ייצור מצופים Nafion, מופחתת גראפן תחמוצת/Polyaniline Chemiresistive חיישן על צג ה-pH בזמן אמת במהלך התסיסה מיקרוביאלי

Summary

כאן, אנו מדווחים על הפרוטוקול עבור הזיוף של גראפן מצופים Nafion, polyaniline functionalized, electrochemically מופחת תחמוצת chemiresistive מיקרו pH חיישן. חיישן זה מבוסס על chemiresistor של מצב מוצק מיקרו חומציות יכול לזהות שינויים pH בזמן אמת במהלך תהליך תסיסה lactis הכרוכים .

Abstract

כאן, אנו מדווחים ההנדסה של חיישן ה-pH של מצב מוצק מיקרו בהתבסס על תחמוצת polyaniline functionalized, electrochemically מופחת גרפן (ERGO-PA). גרפן מופחת electrochemically אוקסיד משמש השכבה ניצוח ופועל polyaniline כשכבה pH-רגיש. מוליכות תלויי-pH polyaniline מתרחשת על ידי סימום של חורים במהלך פרוטונציה ועל ידי dedoping חורים במהלך דה-פרוטונציה. מצאנו כי אלקטרודה solid-state ERGO-PA איננה פונקציונלי ככזה בתהליכי תסיסה. המין electrochemically הפעיל החיידקים מייצרים בתהליך ההתססה להתערב עם תגובת אלקטרודה. אנחנו הוחלו בהצלחה Nafion כשכבה מוליכי פרוטון מעל ERGO-אבא האלקטרודות מצופים Nafion (ERGO-הרשות הפלסטינית-נה) מראים רגישות טובה של 1.71 Ω/חומציות (pH 4-9) למדידות חיישן chemiresistive. בדקנו את האלקטרודה ERGO-הרשות הפלסטינית-נה ב בזמן אמת בהתסיסה של lactis הכרוכים. במהלך הצמיחה של ל' lactis, ה-pH של המדיום השתנתה מ- pH 7.2 pH 4.8 וההתנגדות של האלקטרודה solid-state ERGO-הרשות הפלסטינית-נה משתנה מω 294.5 כדי 288.6 Ω (5.9 Ω ליחידה pH 2.4). התגובה ה-pH של האלקטרודה ERGO-הרשות הפלסטינית-נה לעומת התגובה של אלקטרודות pH קונבנציונאלי המבוסס על זכוכית מראה כי הפניה-פחות microsensor של מצב מוצק מערכים פועלים בהצלחה תסיסה מיקרוביולוגית.

Introduction

pH ממלא תפקיד חיוני בתהליכים כימיים וביולוגיים רבים. אפילו שינויים קטנים בערך pH לשנות את התהליך, להשפיע לרעה על התוצאה של התהליך. לפיכך, יש צורך לפקח ולשלוט את ערך ה-pH בכל בשלב של ניסויים. האלקטרודה pH המבוסס על זכוכית בהצלחה שימש כדי לפקח pH של תהליכים כימיים וביולוגיים רבים, למרות השימוש אלקטרודת זכוכית מהווה מספר מגבלות על מדידת pH. האלקטרודה pH המבוסס על זכוכית גדולה יחסית, שביר, leakages קטן של האלקטרוליט לתוך הדגימה אפשריים. יתר על כן, אלקטרודה, אלקטרוניקה יקרים יחסית עבור יישומי סינון 96-ובכן מערכות תסיסה. יתר על כן, החיישנים אלקטרוכימי הינם פולשניים, צורכים את הדגימה. . מכאן, זה יותר יתרון לשימוש חיישנים לא פולשנית, הפניה-פחות.

כיום, מערכות התגובה ולמחקר הם העדיף רבים הנדסה כימית, ביוטכנולוגיה יישומים כמו אלה מיקרוסיסטמס לספק בקרת תהליך משופר, יחד עם יתרונות רבים אחרים על מאקרו שלהם מערכת תחליפי. כדי לפקח ולשלוט הפרמטרים במערכת מיניאטורי הוא משימה מאתגרת כמו הגודל של חיישן למדידת, למשל, ה-pH O₂, צריך להיות ממוזערת גם כן. ייצור מוצלח של microreactors עבור מערכות ביולוגיות דורשים סוגים שונים של כלי אנליטי לניטור תהליך. לפיכך, התפתחות רחוקים חכמה ממלאת תפקיד משמעותי בביצוע תהליכים ביולוגיים ב- microreactors.

לאחרונה היו מספר נסיונות לפתח חיישנים חכמים pH באמצעות chemiresistive חישה חומרים כמו פחמן ו ניצוח פולימרים¹. חיישנים chemiresistive אלה דורשות אלקטרודה אין התייחסות, קל להשתלב עם מעגלים אלקטרוניים. חיישנים chemiresistive מוצלח מאפשרים לייצר חיישנים חכמים הם חסכוני וקל ייצור, דורשים אמצעי אחסון קטן לבדיקה, לא פולשנית.

כאן, אנחנו מדווחים שיטה לפיתוח אלקטרודה עם תחמוצת גראפן polyaniline functionalized, electrochemically מופחת. האלקטרודה chemiresistive פועל חיישן ה-pH במהלך התסיסה lactis ל' . ל' lactis הוא חיידק חומצת חלב-לייצור חומצה המשמשים מזון ואחסון תהליכי שימור מזון. במהלך התסיסה, הייצור של חומצה לקטית מוריד את רמת ה-pH, החיידק מפסיק לגדול ב pH נמוך^2,3,4.

מדיום התסיסה מהווה סביבה כימית מורכב המכיל פפטידים, מלחים, מולקולות חמצון-חיזור, אשר נוטים להפריע חיישן משטח^5,6,7,8,9. מחקר זה מראה כי יש חיישן ה-pH על בסיס חומר chemiresistive עם שכבת הגנה ראויה משטח יכול לשמש למדידת pH בסוג זה של מדיה תסיסה מורכבים. במחקר זה, בהצלחה נשתמש Nafion כשכבת הגנה על תחמוצת גראפן מצופים polyaniline, electrochemically מופחת כדי למדוד את ה-pH של בזמן אמת במהלך התסיסה lactis ל' .

Protocol

1. הכנת תחמוצת גרפיט

הערה: גרפיט תחמוצת מוכן לפי האמרים שיטת^10,11.

1. הוסף דור 3 של גרפיט לתוך מ 69 ל H מרוכז₂כדי₄ ומערבבים הפתרון עד הגרפיט יש לחלוטין התפזרו. להוסיף 1.5 גר' נתרן חנקיתי ולהשאיר את זה עבור h 1 תוך כדי ערבוב. אז, במקום המיכל באמבט קרח.
2. בוזקים 9 גרם של אשלגן פרמנגנט הפיזור המכולה ולהסיר אמבטיית קרח. לאפשר את הפתרון להתחמם לטמפרטורת החדר.
3. ראשית, להוסיף 138 מ ל מים מזוקקים dropwise. לאחר מכן, ממשיכים להוסיף 420 מ ל מים מזוקקים. לשמור על הטמפרטורה ב 90 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמצעות פלטה. להוסיף 7.5 mL של 30% מימן על-חמצני הפיזור.
4. לאסוף את המוצר על ידי צנטריפוגה ב g x 10,000 כעשרים דקות ולמחוק את הפתרון supernatant. לשטוף את צניפה 4 x עם מים חמים מזוקק פעמיים, 2 x עם פתרון HCl (v/v) 10%. לבסוף, לשטוף אותה 2 x עם אתנול יבש זה ב 50 מעלות צלזיוס בתנור.

2. ללכת להפקיד אלקטרודה הכנה

1. לפזר 10 מ ג של תחמוצת גרפיט 10 מ ל מים, ואז sonicate אותו באמבט אולטראסוני במשך 6 שעות.
2. להסיר פתיתי תחמוצת unexfoliated גרפיט על-ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות-2,700 g x. להשליך את חלקיקי מוצק לאחר צנטריפוגה ולהשתמש את תגובת שיקוע לניסויים נוספים.
   הערה: השתמשנו פיזור פתיתי exfoliated הזה ללכת כפתרון מניות.
3. לדלל הפתרון מניות ללכת כפולה. תמיד הכינו הפתרון עובד ללכת טריים מהפתרון מניות.
4. להוסיף 2 µL של הפתרון עובד ללכת על גבי החשוף interdigitated זהב אלקטרודה (איור 1A ואיור 2). לאחר ירידה יציקה, יבש האלקטרודה בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות. זהו האלקטרודה שהופקדו קדימה.

3. הוזלת ללכת Electrochemically מופחת תחמוצת גרפן

1. הכנס האלקטרודה המחזיק אלקטרודה polydimethylsiloxane (PDMS) (החלק התחתון). מניחים את החלק השני של בעל אלקטרודה, המשמש מאגר פתרון, על גבי האלקטרודה כמוצג כמו איור 1A - 1 C. להרכיב את בעלי על ידי חיתוך שני החלקים יחד באמצעות מהדקים שני. ודא כי המחזיק PDMS אינו מכסה החלק אלקטרודה שהופקדו קדימה.
2. Pipet 300 µL מאגר פוספט 0.2 מ' (pH 7) בתוך המאגר. ואז, למקם את ההפניה, האלקטרודה מונה הפתרון כך האלקטרודות ממוקמות קרוב לפני השטח של הסרט קדימה, כפי שמוצג באיור 1C. זה משמש תא אלקטרוכימי לבצע הפחתת אלקטרוכימי של קדימה, להפקדה polyaniline.
3. התחבר האלקטרודות potentiostat מחובר למחשב עבור רכישת נתונים. השתמש וולטמטריה להקטנת אלקטרוכימיות: בחר 0 ל- 1.2 V מגוון אפשריות ו- mV 50/s כמו קצב הסריקה. מחזור את המתח על פני האלקטרודה בין 0 ל- 1.2 V 10 x (איור 3).
4. לאחר הניסוי, להסיר את האלקטרודה ממחזיק, שוב ושוב לשטוף אותה במים מזוקק פעמיים. לאחר מכן, יבש האלקטרודה בתנור ב 101 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
5. כאשר האלקטרודה יבש, להסיר את האלקטרודה מהתנור ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, למדוד את מוליכות האלקטרודה עם multimeter. האלקטרודה מכונה עכשיו אלקטרודה אוקסיד (ERGO) גראפן electrochemically מופחת.

4. Polyaniline Functionalization של חברת ארגו אלקטרודה

1. היכונו מונומר אנילין 10 מ מ functionalization polyaniline. להמיס µL 5 של אנילין 10 מ מ ב 5 מ של 1 מ' H₂אז₄.
2. עבור functionalization polyaniline, להוסיף µL 300 של מונומר אנילין המאגר פתרון. מניחים האלקטרודה שהופקדו ERGO המחזיק אלקטרודה כפי שמתואר בהליך להפחתת קדימה.
3. להשתמש וולטמטריה electropolymerization של אנילין כדי functionalize ארגו לתוך ערגה-polyaniline (ERGO-PA): בחר 0 כדי 0.9 V מגוון אפשריות ו- mV 50/s כמו קצב הסריקה. מחזור את המתח על פני האלקטרודה בין 0 ל 0.9 V 50 x (איור 4).
4. אחרי העדות polyaniline, להסיר את האלקטרודה, שוב ושוב לשטוף אותה במים מזוקק פעמיים. לאחר מכן, יבש האלקטרודה ב 80 מעלות צלזיוס בתנור במשך 12 שעות.
5. להסיר את האלקטרודה מהתנור ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני מדידה את מוליכות האלקטרודה עם multimeter.
6. להכין פתרון מאגר pH 5 על-ידי הוספת 0.2 M NaOH הפתרון מאגר בריטון-רובינסון עד pH 5 (ראה שלב 5.1). לשמור על האלקטרודה במאגר ב- pH 5 במשך 24 שעות ביממה.
   1. כדי להכין פתרון אוניברסלי מאגר בריטון-רובינסון, מערבבים 0.04 מול של חומצה זרחתית 0.04 מול של חומצה אצטית, 0.04 מול של חומצה בורית ב- 0.8 לליטר מים הנדסה גנטית. להוסיף 0.2 מ' סודיום הידרוקסיד dropwise בופר עד ה-pH הרצוי⁴. להוסיף מים הנדסה גנטית עד שאמצעי האחסון הסופי 1 ל'

5. ERGO-PA אלקטרודה בדיקות ב- pH שונים (כיול מראש לפני ציפוי Nafion)

1. לאחר מיזוג האלקטרודה בפתרון מאגר pH 5, למדוד את ההתנגדות של האלקטרודה בפתרונות של pH שונים (מ- pH 4 ל pH 9; ראה איור 5).
   1. על מדידה זו, לטבול האלקטרודה ישירות בופר וחבר החלק השני של האלקטרודה potentiostat מבוקר-מחשב עבור רכישת נתונים. לשנות את ה-pH באמצעות titrating עם 0.2 M NaOH.
   2. בחר chronopotentiometry או amperometry curve i-t מהרשימה של טכניקות ולהחיל mV 100 הפרש הפוטנציאלים אל האלקטרודה.
      הערה: potentiostat מודד הנוכחי נגד הזמן. תוכנת השליטה של potentiostat מספק ייצוג גרפי של הזרם נגד הזמן.
   3. השתמש חוק אוהם (התנגדות שווה מתח מחולק הנוכחי) כדי לחשב את ערך התנגדות מן המתח הנוכחי ויישם נמדד.
2. אחרי המדידות, יבש האלקטרודה בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות.

6. הכנת האלקטרודה מצופים Nafion ארגו-הרשות הפלסטינית

1. להוסיף 5 µL של 5% wt Nafion על גבי האלקטרודה ERGO-PA ויבש האלקטרודה בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות.
2. לאחר הציפוי Nafion, לשמור האלקטרודה בופר ב- pH 5 עבור 24 שעות לפני מדידות pH.
3. לאחר מיזוג ב- pH 5, להסיר את האלקטרודה מצופים Nafion ERGO-PA (ERGO-הרשות הפלסטינית-נה) ולמדוד את התנגדותם של האלקטרודה מ- pH 4 ל pH 9 כאמור בסעיף 5.1 (איור 6).

7. הכנת ל' lactis תרבות בינוני

1. להוסיף 9.3 גר' אבקה M17 לתוך 250 מ של מים הנדסה גנטית. לאט לאט להתסיס את הפתרון עד האבקה מתמוסס לחלוטין. אוטוקלב הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
2. לוקחים בקבוקון סטיריליים 250-mL עם בר פגים ולהוסיף 50 מ של המדיום M17 סטיריליים הבקבוקון. לאחר מכן, להוסיף 8 מ של תמיסת גלוקוז 1 מ' בלוק. לחסן את הפתרון עם 10 µL של תרבות lactis ל' , גדל בעבר המדיום באותה תרבות.
   הערה: המתח חיידקי היה המתקבלים יאן קוק, גנטיקה מולקולרית, האוניברסיטה של חרונינגן.
3. מניחים את הבקבוק עם אמצעי התרבות חוסנו עבור 18 h על צלחת פגים בתנור הדגירה ב 30 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב ונטר את ה-pH.

8. בדיקה של ה-pH ERGO-הרשות הפלסטינית-נה התגובה בניסוי תסיסה lactis ל'

1. למקם את האלקטרודה ERGO-הרשות הפלסטינית-נה התרבות ל' lactis וסגור אותה עם תקע כותנה. לאחר מכן, למקם את הסידור התרמוסטט ב 30 מעלות צלזיוס לגדול lactis ל'.
2. החלת 100 mV אלקטרודה, המידה הנוכחית נגד הזמן.
3. דגימות 0.5-mL בנקודות זמן שונות (ראה, למשל, איור 7) כדי למדוד במצב לא מקוון הצפיפות האופטית-600 nm ו ה-pH עם אלקטרודת זכוכית המקובלת. המשך את המידות עד הצפיפות האופטית של התרבות הופך להיות קבועה, המציין כי החיידק לא גדלים יותר.

תוצאות

המראה של ירידה חזקה לשיא בסביבות-1.0 V (איור 3) מאויר ההפחתה של קדימה כדי ERGO^12,13,14,22. האינטנסיביות של הפסגה תלויה במספר שכבות ללכת על האלקטרודה. סרט שחור עבה מכוסה לגמרי את חוטי זהב על האלקטר...

Discussion

זה חיוני כי הדרך שכבות לגמרי לכסות את החוטים אלקטרודה זהב אחרי העדות של קדימה. אם האלקטרודות זהב שאינם מכוסים ללכת, polyaniline תוכלו לא רק להפקיד ERGO אלא גם את החוטים אלקטרודה זהב גלוי ישירות. בתצהיר של polyaniline עם החוטים אלקטרודה זהב ועלולות להיות לה השלכות על הביצועים של האלקטרודה. לאחר ההפחתה של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Graphite flakes	Sigma Aldrich
Sulfuric acid (H2SO4)	Merck
Sodium nitrite (NaNO2)	Sigma Aldrich
Potassium permanganate (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	Merck
Aniline	Sigma Aldrich
5wt % Nafion	Sigma Aldrich
M17 powder	BD Difco
Phosphoric acid (H3PO4)	Sigma Aldrich
Boric acid (HBO3)	Merck
Acetic acid	Merck
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Dipostassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich
Au Interdigitated electrodes	BVT technology - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)