Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

Resumen

Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.

Resumen

Existe un creciente interés en líquido biopsia para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico y el seguimiento terapéutico, creando la necesidad de marcadores biológicos confiables y útiles para la práctica clínica. Aquí, presentamos un protocolo para extraer, retroceso transcribir y evaluar los niveles de expresión de miRNAs de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) de circulación. microRNAs (miRNAs) son una clase de RNAs no codificantes de 18-25 nucleotides en longitud que regulan la expresión de genes diana a nivel traduccional y juegan un papel importante, incluyendo el de la función de pro - y anti-angiogénicos, en la fisiopatología de varios órganos. miRNAs son estables en fluidos biológicos como el suero y el plasma, que los hace ideal circulación biomarcadores para cáncer diagnóstico, pronóstico y tratamiento la toma de decisiones y monitoreo. Extracción de miRNA de circulación se realizó mediante un método rápido y eficaz que consiste en métodos orgánicos y basados en la columna. Para miRNA retrotranscripción, se utilizó un procedimiento de múltiples paso que considera poliadenilación en 3' y la ligadura de un adaptador a 5' de los miRNAs maduros, seguido de pre-amplificación miRNA al azar. Seleccionamos un panel personalizado 24-miRNA a prueba por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y vistos los sondeos miRNA en placas personalizadas de matriz. Se realizaron carreras de placa de qRT-PCR en un sistema de PCR en tiempo real. Limpieza miRNAs de normalización fueron seleccionados utilizando el software GeNorm (v. 3.2). Los datos se analizaron utilizando el software de la suite de expresión (v 1.1) y se realizaron análisis estadísticos. El método demostró para ser confiable y técnicamente robusto y puede ser útil para evaluar los niveles de biomarcadores en muestras líquidas como el plasma o suero.

Introducción

CRC representa la tercera más frecuentemente diagnosticada la malignidad y la cuarta causa de muerte relacionada con cáncer en todo el mundo. Hasta la fecha, (B) el bevacizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y (C) el cetuximab o panitumumab (P), anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), han sido aprobados para tratamiento de primera línea en combinación con regímenes de quimioterapia (CT).

Las mutaciones en los genes K-ras y N-RAS son los biomarcadores clínicamente útiles sólo capaces de identificar pacientes que tienen menos probabilidades de beneficiarse de las CT basadas en anti-EGFR Aunque se han realizado varios estudios para buscar biomarcadores que son predictores de respuesta al TC de B, todavía hay una falta importante de drogas eficaces y confiables para su uso en la práctica clínica¹.

miRNAs son RNAs pequeños (18-25 nucleotides en longitud) que regulan la traducción de genes diana y desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiopatológicos, incluyendo la embriogénesis y la carcinogénesis. Estas moléculas son muy estables en fluidos biológicos como el plasma, suero, orina y esputo, que los hace robustos biomarcadores para muestreo no invasivo². Usando un panel de miRNAs involucrados en la vía angiogénica, se procuró identificar circulando nuevos biomarcadores capaces de predecir el resultado clínico en pacientes con CCR metastático (mCRC) tratados con un régimen de CT basados en B.

Hemos analizado una serie de 52 mCRC pacientes tratados con CT B basado en el prospectivo multicéntrico aleatorizado fase III ensayo "italiano prueba en avanzado cáncer colorrectal" (ITACa). El presente Protocolo fue aprobado por el Comité de ética Local (Comitato Etico área Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo por lo dei de Studio e la Cura Tumori (IRST) IRCCS, Nº 674) en 19^th septiembre de 2007. Todos los pacientes dieron consentimiento informado antes de la recogida de muestras de sangre. Para cada paciente, se recogieron muestras de sangre venosa antes del tratamiento y en la primera evaluación clínica (después de 8 semanas) para evaluar la expresión del miRNA de línea de base y su modulación durante el tratamiento en relación con los resultados de los pacientes.

A través de una búsqueda de la literatura, se seleccionaron 21 miRNAs correlacionados con el proceso angiogénico que son conocidos por ser detectable en el plasma humano: p ha-miR-107, ha-miR-126-3, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a - 5p, ha-miR-200b - 3P, ha-miR-20b - 5p , ha-miR-21-5 p, p ha-miR-210-3, ha-miR-221-3 p, p ha-miR-24-3, p ha-miR-27a - 3P, ha-miR-29b - 3P, ha-miR-335-5, p ha-miR-424-5, ha-miR-497-5 p, p ha-miR - 520d - 3P, ha-miR-92a - 3P, ha-miR-17-5 y ha-miR-155-5 p. También seleccionamos p ha-miR-223-3 y ha-mir-484 para normalización endógena^3,4,5,6y cel-miR-39 purificaron de C. elegans como un punto de normalización exógeno. Normalizar los datos se realizaron utilizando el método de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

La detección de circulación miRNAs presenta algunas dificultades técnicas porque las moléculas están presentes en niveles muy bajos en el plasma y su amplificación es químicamente un desafío dada su secuencia corta. Por estas razones, hemos seleccionado un procedimiento que considera la extracción orgánica con fenol y una metodología basada en la columna de fibra de vidrio. Extracción de miRNA de circulación es un tema candente en el área de líquido biopsia, y seleccionamos un kit comercial que ha demostrado ser uno de los más confiables en términos de cantidad y calidad de rendimientos recuperados^7,8. Hemos seleccionado un protocolo para invertir transcriba miRNAs por la adición de un adaptador en 5' y una cola de poly(A) a 3' de lo miRNA maduro para mejorar la selectividad y especificidad de la reacción.

Dada la robustez del método, diseñamos personalizadas platos con sondas previamente manchadas para RT-PCR evaluar cada muestra por duplicado y análisis a 2 pacientes dentro de cada placa, como se muestra en la figura 1.

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Protocolo

Nota: Realizar todos los pasos siguientes bajo una campana de humos esterilizados según buenas prácticas de laboratorio (BPL).

1. almacenamiento y recogida de plasma

1. Recoger 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo de EDTA K3E.
2. Centrifugar el tubo a temperatura ambiente en 1.880 x g durante 15 minutos.
3. Recupera el plasma sobrenadante en alícuotas de 450 μl.
4. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso.
   Nota: Proceso del tubo de sangre periférica dentro de las 2 h de colección. Cuando se recupera el plasma del tubo, no molestes a la capa de linfocitos.

2. extracción de circulación miRNAs de muestras de Plasma (tabla de materiales)

1. Preparar todas las soluciones necesarias y descongelar las muestras para los pasos de extracción.
   1. Añadir 375 μl de 2-Mercaptoetanol a la solución de x denaturating 2 y mezclar bien.
   2. Agregar 21 mL de etanol al 100% grado ACS a la solución de lavado miRNA I y mezcla bien.
   3. Añadir 40 mL de etanol al 100% grado ACS a la solución de lavado 2/3 y mezclar bien.
   4. Permiten un plasma alícuota a descongelar a temperatura ambiente y luego comenzar los pasos de extracción.
2. Extracción orgánica
   1. Transfiera 400 μL de la muestra de plasma en un tubo de 2 mL libre de Rnasa.
   2. Añadir 400 μL de solución de x denaturating 2, mezclar por Vortex y centrifugar brevemente.
   3. Añadir 4 μL de 1 nM punto, mezclar por Vortex y centrifugar brevemente.
   4. Añadir 800 μl de ácido fenol-cloroformo.
   5. Vórtice de 60 s y centrifugar a máxima velocidad (≥10, 000 x g) durante 15 minutos.
   6. Transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. No molestes a la interfase. Nota el volumen recuperado y descartar el tubo que contiene la fase no-acuoso.
      Nota: 2 x solución de desnaturalización se almacena a 4 ° C y puede solidificar a esta temperatura. Antes de usar, caliente la solución a 37 ° C, agitando de vez en cuando durante 10-15 minutos procure retirar la fase inferior que contiene el ácido fenol-cloroformo, no el buffer acuoso que se encuentra encima de la mezcla. Precalentar la solución de elución o agua libre de nucleasas hasta 95 ° C. Tenga cuidado al calentar un volumen adecuado de solución (100 μl por muestra + 10% de exceso).
3. Enriquecimiento de RNA pequeños
   1. Añada 1/3 volumen de etanol 100% a la fase acuosa del paso 2.2.6 y mezcle bien.
   2. Coloque un cartucho de filtro en un tubo de la colección nueva para cada muestra.
   3. Transferencia de hasta 700 μl de lisado de paso 2.3.1 y etanol en el cartucho del filtro y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
   4. Si hay > 700 μl de mezcla de izquierda, colocar el filtrado en un tubo nuevo y repita el paso 2.3.3; Repita hasta que la mezcla ha pasado a través del cartucho de filtro.
   5. Medir el volumen total del paso.
   6. Añadir 2/3 volumen de etanol 100% a filtrar y mezclar bien.
   7. Colocar un segundo cartucho de filtro en un tubo de recogida fresca.
   8. Transferencia de hasta 700 μl de volumen de la muestra en el cartucho y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s. descarte el flujo a través.
   9. Repita el paso 2.3.8 hasta que la mezcla ha pasado a través del cartucho de filtro.
   10. 700 μl de solución de lavado miRNA 1 se aplica al cartucho de filtro y centrifugue el cartucho del filtro con el tubo de la colección a 10.000 x g durante 15 s. descarte el flujo a través. Coloque el cartucho en el mismo tubo de la colección.
   11. Aplicar 500 μl de solución de lavado 2/3 para el cartucho del filtro y centrifugue el cartucho del filtro con el tubo de la colección a 10.000 x g para descartar s. 15 el flujo a través. Coloque el cartucho del filtro en un tubo de colección fresca.
   12. Coloque el cartucho del filtro en un tubo de colección fresca y repetir el paso 2.3.11 con 500 μl de solución de lavado 2/3. Deseche el flujo a través y transfiera el cartucho del filtro a un tubo de colección fresca.
   13. Centrifugar los tubos con los cartuchos de filtro a 10.000 x g durante 1 minuto.
   14. Transfiera el cartucho del filtro en un tubo de colección de frescos 1,5 mL y añadir 100 μl de solución de elución de precalentado (95 ° C) o agua libre de nucleasa.
   15. Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s para recuperar miRNAs y almacenar a-80 ° C.
       Nota: Se puede formar un precipitado blanco en la solución de lavado 2/3. Se trata de exceso EDTA liberado de la solución. Evitar la elaboración de estos cristales durante los pasos de pipeteo.

3. realizar la transcripción inversa y miRNA pre-amplificación (tabla de materiales)

1. Realizar la reacción de poliadenilación
   1. Descongelar todos los reactivos en el hielo, y luego brevemente vortex y centrifugar a girar hacia abajo el contenido. Además, el deshielo 50% PEG 8000, lo que le permite alcanzar la temperatura ambiente.
   2. Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga 0.5ml, obteniendo un volumen final de 3 μl de reacción cóctel para cada muestra. Utilice los siguientes volúmenes, además de volumen exceso de 10% para cada reactivo.
   3. Agregar 1,7 μl de agua libre de ARNasa, 0.5 μl de 10 x tampón Poly(A), 0.5 μl de 10 mM ATP y finalmente 0,3 μl 5 U/μl PolyA enzima.
   4. Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
   5. Transferencia de 2 μl de la muestra a cada pocillo de la placa de reacción o tubo de ensayo y agregar 3 μl de la reacción de cóctel. Brevemente vortex y centrifugar a girar hacia abajo el contenido.
   6. Coloque los placa y tubos en un termociclador y realice los pasos siguientes.
   7. Incubar a 37 ° C por 45 minutos (paso de poliadenilación).
   8. Incubar a 65 ° C durante 10 minutos (parada de la reacción), con un asimiento siguiente a 4 ° C.
2. Realizar la reacción de ligadura.
   1. Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga con los siguientes volúmenes para cada muestra y el 10% del volumen en exceso.
   2. Agregar 0,4 μL de agua libre de ARNasa, 3 μl de 5 x buffer ligasa de ADN, 0,6 μl de 25 x adaptador ligadura, 4.5 μl 50% PEG 8000 y finalmente 1.5 μl de ligasa de RNA.
   3. Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
   4. Añadir 10 μl de la mezcla a cada tubo de reacción bien poly(A) el producto relave. Mezcle por un vibrador de placa a 1.900 rpm durante 1 min o vórtex brevemente y giro de los contenidos.
   5. Colocar los tubos de la placa, reacción en un termociclador con los ajustes siguientes: incubación a 60 º C durante 60 min, con los siguientes mantener a 4 ° C.
      Nota: 50% PEG 8000 es altamente viscoso. Utilizar a temperatura ambiente, aspiración y dispensación lentamente. Después de cada aspiración y dispensación de paso, mantener el condensador de 10 s para permitir que el reactivo a fluir hacia arriba y hacia abajo.
3. Realizar la reacción de transcripción reversa.
   1. Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga, con los siguientes volúmenes para cada muestra y el 10% del volumen en exceso.
   2. Añadir 3,3 μl de Rnasa agua, 6 μl de 5 x buffer de RT, 1,2 μl de dNTP mix (25 mM), 1,5 μl de 20 x primers universales RT y finalmente 3 μl de 10 x mezcla de enzimas RT.
   3. Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
   4. Añada 15 μl de la mezcla a cada tubo de reacción así que contiene el producto de la ligadura. Mezcle por un vibrador de placa a 1.900 rpm durante 1 min o vórtex brevemente y giro de los contenidos.
   5. Lugar la reacción de placa de tubos en un termociclador con los siguientes ajustes.
   6. Incubar a 42 ° C por 15 min (transcripción inversa).
   7. Incubar a 85 ° C durante 5 minutos (parada de la reacción), con un asimiento siguiente a 4 ° C.
      Nota: El producto RT ahora puede ser almacenado a-20 ° C y permanecerá estable hasta 2 meses.
4. Realizar la reacción de miR-Amp (tabla de materiales).
   1. Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga con los siguientes volúmenes para cada muestra y el 10% del volumen en exceso.
   2. Añadir 17.5 μl de agua libre de ARNasa, 25 μl de la mezcla principal de miR-Amp 2 x y 2.5 μl de 20 x mezcla de primer miR-Amp.
   3. Brevemente vortex y centrifugar la mezcla cocktail a girar hacia abajo el contenido.
   4. Para cada muestra, transferencia de 45 μl de la mezcla de reacción a cada pocillo de una placa nueva de reacción o un tubo de reacción. Añadir 5 μl del producto de RT a cada tubo de pozo o de la reacción. Mezcle por un vibrador de placa a 1.900 rpm durante 1 min o vórtex brevemente y giro de los contenidos.
   5. Lugar la reacción de placa de los tubos en un termociclador y ejecutar como se muestra en la tabla 1.

4. realizar la PCR en tiempo real

1. Diluir cada cDNA muestra 1:10 en tampón de TE x 0,1.
2. Calcular el número de pozos/repeticiones para cada muestra. Preparar la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga con los siguientes volúmenes para cada muestra, agregar 10% de volumen en exceso.
3. Añadir 4 μL de agua libre de ARNasa, 10 μl de 2 x rápido avanzado master mix (Tabla de materiales) y finalmente 5 μl de cDNA diluido.
4. Mezclar por Vortex y centrifugar brevemente para girar por el contenido.
5. Transferencia de 19 μl de mezcla de reacción para cada bien, sellar la placa y centrifugar brevemente.
6. Realizar el protocolo térmico (tabla 2) en un sistema de RT-PCR.

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Resultados

Hemos analizado un panel de miRNAs circulantes relacionados con la angiogénesis en relación con la supervivencia libre de progresión (PFS), general supervivencia y respuesta objetiva tarifa (ORR) en un mCRC 52 pacientes tratados con base B CT. La evaluación de estos biomarcadores en muestras de plasma es un reto debido a dificultades técnicas. Utilizamos métodos establecidos para la extracción de miRNA de las muestras de plasma paciente, transcripción inversa y amplificación prev...

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Discusión

miRNAs son pequeños no-codificación RNAs (18-25 nucleotides en longitud) capaces de atar la región 3' UTR de su objetivo de ARN mensajero e inhibiendo o lo degradantes. Así se pueden considerar los reguladores de expresión génica a nivel traduccional. En la última década, varios miRNAs se han correlacionado con cáncer iniciación y desarrollo, haciéndolos útiles biomarcadores clínicos para el diagnóstico, pronóstico y terapia. Protegido por RNasas, miRNAs están presentes en una forma estable en fluidos bio...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes