électrode de pH 4 à pH 9, tel que mentionné à la section 5.1 (Figure 6).

7. préparation du milieu de Culture de L. lactis

1. Ajouter 9,3 g de poudre de M17 dans 250 mL d’eau ultrapure. Lentement agiter la solution jusqu'à ce que la poudre se dissout complètement. Autoclave la solution à 121 ° C pendant 15 min.
2. Prenez un ballon de 250 mL stérilisé avec une barre de l’agitateur magnétique et ajouter 50 mL de milieu M17 stérilisé dans le ballon. Ensuite, ajoutez 8 mL de solution de glucose autoclavés 1 M. Ensemencer la solution avec 10 µL d’une culture de L. lactis , auparavant cultivée dans le même milieu de culture.
   NOTE : La souche bactérienne a été obtenue à partir de Jan Kok, génétique moléculaire, Université de Groningen.
3. Placer le ballon avec la culture inoculé pendant 18 h sur une plaque de l’agitateur magnétique dans un four d’incubation à 30 ° C sous agitation et surveiller le pH.

8. test du pH ERGO-PA-NA réponse lors d’une expérience de Fermentation de L. lactis

1. Placer l’électrode ERGO-PA-NA dans la culture de L. lactis et fermer avec un bouchon de coton. Ensuite, placez la mise en place dans le thermostat à 30 ° C à cultiver L. lactis.
2. Appliquer 100 mV à l’électrode et la mesure du courant contre la montre.
3. Prendre des échantillons de 0,5 mL à des moments différents (voir, par exemple, la Figure 7) sur mesure hors ligne la densité optique à 600 nm et le pH avec une électrode de verre classiques. Continuer les mesures jusqu'à ce que la densité optique de la culture devient constante, ce qui indique que les bactéries ne sont développent pas plus.

Résultats

L’apparition d’un pic de forte réduction autour de -1,0 V (Figure 3) montre la réduction de GO au ERGO^12,13,14,22. L’intensité du pic dépend du nombre de couches GO sur l’électrode. Un film noir épais couvert les fils d’or sur l’électrode. À ce moment-là, les deux électrodes d’or isolés étaient conductrices...

Discussion

Il est essentiel que l’aller couches complètement couvrir les fils d’électrode d’or après la déposition de GO. Si les électrodes en or ne sont pas recouverts de GO, polyaniline pas seulement déposera sur ERGO mais aussi sur les fils d’électrode d’or visible directement. Déposition de polyaniline sur les câbles d’électrode d’or peut-être avoir des répercussions sur les performances de l’électrode. Après la réduction de GO pour ERGO, l’électrode est séché à 100 ° C pour renforcer la li...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Graphite flakes	Sigma Aldrich
Sulfuric acid (H2SO4)	Merck
Sodium nitrite (NaNO2)	Sigma Aldrich
Potassium permanganate (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Aniline	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 powder	BD Difco
Phosphoric acid (H3PO4)	Sigma Aldrich
Boric acid (HBO3)	Merck
Acetic acid	Merck
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Dipostassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Au Interdigitated electrodes	BVT technology - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)