Herstellung von Nafion-beschichtet, reduziert Graphene Oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor Monitor pH in Echtzeit während der mikrobiellen Fermentation

Zusammenfassung

Hier berichten wir über das Protokoll für die Herstellung von einer Nafion-beschichtet, Polyaniline funktionalisiert, elektrochemisch reduzierte Graphene Oxid Chemiresistive Mikro pH-Sensor. Diese Chemiresistor-basierte, Solid-State-Mikro-pH-Sensor erkennt pH-Wert-Änderungen in Echtzeit während Lactococcus Lactis Fermentationsprozess.

Zusammenfassung

Hier berichten wir über das Engineering von einem Solid-State-Mikro pH-Sensor basiert auf Polyaniline funktionalisiert, elektrochemisch reduzierte Graphene Oxid (ERGO-PA). Elektrochemisch reduzierte Graphene Oxid fungiert als leitende Schicht und Polyaniline als pH-Sensitive Schicht. Die pH-abhängige Leitfähigkeit des Polyaniline erfolgt durch doping Löcher während Protonierung und durch die dedoping Löcher während Deprotonierung. Wir fanden, dass eine Solid-State-ERGO-PA-Elektrode nicht als solche in Fermentationsprozessen funktionsfähig war. Elektrochemisch aktiven Spezies, die die Bakterien während der Gärung produzieren stören die Elektrode Antwort. Wir erfolgreich Nafion als protonenleitende Schicht über ERGO-PA. Die Nafion-beschichteten Elektroden (ERGO-PA-NA) zeigen eine gute Empfindlichkeit von 1,71 Ω/pH (pH 4 bis 9) für Chemiresistive Sensormessungen. Wir testeten die ERGO-PA-NA-Elektrode in Echtzeit in der Vergärung von Lactococcus Lactis. Während des Wachstums der L. Lactis, verändert der pH-Wert des Mediums von pH 7,2 pH 4,8 und den Widerstand der ERGO-PA-NA-Solid-State-Elektrode von 294.5 Ω in 288.6 Ω (5,9 Ω pro 2.4 pH-Einheit) geändert. Die pH-Reaktion der ERGO-PA-NA-Elektrode im Vergleich mit der Antwort von einem herkömmlichen Glas-basierten pH-Elektrode zeigt, dass Referenz-weniger Solid-State-Mikrosensor Arrays in eine mikrobiologische Fermentation erfolgreich operieren.

Einleitung

pH spielt eine wichtige Rolle in vielen chemischen und biologischen Prozessen. Selbst kleine Veränderungen in den pH-Wert ändern, den Prozess und das Ergebnis des Prozesses beeinträchtigen. Daher ist es notwendig, die Überwachung und Steuerung des pH-Wertes in jeder Phase der Experimente. Die Glas-basierten pH-Elektrode wird erfolgreich eingesetzt, pH in vielen chemischen und biologischen Prozessen zu überwachen obwohl der Einsatz von einer Glaselektrode mehrere Einschränkungen zur pH-Messung darstellt. Die Glas-basierten pH-Elektrode ist relativ groß, zerbrechlich, und kleine Leckagen des Elektrolyten in der Probe sind möglich. Darüber hinaus die Elektrode und die Elektronik sind relativ teuer, für Anwendungen in 96-Well-Screening Fermentationssysteme. Darüber hinaus die elektrochemischen Sensoren sind invasive und verbrauchen die Probe. Daher ist es vorteilhafter, nicht-invasive, Referenz-weniger Sensoren zu verwenden.

Heutzutage sind miniaturisierte Reaktionssysteme in viele chemische Technik und Biotechnologieanwendungen begünstigt, da diese Mikrosysteme verbesserte Prozesskontrolle, sowie viele weitere Vorteile gegenüber ihren Makro System Analoga bieten. Zur Überwachung und Kontrolle der Parameter in einem miniaturisierten System ist eine anspruchsvolle Aufgabe als die Größe des Sensors zu messen, zum Beispiel, pH-Wert und O₂, sowie minimiert werden müssen. Die erfolgreiche Herstellung von Mikroreaktoren für biologische Systeme erfordern verschiedene Arten von Analyse-Tools zur Prozessüberwachung. Die Entwicklung von intelligenten Mikrosensoren spielt daher eine wichtige Rolle bei der Durchführung biologischer Prozesse in Mikroreaktoren.

Vor kurzem gab es mehrere Versuche, intelligente pH-Sensoren mit Chemiresistive Materialien wie Kohlenstoff-Nanoröhren sensing und Durchführung von Polymeren¹zu entwickeln. Diese Chemiresistive-Sensoren benötigen keine Bezugselektrode und sind einfach zu integrieren mit elektronischen Schaltungen. Erfolgreiche Chemiresistive Sensoren machen es möglich, intelligente Sensoren zu produzieren, die sind kostengünstig und einfach zu produzieren, benötigen eine kleine Menge zum Testen und sind nicht-invasiv.

Hier berichten wir über eine Methode, um eine Elektrode mit Polyaniline funktionalisiert, elektrochemisch reduzierte Graphene Oxid zu entwickeln. Die Chemiresistive Elektrode arbeitet als ein pH-Sensor während der Gärung ein L. Lactis . L. Lactis ist ein Milchsäure-Säure-produzierenden Bakterium in Essen Gärung und konservierende Verfahren verwendet. Während der Gärung die Produktion von Milchsäure senkt den pH-Wert, und das Bakterium aufhört zu wachsen in einem niedrigen pH-Wert^2,3,4.

Ein Fermentationsmedium ist eine komplexe chemische Umgebung, die enthält Peptide, Salze und Redox-Moleküle, die dazu neigen, mit dem Sensor Oberfläche^5,6,7,8,9stören. Diese Studie zeigt, dass ein pH-Sensor basiert auf Chemiresistive Material mit einer richtigen Oberflächenschutz Schicht verwendet werden, um pH in dieser Art von komplexen Gärung Medien zu messen. In dieser Studie verwenden wir erfolgreich Nafion als Schutzschicht für Polyaniline beschichtet, elektrochemisch reduzierte Graphene Oxid, Messen Sie den pH-Wert in Echtzeit während einer L. Lactis Gärung.

Protokoll

1. Vorbereitung von Graphit-Oxid

Hinweis: Graphit-Oxid ist im Sinne des Hummers Methode^10,11bereit.

1. Fügen Sie 3 g Graphit in 69 mL konzentrierter H₂SO₄ und rühren Sie die Lösung bis die Graphit hat vollständig dispergiert. 1,5 g Natriumnitrit und lassen Sie es für 1 h unter Rühren. Dann stellen Sie den Behälter in ein Eisbad.
2. 9 g Kaliumpermanganat in der Dispersion und entfernen Sie den Behälter aus dem Eisbad. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur aufwärmen.
3. Fügen Sie zunächst 138 mL destilliertem Wasser tropfenweise. Dann weiterhin 420 mL destilliertem Wasser hinzufügen. Behalten Sie die Temperatur auf 90 ° C für 15 min mit einer Kochplatte. Die Dispersion 7,5 mL 30 % Wasserstoffperoxid hinzufügen.
4. Sammeln Sie das Produkt durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 20 min und entsorgen Sie die überstehende Lösung. Waschen Sie die Pellets 4 X mit warmem bidestilliertem Wasser und 2 X mit 10 % HCl (V/V) Lösung. Schließlich waschen Sie es 2 X mit Ethanol und bei 50 ° C im Ofen trocknen.

(2) GO-hinterlegt Elektrode Vorbereitung

1. Auflösen Sie 10 mg Graphit Oxid in 10 mL Wasser und beschallen Sie es dann in ein Ultraschallbad für 6 h.
2. Nehmen Sie die unexfoliated Graphitflocken Oxid durch Zentrifugation für 30 min bei 2.700 x g. verwerfen die festen Partikel nach Zentrifugation und überstand für weitere Experimente.
   Hinweis: Wir nutzten diese Schuppung GO Flocken Dispersion als Vorratslösung.
3. Verdünnen Sie die GO-Stammlösung zweifach. Bereiten Sie immer eine frische GO funktionierende Lösung aus der Stammlösung.
4. Fügen Sie 2 µL GO funktionierende Lösung auf einer exponierten die gold Elektrode (Abb. 1A und Abbildung 2). Trocknen Sie nach Tropfen gießen die Elektrode bei Raumtemperatur für 12 h. Dies ist die Elektrode GO hinterlegt.

3. Reduzierung von GO elektrochemisch reduzierte Graphene Oxid

1. Legen Sie die Elektrode in der Polydimethylsiloxan (PDMS) Elektrodenhalter (Unterteil). Legen Sie den anderen Teil des Elektrodenhalters, dient als ein Reservoir Lösung, auf die Elektrode wie dargestellt wie in Abbildung 1A - 1 C. Montieren Sie die Inhabern durch die beiden Teile zusammen mit zwei Büroklammern zuschneiden. Stellen Sie sicher, daß der PDMS-Inhaber nicht den GO hinterlegt Elektrode Teil abdeckt.
2. Pipettieren 300 µL 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7) in das Reservoir. Dann setzen Sie die Referenz und die Gegenelektrode in der Lösung in einer Weise, dass die Elektroden in der Nähe der Oberfläche der Folie gehen, wie in Abbildung 1dargestellt. Diese Aufstellung dient als eine elektrochemische Zelle, elektrochemische Reduktion von GO und für Polyaniline Absetzung durchzuführen.
3. Verbinden Sie die Elektroden mit dem Potentiostaten verbunden mit einem Computer zur Datenerfassung. Zyklischer Voltammetrie für die elektrochemische Reduktion verwenden: Wählen Sie 0 bis -1,2 V als eine mögliche Auswahl und 50 mV/s als Scan-Rate. Zyklus der Spannung über die Elektrode zwischen 0 bis 10 V -1,2 x (Abbildung 3).
4. Entfernen Sie nach dem Experiment die Elektrode aus dem Halter und waschen Sie ihn immer wieder mit bidestilliertem Wasser. Trocknen Sie die Elektrode in einem Ofen bei 101 ° C für 12 h.
5. Wenn die Elektrode trocken ist, die Elektrode aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Dann messen Sie die Leitfähigkeit der Elektrode mit einem Multimeter. Die Elektrode wird jetzt als elektrochemisch reduzierte Graphene Oxid (ERGO) Elektrode bezeichnet.

4. Polyaniline Funktionalisierung der ERGO Elektrode

1. Die Polyaniline Funktionalisierung 10 mM Anilin Monomer vorbereiten. Auflösen von 5 µL 10 mM Anilin in 5 mL 1 M H₂SO₄.
2. Fügen Sie für die Funktionalisierung Polyaniline 300 µL Anilin Monomer die Lösung-Reservoir hinzu. Legen Sie die ERGO hinterlegt Elektrode in den Elektrodenhalter, wie beschrieben in das Verfahren zur Verringerung der GO.
3. Zyklischer Voltammetrie für die Electropolymerization von Anilin, ERGO in ERGA-Polyaniline (ERGO-PA) funktionalisieren verwenden: Wählen Sie 0 bis 0,9 V als eine mögliche Auswahl und 50 mV/s als Scan-Rate. Zyklus der Spannung über die Elektrode zwischen 0 bis 0,9 V für 50 x (Abbildung 4).
4. Entfernen Sie nach der Absetzung Polyaniline die Elektrode zu und waschen Sie ihn immer wieder mit bidestilliertem Wasser. Trocknen Sie die Elektrode bei 80 ° C in den Ofen für 12 h.
5. Die Elektrode aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Leitfähigkeit der Elektrode mit einem Multimeter messen lassen.
6. Bereiten Sie eine Pufferlösung pH 5 durch Zugabe von 0,2 M NaOH, Britton-Robinson-Pufferlösung bis pH 5 (siehe Punkt 5.1). Halten Sie die Elektrode in Puffer bei pH 5 für 24 h.
   1. Zur Vorbereitung einer universellen Britton-Robinson-Pufferlösung vermischen Sie 0,04 Mol Phosphorsäure, 0,04 Mol Essigsäure und 0,04 Mol von Borsäure in 0,8 Liter Reinstwasser. 0,2 M Natronlauge tropfenweise die Puffer Projektmappe fügen Sie bis der gewünschte pH-Wert⁴erreicht ist hinzu. Fügen Sie hochreines Wasser hinzu, bis der letzte Band 1 L. ist

(5) ERGO-PA Elektrode Tests bei verschiedenen pH-Werten (Vorkalibrierung vor Nafion Beschichtung)

1. Nach der Konditionierung der Elektrode in eine Pufferlösung pH 5, Messen Sie den Widerstand der Elektrode in Lösungen von einem anders pH-Wert (von pH 4 bis pH 9; siehe Abbildung 5).
   1. Für diese Messung die Elektrode direkt in die Pufferlösung Tauchen und den andere Teil der Elektrode mit der Computer-gesteuerten Potentiostaten für Datenerfassung verbinden. Ändern Sie den pH-Wert, indem mit 0,2 M NaOH titrieren.
   2. Wählen Sie Chronopotentiometry oder strommesstechnik i-t-Kurve aus der Liste der Techniken und wenden Sie eine 100 mV-Potentialdifferenz an der Elektrode.
      Hinweis: Die Potentiostaten misst den Strom gegen die Zeit. Die Software steuert die Potentiostaten bietet eine grafische Darstellung der aktuellen gegen die Zeit.
   3. Verwenden des Ohmschen Gesetzes (Widerstand ist gleich Spannung geteilt durch Strom) um den Widerstandswert von der gemessenen aktuellen und angewandte Spannung zu berechnen.
2. Trocknen Sie nach den Messungen die Elektrode bei Raumtemperatur für 12 h.

6. Vorbereitung der Nafion-beschichtete ERGO-PA-Elektrode

1. Fügen Sie 5 µL von 5 Gew.-% Nafion auf der ERGO-PA-Elektrode und trocknen Sie die Elektrode bei Raumtemperatur für 12 h.
2. Nach der Nafion-Beschichtung, halten Sie die Elektrode in der Pufferlösung bei pH 5 für 24 h vor der pH-Messung.
3. Nach Konditionierung in pH 5, entfernen der Nafion-beschichtete ERGO-PA-Elektrode (ERGO-PA-NA) und Messen Sie den Widerstand der Elektrode von pH 4 bis pH 9 wie bereits in Abschnitt 5.1 (Abbildung 6).

7. Vorbereitung der L. Lactis Kulturmedium

1. Fügen Sie 9,3 g M17 Pulver in 250 mL Reinstwasser. Schütteln Sie langsam die Lösung, bis sich das Pulver vollständig auflöst. Autoklaven die Lösung bei 121 ° C für 15 Minuten.
2. Nehmen ein 250-mL sterilisierten Fläschchen mit Magnetrührer Bar und 50 mL des Mediums sterilisierte M17 in den Kolben. Fügen Sie dann 8 mL autoklaviert Glukoselösung verdünnt 1 M. Impfen Sie die Lösung mit 10 µL einer L. Lactis -Kultur, die zuvor in der gleichen Nährmedium gewachsen.
   Hinweis: Jan Kok, molekulare Genetik, Universität von Groningen war der Bakterienstamm entnommen.
3. Legen Sie die Flasche mit der beimpften Kulturmediums für 18 h auf dem Magnetrührer Teller im Ofen Inkubation bei 30 ° C unter Rühren und überwachen Sie den pH-Wert zu.

8. Prüfung der ERGO-PA-NA-pH Antwort in einem L. Lactis Gärung Experiment

1. Legen Sie die ERGO-PA-NA-Elektrode in die L. Lactis Kultur und schließen Sie es mit einem Baumwoll-Stecker. Legen Sie dann das Setup in der Thermostat bei 30 ° C, L. Lactiszu wachsen.
2. Anwenden von 100 mV bis die Elektrode und messen den Strom gegen die Zeit.
3. 0,5 mL Proben nehmen zu verschiedenen Zeitpunkten (siehe zum Beispiel Abbildung 7) Offline Messung die optische Dichte bei 600 nm und der pH-Wert mit einer konventionellen Glaselektrode. Fahren Sie die Messungen, bis die optische Dichte der Kultur konstant wird, darauf hinweist, dass die Bakterien nicht mehr wachsen.

Ergebnisse

Das Aussehen eines starken Rückgangs Peaks rund -1,0 V (Abbildung 3) illustriert die Reduzierung von GO-ERGO^12,13,14,22. Die Intensität des Peaks hängt von der Anzahl der GO-Schichten auf die Elektrode. Ein dicker schwarze Folie vollständig abgedeckt Golddrähten an der Elektrode. Zu diesem Zeitpunkt waren die zwei isolierte gol...

Diskussion

Es ist wichtig, dass die GO "" vollständig Layers bedecken die gold Elektrodenleitungen nach der Absetzung von GO. Wenn der gold-Elektroden mit GO nicht abgedeckt sind, wird Polyaniline nicht nur auf ERGO, sondern auch auf die sichtbare gold Elektrodenleitungen direkt einzahlen. Ablagerung von Polyaniline auf gold Elektrodenleitungen möglicherweise Auswirkungen auf die Leistung der Elektrode. Nach der Reduktion des GO, ERGO wird die Elektrode bei 100 ° C zur Stärkung der Bindung zwischen der ERGO-Schicht und die gold...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Graphite flakes	Sigma Aldrich
Sulfuric acid (H2SO4)	Merck
Sodium nitrite (NaNO2)	Sigma Aldrich
Potassium permanganate (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Aniline	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 powder	BD Difco
Phosphoric acid (H3PO4)	Sigma Aldrich
Boric acid (HBO3)	Merck
Acetic acid	Merck
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Dipostassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Au Interdigitated electrodes	BVT technology - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)