Nafion kaplı imalatı, mikrobiyal fermantasyon sırasında gerçek zamanlı monitör pH grafen oksit/Polyaniline Chemiresistive sensör azaltılmış

Özet

Burada, bir Nafion kaplı, polyaniline functionalized, mamüllerinin azaltılmış grafen oksit chemiresistive mikro pH sensörü imalatı için protokol raporu. Bu chemiresistor tabanlı, katı hal mikro pH sensör pH değişiklikleri algılayabilir Lactococcus lactis Fermantasyon işlemi sırasında gerçek zamanlı.

Özet

Burada, polyaniline functionalized, mamüllerinin azaltılmış grafen oksit (ERGO-PA) dayalı bir katı hal mikro pH sensör mühendislik raporu. Mamüllerinin azaltılmış grafen oksit iletken katman olarak davranır ve polyaniline bir pH duyarlı katman olarak davranır. Polyaniline pH bağımlı iletkenlik delik protonation sırasında doping ve delik deprotonation sırasında dedoping oluşur. Biz bir ERGO-PA katı hal elektrot gibi fermantasyon süreçlerinde fonksiyonel değildi bulundu. Fermantasyon işlemi sırasında bakteri üretir mamüllerinin etkin türler elektrot Yanıt ile müdahale. Biz başarıyla ERGO-PA bir proton iletken katman olarak Nafion uygulanan Nafion kaplanmış elektrotlar (ERGO-PA-NA) 1,71 Ω/pH (pH 4-9) chemiresistive sensör ölçümleri için iyi bir duyarlılık gösterin. ERGO-PA-NA elektrot test gerçek zamanlı olarak Lactococcus lactisfermantasyon. L. lactis, büyüme sırasında ortamın pH, pH 7.2 4.8 ve 294.5 Ω 288.6 Ω (5.9 Ω 2.4 pH birim başına) değiştirildi ERGO-PA-NA katı hal elektrot dayanıklılığını pH için değişti. Geleneksel cam tabanlı pH elektrodu Yanıt ile karşılaştırıldığında ERGO-PA-NA elektrot pH yanıt başvuru daha az katı hal microsensor diziler başarılı bir mikrobiyolojik fermantasyon çalışması gösterir.

Giriş

pH birçok kimyasal ve biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynar. Hatta küçük değişiklikler olarak pH değeri süreci değiştirmek ve işleminin sonucunu olumsuz yönde. Bu nedenle, izlemek ve deneyler her aşamasında pH değeri denetlemek gereklidir. Her ne kadar bir cam elektrot kullanımı pH ölçmek için bazı sınırlamaları pozlar cam tabanlı pH elektrodu başarıyla birçok kimyasal ve Biyolojik süreçler, pH izlemek için kullanılır. Cam tabanlı pH elektrodu nispeten büyük, kırılgan ve elektrolit örnek içine küçük sızdırmazlık mümkündür. Ayrıca, elektrot ve elektronik uygulamalarında 96-şey tarama nispeten pahalı fermantasyon sistemleri. Ayrıca, elektrokimyasal sensörler invaziv ve örnek tüketmek. Bu nedenle, non-invaziv, başvuru-az sensörler kullanmak için daha avantajlıdır.

Günümüzde, bu microsystems gelişmiş işlem denetimi, kendi makro üzerinde pek çok avantajı ile birlikte sistem analogları sağlamak olarak küçültülmüş tepki sistemleri birçok Kimya Mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamaları tercih. İzlemek ve minyatür bir sistem parametreleri denetlemek için zor bir görev, örneğin ölçmek için sensör, pH ve O₂boyutları, de en aza gerekir. Biyolojik sistemler için microreactors başarılı üretim süreci izlemek için analitik araçlar farklı türleri gerektirir. Bu nedenle, akıllı microsensors gelişimi microreactors biyolojik süreçleri yürütmek önemli bir rol oynamaktadır.

Son zamanlarda, karbon nanotüpler gibi malzeme algılama ve iletken polimerler¹chemiresistive kullanarak akıllı pH sensörleri geliştirmek için çeşitli girişimler olmuştur. Bu chemiresistive sensörler hiçbir referans elektrot gerektirir ve elektronik devreleri ile entegre etmek kolay. Başarılı chemiresistive sensörleri ve non-invaziv olduğundan maliyet-etkin ve basit-e doğru üretmek, test etmek için küçük bir birim gerektirir akıllı algılayıcılar üretmek mümkün olun.

Burada, bir elektrot polyaniline functionalized, mamüllerinin azaltılmış grafen oksit ile geliştirmek için bir yöntem raporu. Chemiresistive elektrot bir L. lactis fermantasyon sırasında bir pH sensör çalışır. L. lactis gıda fermantasyon ve gıda koruyucu uygulamaları kullanılan laktik asit üreten bir bakteridir. Fermantasyon sırasında laktik asit üretimi pH düşürür ve bakteri düşük pH^2,3,4büyüyen durur.

Peptidler, tuzları ve ile sensör yüzey^5,6,7,8,9müdahale eğilimi redoks molekülleri içeren karmaşık bir kimyasal ortam fermantasyon ortamıdır. Bu çalışmada chemiresistive malzeme uygun yüzey koruma katmanı ile temel bir pH sensör karmaşık fermantasyon medya bu tür pH ölçmek için kullanılan olabilir gösterir. Bu çalışmada, başarılı bir şekilde Nafion polyaniline kaplı, mamüllerinin azaltılmış grafen oksit koruma katmanı olarak pH ölçmek için kullandığımız bir L. lactis fermantasyon sırasında gerçek zamanlı.

Protokol

1. hazırlanması grafit oksit

Not: Grafit oksit Hummers yöntemi^10,11göre hazırlanır.

1. ₄ ve heyecan çözüm grafit kadar tamamen dağınık grafit 69 mL konsantre H₂içine 3 g ekleyin. Sodyum nitrit 1.5 g ekleyin ve karıştırma sırasında 1 h için bırakın. O zaman, kapsayıcı bir buz banyosu içinde yer.
2. 9 g potasyum permanganat dağılım ekleyin ve buz banyosu konteyner kaldırın. Oda sıcaklığına kadar ısınmak çözüm sağlar.
3. İlk olarak, 138 mL distile su dropwise ekleyin. O zaman, 420 mL distile su eklemeye devam edin. 15 dakika bir aspiratör kullanarak 90 ° C sıcaklıkta korumak. %30 hidrojen peroksit 7.5 mL dağılımı için ekleyin.
4. Santrifüjü 10.000 x g 20 dk için de tarafından ürün toplamak ve süpernatant çözüm atın. Pelet 4 yıkama x sıcak çift distile su ve 2 x % 10 HCl (v/v) çözüm ile ile. Son olarak, yıkama 2 x ile etanol ve 50 ° c fırında kuru.

2. git yatırılır elektrot hazırlık

1. 10 mg 10 mL su grafit oksit dağıtmak ve o zaman o bir ultrasonik banyo 6 h için solüsyon içeren temizleyicide.
2. Unexfoliated grafit oksit pul için 2700 x g. atma, 30 dk aralıklarla tarafından katı parçacıklar Santrifüjü sonra kaldırın ve süpernatant daha fazla deneyler için kullanın.
   Not: Bu pullu GO pul dağılım hisse senedi çözüm olarak kullanılır.
3. Git hisse senedi çözüm iki kat sulandırmak. Her zaman taze git çalışan bir çözüm hisse senedi çözümden hazırlayın.
4. 2 µL gitmek çalışma çözüm bir maruz interdigitated altın elektrot (Şekil 1A ve Şekil 2) üstüne ekleyin. Döküm bıraktıktan sonra oda sıcaklığında 12 h için elektrot kuru. Git yatırılır elektrot bu.

3. git mamüllerinin azaltılmış Graphene oksit azalma

1. Elektrot polydimethylsiloxane (PDMS) Elektrot tutucu (alt parça) yerleştirin. Üstünde tepe-in Şekil 1A - olduğu gibi gösterildiği gibi elektrot bir çözüm rezervuar olarak hizmet vermektedir 1 Celektrot sahibinin diğer bölümüne yerleştirin. Sahipleri iki parçalar birlikte iki ataç kullanarak kırpma tarafından topla. PDMS tutucu elektrot GO yatırılan bölümü kapsamaz emin olun.
2. Damlalıklı 300 µL Reservoir 0.2 M fosfat tampon (pH 7). Sonra başvuru ve sayaç elektrot çözüm böyle bir şekilde elektrotlar git film, yüzeye yakın yerleştirilir Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi yerleştirin. Bu kurulum elektrokimyasal azaltma Go ve polyaniline ifade için gerçekleştirmek için bir elektrokimyasal hücre olarak hizmet vermektedir.
3. Veri toplama için bir bilgisayara bağlı potansiyostat ile elektrotları bağlayın. Çevrimsel voltammetry elektrokimyasal azaltma için kullanın: 0 olarak-1.2 V potansiyel bir Aralık ve tarama hızı olarak 50 mV/s olarak seçin. Gerilim elektrot üzerinde 0 olarak-1.2 V 10 arasında geçiş yapmak x (Şekil 3).
4. Deneme sonra Elektrot tutucu kaldırın ve tekrar tekrar çift distile su ile yıkayın. O zaman, elektrot 12 h için 101 ° c fırında kuru.
5. Elektrot kuru olduğunda, elektrot Fırından çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Sonra iletkenlik elektrot bir multimetre ile ölçmek. Elektrot şimdi bir mamüllerinin azaltılmış grafen oksit (ERGO) elektrot adlandırılır.

4. Polyaniline Functionalization, ERGO elektrot

1. 10 mM anilin monomer polyaniline functionalization için hazır olun. Yani 10 mM anilin 1 M H₂5 ml 5 µL dağıtılması₄.
2. Polyaniline functionalization için çözüm havzanın anilin monomer 300 µL ekleyin. ERGO yatırılır elektrot Elektrot tutucu git azaltılması için yordamda açıklandığı şekilde yerleştirin.
3. Çevrimsel voltammetry ERGO ERGA-polyaniline (ERGO-PA) functionalize için Anilin electropolymerization için kullanın: 0 için 0,9 V potansiyel bir Aralık ve tarama hızı olarak 50 mV/s olarak seçin. Gerilim elektrot üzerinde 0 için 0,9 V 50 arasında geçiş yapmak x (Şekil 4).
4. Polyaniline birikimi sonra elektrot kaldırın ve tekrar tekrar çift distile su ile yıkayın. O zaman, elektrodu 80 ° c 12 h fırında kuru.
5. Elektrot Fırından çıkarın ve bir multimetre ile elektrot iletkenlik ölçüm önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
6. PH 5 arabellek çözüm pH 5 (bkz. Adım 5.1) kadar Britton-Robinson arabellek çözüm için 0.2 M NaOH ekleyerek hazırlayın. Elektrot pH 5 24 h için arabellekte tutmak.
   1. Britton-Robinson evrensel arabellek çözüm hazırlamak için 0,04 mol fosforik asit, asetik asitin 0,04 mol ve Borik asit 0, 8 L Ultrasaf Su aldı 0.04 mol karıştırın. İstenen pH⁴ulaşılana kadar 0.2 M sodyum hidroksit dropwise arabellek ekleyin. Son Hacim 1 L. olana ultrasaf su ekleyin

5. ERGO-PA elektrot test farklı pH (ön kalibrasyon önce Nafion kaplama)

1. PH 5 tampon çözelti içinde elektrot sonra Merkezi Klima, farklı bir pH çözümlerinde elektrot dayanıklılığını ölçmek (pH 4 pH 9; için gelen bkz Şekil 5).
   1. Bu ölçüm için elektrot arabellek çözüm içine daldırma ve veri toplama bilgisayar kontrollü potansiyostat elektrot diğer parçası bağlanmak. PH 0.2 M NaOH ile titrating olarak değiştirin.
   2. Chronopotentiometry veya amperometry i-t eğrisi teknikleri listeden seçin ve bir 100 mV potansiyel farkı elektrot için geçerlidir.
      Not: Potansiyostat geçerli zamana karşı ölçer. Potansiyostat kontrol yazılım geçerli zamana karşı grafik gösterimini sağlar.
   3. Ohm Kanunu (direnci eşittir mevcut tarafından bölünmüş gerilim) kullanın ölçülen mevcut ve uygulanan gerilim direnç değerini hesaplamak için.
2. Ölçümleri sonra 12 h için oda sıcaklığında elektrot kuru.

6. Nafion kaplı ERGO-PA elektrodu hazırlanması

1. 5 µL 5 wt % Nafion ERGO-PA elektrot üzerine ekleyin ve elektrot, oda sıcaklığında 12 h için kuru.
2. Nafion kaplama sonra elektrot pH 5 pH ölçümleri önce 24 h için arabellek çözümde tutun.
3. Klima pH 5 içinde sonra Nafion kaplı ERGO-PA elektrot (ERGO-PA-NA) kaldırın ve pH 4 üzerinden elektrot için pH 5.1 (Şekil 6) bölümünde belirtildiği gibi 9 dayanıklılığını ölçmek.

7. L. lactis kültür orta hazırlanması

1. 9.3 g M17 tozu 250 mL ultrasaf su ekleyin. Toz tamamen eriyene kadar yavaş yavaş çözüm tahrik. Basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de çözüm.
2. Manyetik karıştırıcı çubuk ile 250 mL steril şişe alıp 50 mL steril M17 orta şişesi için ekleyin. Sonra 8 mL autoclaved 1 M glukoz çözeltisi ekleyin. Daha önce aynı kültür ortamında yetiştirilen bir L. lactis kültürünün 10 µL çözümle aşılamak.
   Not: Bakteriyel zorlanma Jan Kok, moleküler genetik, Groningen Üniversitesi elde edildi.
3. Flask inoculated kültür ortamı için 18 h ile bir manyetik karıştırıcı tabak 30 ° c karıştırma sırasında bir kuluçka fırında yerleştirin ve pH izlemek.

8. test ERGO-PA-NA pH yanıt L. lactis fermantasyon deney olarak

1. ERGO-PA-NA elektrot L. lactis kültürün içine yerleştirin ve bir pamuk fiş ile kapatın. O zaman, 30 ° C'de L. lactisbüyümeye termostat set-up yerleştirin.
2. 100 uygulamak mV elektrot ve ölçü geçerli zamana karşı.
3. 0.5 mL numune farklı zaman noktalarda (bkz, örneğin, Şekil 7) çevrimdışı 600 optik yoğunluk ölçmek al nm ve geleneksel cam elektrot ile pH. Ölçümleri optik yoğunluk kültür bakteriler artık büyüyor değil gösteren sabit hale gelinceye kadar devam.

Sonuçlar

Bir güçlü azaltma tepe civarında-V 1.0 (Şekil 3) görünümünü GO azalma resimli ERGO^12,13,14,22. En üst nokta yoğunluğunu GO katmanlarda elektrot sayısına bağlıdır. Kalın siyah film tamamen elektrot altın teller kaplı. Bu noktada, git iki altın elektrot teli bağladığı iki yalıtılmış altın elektrot iletke...

Tartışmalar

Git tamamen katmanlar şarttır altın elektrot tel gitmek birikimi sonra kapak. Eğer altın elektrotlar ile gitmek kapsamına girmez, polyaniline sadece ERGO aynı zamanda görünür altın elektrot teller doğrudan yatıracaktır değil. Polyaniline altın elektrot teller üzerinde birikimi elektrot performansına etkilerine sahip olabilir. ERGO gidin azaltma sonra elektrot 100 ° C'de ERGO katman ve altın elektrot teller arasındaki bağı güçlendirmek için kurutulur. Elektroda direnç üzerinde altın elektrotla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Graphite flakes	Sigma Aldrich
Sulfuric acid (H2SO4)	Merck
Sodium nitrite (NaNO2)	Sigma Aldrich
Potassium permanganate (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Aniline	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 powder	BD Difco
Phosphoric acid (H3PO4)	Sigma Aldrich
Boric acid (HBO3)	Merck
Acetic acid	Merck
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Dipostassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Au Interdigitated electrodes	BVT technology - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)