Détection d’un Panel de micro-ARN Custom circulant chez les Patients atteints de Cancer Colorectal métastatique

Résumé

Nous présentons un protocole pour évaluer les niveaux d’expression des microARN (miARN) en circulation dans les échantillons de plasma de patients atteints de cancer. En particulier, nous avons utilisé un kit disponible dans le commerce pour faire circuler l’extraction de miRNA et transcriptase inverse. Enfin, nous avons analysé un panel de 24 miARN sélectionnés à l’aide de plaques personnalisées sonde préalablement repéré en temps réel.

Résumé

Il est un intérêt croissant pour liquide biopsie pour le diagnostic du cancer, de pronostic et de suivi thérapeutique, créer le besoin pour des biomarqueurs fiables et utiles pour la pratique clinique. Nous présentons ici un protocole pour extraire, reverse transcrire et évaluer les niveaux d’expression des miARN provenant d’échantillons de plasma de patients atteints de cancer colorectal (CCR) en circulation. microARN (miARN) sont une classe d’ARN non codants des 18-25 nucléotides de long qui régulent l’expression de gènes cibles au niveau traductionnel et jouent un rôle important, y compris celle de la fonction pro - et anti-angiogéniques, dans la physiopathologie de différents organes. miARN est stables dans les fluides biologiques tels que le sérum et le plasma, ce qui les rend idéal circulant de biomarqueurs pour la prise de diagnostic, pronostic et le traitement du cancer et de surveillance. MiRNA extraction en circulation a été réalisée à l’aide d’une méthode rapide et efficace qui implique des méthodes organiques et basée sur les colonnes. MiRNA fut, nous avons utilisé une procédure multi-étapes qui considère la polyadénylation en 3' et la ligature d’un adaptateur à 5' de la miARN matures, suivie de pré-amplification miRNA aléatoire. Nous avons sélectionné un panneau personnalisé 24-miRNA à tester par quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) et repéré les sondes miRNA sur plaques personnalisées de tableau. Nous avons effectué qRT-PCR plaque fonctionne sur un système de PCR en temps réel. MiARN de ménage pour la normalisation ont été sélectionnés à l’aide du logiciel GeNorm (version 3.2). Données ont été analysées à l’aide du logiciel de la suite Expression (v 1.1) et les analyses statistiques ont été réalisées. La méthode s’est avérée fiable et techniquement solide et pourrait être utile pour évaluer les niveaux de biomarqueurs dans les échantillons liquides tels que le plasma ou le sérum.

Introduction

CRC représente la troisième plus fréquemment diagnostiqué une tumeur maligne et la quatrième cause de décès liés au cancer dans le monde. A ce jour, (B) le bevacizumab, un anticorps monoclonal dirigé contre le facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) et (C) le cetuximab ou panitumumab (P), des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), ont été approuvées pour traitement de première ligne en combinaison avec la chimiothérapie (CT).

Mutations dans les gènes de K-RAS et N-RAS sont les seuls biomarqueurs cliniquement utiles capables d’identifier les patients qui sont moins susceptibles de bénéficier de CT base anti-EGFR. Bien que plusieurs études ont été menées pour rechercher les biomarqueurs qui sont prédictifs de réponse au CT axée sur la B, il y a toujours un manque considérable de médicaments fiables et efficaces pour une utilisation en pratique clinique¹.

miARN est de petits ARN (18-25 nucléotides de long) qui réglementent la traduction des gènes cibles et joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiopathologiques, y compris l’embryogenèse et cancérogenèse. Ces molécules sont très stables dans les liquides biologiques comme le plasma/sérum, urine et crachats, ce qui les rend robustes biomarqueurs à utiliser pour l’échantillonnage non invasif². Utilisant un panel des miARN impliqués dans la voie angiogénique, notre objectif était d’identifier les nouvelles circulant biomarqueurs capables de prédire l’issue clinique chez les patients atteints de cancer Colorectal métastatique (mCRC) traités par un traitement à base de B CT.

Nous avons analysé une série de 52 mCRC patients traités par CT B-basée dans la prospective multicentrique randomisée de phase III du procès « italien du procès dans Advanced Cancer Colorectal » (ITACa). Le présent protocole a été approuvé par le Comité d’éthique Local (Comitato Etico zone Vasta e Scientifico Romagnolo Istituto per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, n° 674) sur 19^th septembre 2007. Tous les patients ont donné le consentement éclairé avant le prélèvement d’échantillons de sang. Pour chaque patient, les échantillons de sang veineux ont été recueillies avant traitement et à la première évaluation clinique (après 8 semaines) pour évaluer le niveau de référence miRNA expression et sa modulation pendant le traitement par rapport aux résultats pour les patients.

Grâce à une recherche de la littérature, nous avons sélectionné des 21 miARN en corrélation avec le processus angiogénique qui sont connus pour être détectable dans le plasma humain : a-miR-107, a-miR-126-3 p. p a-miR-145-5, a-miR-194-5, a-miR-199 - 5P, a-miR - 200 b - 3P, a-miR - 20 b - 5p , a-miR-21-5 p, a-miR-210-3 p, p a-miR-221-3, a-miR-24-3 p, p a-miR - 27 a - 3 p. a-miR - 29 b - 3, a-miR-335-5, p a-miR-424-5, a-miR-497-5 p, p a-miR - 520d - 3 p. a-miR - 92 a - 3, a-miR-17-5 et a-miR-155-5 p. Nous avons également sélectionné p a-miR-223-3 et a-mir-484 pour normalisation endogène^3,4,5,6et cel-miR-39 épuré de c. elegans comme spike-in pour la normalisation exogène. Tous les normalisations de données ont été réalisées à l’aide de la méthode de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

La détection des miARN en circulation présente quelques difficultés techniques car les molécules sont présents en très faibles quantités dans le plasma et leur amplification est chimiquement difficile compte tenu de leur courte séquence. Pour ces raisons, nous avons choisi une procédure qui tient compte tant organique d’extraction avec le phénol et une méthodologie basée sur les colonnes de fibre de verre. MiRNA extraction en circulation est un sujet d’actualité dans le domaine des liquide biopsie, et nous avons choisi une trousse commerciale qui a montré l’un des plus fiables en termes de quantité et qualité des rendements récupéré^7,8. Nous avons sélectionné un protocole pour inverser transcrire des miARN par l’ajout d’un adaptateur à 5' et une queue poly (a) à 3' de la miRNA mature pour améliorer la sélectivité et la spécificité de la réaction.

Étant donné la robustesse de la méthode, nous avons conçu des plaques personnalisées avec des sondes pré tachetés de RT-PCR évaluer chaque échantillon en double exemplaire et analysé 2 patients dans chaque assiette, comme illustré à la Figure 1.

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Protocole

Remarque : Exécuter toutes les étapes suivantes sous une hotte de laboratoire stérilisé selon les bonnes pratiques de laboratoire (bpl).

1. stockage et collecte de plasma

1. Collecter 3 mL d’échantillon de sang périphérique dans un tube EDTA K3E.
2. Centrifuger le tube à température ambiante comprise entre 1 880 x g pendant 15 min.
3. Récupérer le plasma surnageant dans des parties aliquotes de 450 µL.
4. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
   Remarque : Processus le tube de sang périphérique dans les 2 h suivant le prélèvement. Lorsque vous récupérez le plasma du tube, ne pas déranger la couche lymphocytaire.

2. extraction des miARN provenant d’échantillons de Plasma (Table des matières) en circulation

1. Préparer toutes les solutions nécessaires et les laisser décongeler pour les étapes de l’extraction.
   1. Ajouter 375 µL de 2-mercaptoéthanol à la solution de x denaturating 2 et bien mélanger.
   2. Ajouter 21 mL d’éthanol 100 % ACS à la solution de lavage miRNA I et mélanger bien.
   3. Ajouter 40 mL d’éthanol 100 % ACS à la solution de lavage 2/3 et bien mélanger.
   4. Permettre un plasma aliquote à décongeler à température ambiante et puis commencer les étapes de l’extraction.
2. Extraction organique
   1. Transférer 400 µL de l’échantillon de plasma dans un tube de 2 mL de RNase-libre.
   2. Ajouter 400 µL de solution de x denaturating 2, mélanger au vortex et centrifuger brièvement.
   3. Ajouter 4 µL de 1 nM spike-in, mélanger au vortex et centrifuger brièvement.
   4. Ajouter 800 µL d’acide phénol-chloroforme.
   5. Vortexer pendant 60 s et centrifuger à vitesse maximale (≥ 10, 000 x g) pendant 15 min.
   6. Transférer la phase aqueuse supérieure à un nouveau tube. Ne pas déranger l’interphase. Noter le volume récupéré et jeter le tube contenant la phase non-fait.
      Remarque : Le 2 x solution de dénaturation est stockée à 4 ° C et peut se solidifier à cette température. Avant utilisation, chaud la solution à 37 ° C, agitant occasionnellement pendant 10-15 min. Veillez à retirer la phase inférieure contenant l’acid phénol-chloroforme, pas le tampon de fait qui se trouve sur le dessus du mélange. Préchauffer la solution d’élution ou une eau exempte de nucléase à 95 ° C. Soyez prudent chauffer un volume suffisant de solution (100 µL par exemple + 10 % excès).
3. Enrichissement de RNA petit
   1. Ajouter 1/3 volume d’éthanol 100 % à la phase aqueuse de l’étape 2.2.6 et bien mélanger.
   2. Placez une cartouche de filtre dans un tube de prélèvement frais pour chaque échantillon.
   3. Transférer jusqu'à 700 µL de lysat d’étape 2.3.1 et d’éthanol dans la cartouche du filtre et centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s.
   4. S’il y a > 700 µL du mélange gauche, placer le filtrat dans un tube frais et répétez l’étape 2.3.3 ; Répétez jusqu'à ce que tout le mélange ait franchi la cartouche du filtre.
   5. Mesurer le volume total de l’accréditif.
   6. Ajouter 2/3 volume d’éthanol à 100 % pour le filtrat et bien mélanger.
   7. Placer une deuxième cartouche de filtre dans un tube de prélèvement de frais.
   8. Transférer jusqu'à 700 µL du volume de l’échantillon dans la cartouche et centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s. jeter le cheminement.
   9. Répétez l’étape 2.3.8 tout le mélange s’écouler de la cartouche filtrante.
   10. Appliquer 700 µL de solution de lavage miRNA 1 à la cartouche de filtre et centrifuger la cartouche du filtre avec le tube de prélèvement à 10 000 x g pendant 15 s. jeter le cheminement. Placez la cartouche filtrante dans le même tube de prélèvement.
   11. Demander 500 µL de solution de lavage 2/3 de la cartouche filtrante et centrifuger la cartouche du filtre avec le tube de prélèvement à 10 000 x g 15 s. jeter le cheminement. Placez la cartouche de filtre dans un tube de prélèvement de frais.
   12. Placez la cartouche de filtre dans un tube de prélèvement frais et répétez l’étape 2.3.11 avec 500 µL de solution de lavage 2/3. Jeter le cheminement et transférer la cartouche de filtre dans un tube de prélèvement de frais.
   13. Centrifuger les tubes avec les cartouches de filtre à 10 000 x g pendant 1 min.
   14. Transférer la cartouche de filtre dans un tube de prélèvement des frais de 1,5 mL et ajouter 100 µL de solution d’élution préchauffé (95 ° C) ou de l’eau exempte de nucléase.
   15. Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s pour récupérer des miARN et conserver à-80 ° C.
       Remarque : Un précipité blanc peut se former dans la solution de lavage 2/3. Il s’agit d’excès EDTA libéré de la solution. Éviter de tirer vers le haut de ces cristaux lors du pipetage.

3. effectuer la Transcription inverse et miRNA pré-amplification (Table des matières)

1. Effectuer la réaction de polyadénylation
   1. Fondre tous les réactifs sur la glace, puis brièvement vortex et centrifugeuse pour filer vers le bas le contenu. En outre, le dégel 50 % PEG 8000, lui permettant d’atteindre la température ambiante.
   2. Préparer le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger 0,5 mL, obtention d’un volume final de 3 µL de réaction cocktail pour chaque échantillon. Utiliser les volumes suivants, ainsi que 10 % du volume excédentaire pour chaque réactif.
   3. Ajouter 1,7 µL d’eau exempte de RNase, 0,5 µL de mémoire tampon poly (a) 10 x, 0,5 µL d’ATP de 10 mM et enfin 0,3 µL 5 U/µL PolyA enzyme.
   4. Brièvement vortex et centrifuger le mélange cocktail pour filer vers le bas le contenu.
   5. Transférer 2 µL de l’échantillon à chaque puits de la plaque de réaction ou de tube à essais et ajouter 3 µL de la réaction de cocktail. Brièvement le vortex et centrifuger à tourner vers le bas le contenu.
   6. Placer les plaque/tubes dans un thermocycleur et effectuez les opérations suivantes.
   7. Incuber à 37 ° C pendant 45 min (polyadénylation étape).
   8. Incuber à 65 ° C pendant 10 min (réaction d’arrêt), avec une cale suivante à 4 ° C.
2. Effectuer la réaction de ligature.
   1. Préparer le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger avec les volumes suivants pour chaque échantillon et 10 % du volume en excès.
   2. Ajouter 0,4 µL d’eau exempte de RNase, 3 µL de 5 x tampon de DNA ligase, 0,6 µL de 25 x adaptateur de ligature, 4,5 µL 50 % PEG 8000 et enfin 1,5 µL de ligase RNA.
   3. Brièvement vortex et centrifuger le mélange cocktail pour filer vers le bas le contenu.
   4. Ajouter 10 µL du mélange dans chaque tube de puits/réaction contenant le produit de résidus de poly (a). Mélanger par un agitateur de plaque à 1 900 tr/min pendant 1 min ou brièvement vortex et la centrifuger le contenu.
   5. Placer les tubes de plaque/réaction dans un thermocycleur avec les paramètres suivants : incubation à 60 ° C pendant 60 min, avec une suite tenir à 4 ° C.
      NOTE : 50 % PEG 8000 est très visqueux. Utiliser à température ambiante, aspiration et distribution lentement. Après chaque aspiration et distribution étape, tenez le plugger pendant 10 s pour permettre le réactif s’écouler en haut et en bas.
3. Effectuer la réaction de transcription inverse.
   1. Préparer le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger, avec les volumes suivants pour chaque échantillon et 10 % du volume en excès.
   2. Ajouter 3,3 µL d’eau exempte de RNase, 6 µL de 5 x tampon RT, 1,2 µL du mélange dNTP (25 mM), 1,5 µL de 20 x amorces universelles RT et enfin 3 µL de 10 x mélange enzymatique RT.
   3. Brièvement vortex et centrifuger le mélange cocktail pour filer vers le bas le contenu.
   4. Ajouter 15 µL du mélange dans chaque tube de puits/réaction contenant le produit de la ligature. Mélanger par un agitateur de plaque à 1 900 tr/min pendant 1 min ou brièvement vortex et la centrifuger le contenu.
   5. Placer les tubes de plaque/réaction dans un thermocycleur avec les paramètres suivants.
   6. Incuber à 42 ° C pendant 15 min (transcriptase inverse).
   7. Incuber à 85 ° C pendant 5 min (réaction d’arrêt), avec une cale suivante à 4 ° C.
      Remarque : Le produit de la RT peut maintenant être stocké à-20 ° C et demeurera stable jusqu'à 2 mois.
4. Effectuer la réaction de miR-Amp (Table des matières).
   1. Préparer le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger avec les volumes suivants pour chaque échantillon et 10 % du volume en excès.
   2. Ajouter 17,5 µL d’eau exempte de RNase et 25 µL du mélange maître miR-ampli 2 x 2,5 µL de 20 x mix amorce miR-Amp.
   3. Brièvement vortex et centrifuger le mélange cocktail pour filer vers le bas le contenu.
   4. Pour chaque échantillon, transfert 45 µL du mélange réaction à chaque puits d’une nouvelle plaque de réaction ou d’un tube à essais. Ajouter 5 µL du produit RT dans chaque tube de puits ou de la réaction. Mélanger par un agitateur de plaque à 1 900 tr/min pendant 1 min ou brièvement vortex et la centrifuger le contenu.
   5. Placer les tubes de plaque/réaction dans un thermocycleur et exécuter comme indiqué dans le tableau 1.

4. effectuer la PCR en temps réel

1. Diluer chaque cDNA échantillon 01:10 dans un tampon de TE x 0,1.
2. Calculer le nombre de puits/répétitions pour chaque échantillon. Préparer le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger avec les volumes suivants pour chaque échantillon, ajouter 10 % du volume en excès.
3. Ajouter 4 µL d’eau exempte de RNase, 10 µL de 2 x rapide avancée mélange principal (Table des matières) et enfin 5 µL de cDNA dilué.
4. Mélanger au vortex et centrifuger brièvement pour faire tourner vers le bas le contenu.
5. Transfert 19 µL du mélange de réaction pour chaque puits, sceller la plaque et centrifuger brièvement.
6. Effectuer le protocole thermique (tableau 2) sur un système de RT-PCR.

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Résultats

Nous avons analysé un panel des miARN circulant axés sur l’angiogenèse en ce qui concerne la survie sans progression (PFS), dans l’ensemble la survie (OS) et réponse objective taux (ORR) dans une mCRC 52 patients traités par CT B-basée. L’évaluation de tels biomarqueurs dans les échantillons de plasma est difficile en raison de difficultés techniques. Nous avons utilisé des méthodes établies pour miRNA extraction des échantillons de plasma patient, transcription inverse...

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Discussion

miARN est petit RNAs (18-25 nucléotides de long) qui lie la région 3' UTR de leurs cibles ARN messager et inhibant et/ou dégradant il non codantes. Ils peuvent donc être considérés régulateurs d’expression de gène au niveau traductionnel. Au cours de la dernière décennie, plusieurs miARN ont été corrélés avec le déclenchement du cancer et le développement, ce qui les rend utiles biomarqueurs cliniques pour le diagnostic, le pronostic et la thérapie. Protégés par des ribonucléases, miARN est présent...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes