Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll, um den Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MicroRNA (MiRNAs) bewerten in Plasma-Proben von Krebspatienten. Insbesondere haben wir einen im Handel erhältlichen Bausatz für zirkulierende MiRNA Extraktion und reversen Transkription verwendet. Zu guter Letzt haben wir eine Gruppe von 24 ausgewählten MiRNAs, die unter Verwendung der benutzerdefinierten Platten in Echtzeit vorab gefleckte Sonde analysiert.

Zusammenfassung

Es ist wachsendes Interesse an flüssigen Biopsie für Diagnose, Prognose und therapeutische Begleitung, die Notwendigkeit zuverlässiger und nützlicher Biomarker für die klinische Praxis zu schaffen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu extrahieren, rückwärts zu transkribieren und bewerten die Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MiRNAs aus Plasma-Proben von Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC). Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierende RNAs von 18-25 Nukleotide in der Länge, die den Ausdruck der Zielgene translationalen Ebene Regeln und spielen eine wichtige Rolle, einschließlich der Pro und Anti-angiogenen Funktion in die Physiopathologie des verschiedenen Organen. MiRNAs sind stabil in biologischen Flüssigkeiten wie Serum und Plasma, das macht sie ideal zirkulierende Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose und Behandlung Entscheidungen und Überwachung. Zirkulierenden MiRNA Extraktion erfolgte mittels eine schnelle und effektive Methode, die sowohl organische als auch Spalte basierenden Methoden beinhaltet. Für MiRNA Retrotranscription verwendeten wir ein Multi-Schritt-Verfahren, das Polyadenylation auf 3' und der Ligatur eines Adapters auf 5' von den Reifen MiRNAs, gefolgt von zufälligen MiRNA Vorverstärkung hält. Wir wählten einen 24-MiRNA benutzerdefinierten Bereich durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) getestet werden und die MiRNA-Sonden auf Array benutzerdefinierter Platten entdeckt. Wir führten qRT-PCR Platte läuft auf einer Echtzeit-PCR-System. Zimmermädchen MiRNAs für Normalisierung wurden ausgewählt, mit GeNorm-Software (v. 3.2). Daten wurden analysiert mit Expression Suite Software (V 1.1) und statistische Analysen wurden durchgeführt. Die Methode erwies sich als zuverlässig und technisch robust sein und könnte nützlich sein, Biomarker Ebenen in flüssigen Proben wie Plasma/Serum oder zu bewerten.

Einleitung

CRC ist die dritte Bösartigkeit und die vierte Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit am häufigsten diagnostiziert. Bis heute sind Bevacizumab (B), einem monoklonalen Antikörper gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), und (C) Cetuximab oder Panitumumab (P), monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), zugelassen First-Line-Behandlung in Kombination mit Chemotherapie (CT)-Regimen.

Mutationen im K-RAS und N-RAS -gen sind die einzige klinisch nützlich Biomarker identifizieren Patienten, die am seltensten zugunsten von Anti-EGFR-basierten CT. Obwohl mehrere Studien sind, zur Suche nach Biomarkern, die vorausschauende Antwort auf B-basierten CT sind durchgeführt worden, gibt es immer noch ein erheblichen Mangel an zuverlässige und wirksame Arzneimittel für den Einsatz in der klinischen Praxis¹.

MiRNAs sind kleine RNAs (18-25 Nukleotide in der Länge), die die Übersetzung von Zielgenen regulieren und spielen eine entscheidende Rolle in zahlreichen pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Embryogenese und in der Karzinogenese. Diese Moleküle sind hochstabile in biologischen Flüssigkeiten wie Plasma/Serum, Urin und Speichel, die sie macht, robuste Biomarker für nicht-invasive Probenahme²verwenden. Mit einem Panel von MiRNAs angiogenen Weg beteiligt, wir wollten identifizieren neuer Biomarker zur Vorhersage klinische Ergebnisse bei Patienten mit metastasiertem CRC (mCRC) im Umlauf mit einer B-basierten CT-Therapie behandelt.

Wir analysieren eine Reihe von 52 mCRC Patienten mit B-basierten CT innerhalb der prospektiven multizentrischen randomisierten phase III Studie "italienische Trial in Advanced Colorectal Krebs" (ITACa). Dieses Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt (Comitato Etico Bereich Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Nr. 674) auf 19^th September 2007. Alle Patienten gaben Einwilligung vor Blut Musterkollektion. Für jeden Patienten wurden venöse Blutproben vor der Behandlung und bei der ersten klinischen Untersuchung (nach 8 Wochen) gesammelt, um die Basislinie MiRNA Ausdruck und seine Modulation während der Behandlung in Bezug auf Patienten-Outcome zu bewerten.

Durch eine Suche der Literatur ausgewählt wir 21 MiRNAs korreliert mit dem Angiogenese-Prozess, die bekanntermaßen im menschlichen Plasma nachweisbar sind: hat-MiR-107, hat-MiR-126-3 p, hat-MiR-145-5-p, hat-MiR-194-5 p, hat-MiR-199a - 5P, hat-MiR - 200 b - 3p, hat-MiR - 20 b - 5P , hat-MiR-21-5 p, hat-MiR-210-3 p, hat-MiR-221-3 p, hat-MiR-24-3 p, hat-MiR-27a - 3P, hat-MiR - 29 b - 3p, hat-MiR-335-5 p, hat-MiR-424-5 p, hat-MiR-497-5 p, hat-MiR - 520d - 3p, hat-MiR-92a - 3P, hat-MiR-17-5 p und hat-MiR-155-5 p. Auch wir ausgewählt hat-MiR-223-3 p und hat-Mir-484 für endogene Normalisierung^3,4,5,6und Cel-MiR-39 von C. Elegans als Spike-in für exogene Normalisierung gereinigt. Alle Daten Normierungen wurden mit 2 ̂ ̄(ΔΔCt) Methode durchgeführt.

Der Nachweis von zirkulierenden MiRNAs präsentiert einige technischen Schwierigkeiten, weil die Moleküle auf einem sehr niedrigen Niveau im Plasma sind und ihre Verstärkung chemisch anspruchsvollen angesichts ihrer kurze Sequenz ist. Aus diesen Gründen haben wir ein Verfahren, das organische Extraktion mit Phenol und einem Glasfaser Spalte basierenden Methodik hält ausgewählt. Zirkulierenden MiRNA-Extraktion ist ein heißes Thema im Bereich der flüssigen Biopsie und eine kommerzielle Kit, das gezeigt hat, zu einem der zuverlässigsten ausgewählt wurden in Bezug auf Menge und Qualität der wiederhergestellten Erträge^7,8. Wir haben ein Protokoll zum Umkehren MiRNAs durch das Hinzufügen eines Adapters an 5' und ein Poly-Tail, 3' die Reife MiRNA zur Verbesserung der Selektivität und Spezifität der Reaktion zu transkribieren.

Die Robustheit der Methode gegeben, wir entwickelt kundenspezifische Platten mit Pre-gefleckte Sonden für RT-PCR zu jeder Probe in zweifacher Ausfertigung zu beurteilen und 2 Patienten innerhalb jeder Platte analysiert, wie in Abbildung 1dargestellt.

Protokoll

Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem sterilisierten Abzug entsprechend gute Labor Praxis (GLP).

(1) Plasma Datenerhebung und-Speicherung

1. Sammeln Sie 3 mL des peripheren Blutprobe in einem K3E EDTA-Röhrchen.
2. Zentrifugieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur bei 1.880 X g für 15 min.
3. Der Überstand Plasma in Aliquote von 450 µL zu erholen.
4. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung.
   Hinweis: Prozess der peripheren Blut Tube innerhalb von 2 h Sammlung. Wenn Sie das Plasma aus der Tube wiederherstellen, stören Sie die Lymphozyten-Schicht nicht.

2. Gewinnung von zirkulierenden MiRNAs aus Plasma-Proben (Table of Materials)

1. Bereiten Sie die erforderlichen Lösungen und tauen Sie die Proben für die Extraktion Schritte.
   1. Die 2 X denaturating Lösung 375 µL 2-Mercaptoethanol hinzufügen und gut verrühren.
   2. Hinzu kommen 21 mL ACS Klasse 100 % Ethanol die MiRNA-Waschlösung ich und Mischung gut.
   3. Die Waschlösung 2/3 40 mL ACS Klasse 100 % Ethanol hinzufügen und gut verrühren.
   4. Ein Plasma aliquoten bei Raumtemperatur auftauen und dann beginnen die Extraktion Schritte zu ermöglichen.
2. Bio-Extraktion
   1. 400 µL der Probe Plasma in ein RNase-freie 2 mL Röhrchen zu übertragen.
   2. Fügen Sie 400 µL 2 X denaturating-Lösung hinzu, mischen Sie, indem aufschütteln und kurz zentrifugieren.
   3. Fügen Sie 4 µL 1 nM Spike-in hinzu, mischen Sie, indem aufschütteln und kurz zentrifugieren.
   4. Fügen Sie 800 µL Säure Phenol-Chloroform.
   5. Vortex für 60 s und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (≥10, 000 X g) für 15 Minuten.
   6. Übertragen Sie die oberen wässrige Phase auf einem frischen Rohr. Stören Sie die Interphase nicht. Hinweis: die Lautstärke wiederhergestellt und entsorgen Sie das Röhrchen mit der nicht-Acqueous-Phase.
      Hinweis: 2 x Denaturierung Lösung ist bei 4 ° C gelagert und kann bei dieser Temperatur erstarren. Vor dem Gebrauch warm die Lösung auf 37 ° C, gelegentlich für 10-15 min. Rühren vorsichtig sein berechtigt, die untere Phase mit der Säure Phenol-Chloroform, nicht die Acqueous-Puffer, der über die Mischung liegt. Vorheizen der Elution Lösung oder Nuklease-freies Wasser bis 95 ° C. Achten Sie darauf, um eine angemessene Volumen der Lösung (100 µL pro Probe + 10 % Überschuss) zu erhitzen.
3. Kleine RNA-Anreicherung
   1. 1/3 Volumen Ethanol 100 % der wässrigen Phase aus Schritt 2.2.6 hinzufügen und gut mischen.
   2. Legen Sie eine Filterpatrone in eine frische Sammelröhrchen für jede Probe.
   3. Übertragen Sie bis zu 700 µL lysate vom Schritt 2.3.1 und Ethanol in der Filterpatrone und Zentrifuge bei 10.000 X g für 30 s.
   4. Wenn es gibt > 700 µL Gemisch links, legen Sie das Filtrat in ein frisches Tubus und wiederholen Sie Schritt 2.3.3; Wiederholen Sie, bis die Mischung der Filterpatrone durchlaufen hat.
   5. Das Gesamtvolumen der Flow-through zu messen.
   6. Fügen Sie 2/3 Menge Ethanol 100 % Filtrat und gründlich mischen.
   7. Legen Sie eine zweite Filterpatrone in eine frische Sammelröhrchen.
   8. Transfer bis zu 700 µL Probenvolumen in die Patrone und Zentrifugieren bei 10.000 X g 30 S. verwerfen der durchströmten.
   9. Wiederholen Sie Schritt 2.3.8, bis die Mischung der Filterpatrone durchlaufen hat.
   10. Die Filterpatrone zuweisen Sie 700 µL MiRNA Waschlösung 1 und Zentrifugieren Sie der Filtereinsatz mit dem Sammelrohr bei 10.000 X g 15 S. verwerfen der durchströmten. Legen Sie die Filterpatrone in dem gleichen Sammelrohr.
   11. Beantragen Sie 500 µL der Waschlösung 2/3 der Filterpatrone und Zentrifuge der Filtereinsatz mit dem Sammelrohr bei 10.000 X g 15 S. verwerfen der durchströmten. Legen Sie die Filterpatrone in eine frische Sammelröhrchen.
   12. Legen Sie die Filterpatrone in eine frische Sammelröhrchen und wiederholen Sie Schritt 2.3.11 mit 500 µL der Waschlösung 2/3. Verwerfen Sie der durchströmten und übertragen Sie die Filterpatrone auf eine frische Sammelröhrchen.
   13. Zentrifugieren Sie die Rohre mit der Filterpatronen bei 10.000 X g für 1 min.
   14. Die Filterpatrone in eine frische 1,5 mL Sammelröhrchen übertragen und 100 µL vorgewärmten (95 ° C) Elution Lösung oder Nuklease-freies Wasser hinzufügen.
   15. Zentrifuge bei 10.000 X g für 30 s MiRNAs wiederherstellen und speichern bei-80 ° C.
       Hinweis: Ein weißer Niederschlag kann die Waschlösung 2/3 bilden. Dies ist überschüssige EDTA, veröffentlicht von der Lösung. Ausarbeitung dieser Kristalle während des Pipettierens Schritte zu vermeiden.

3. führen Sie Reverse Transkription und MiRNA Vorverstärkung (Table of Materials)

1. Polyadenylation Reaktion durchführen
   1. Tauen Sie alle Reagenzien auf dem Eis auf, dann kurz Vortex und Zentrifuge zu drehen den Inhalt nach unten. Darüber hinaus PEG Tauwetter 50 % 8000, so dass sie auf Zimmertemperatur kommen.
   2. Bereiten Sie die Reaktion-Mischung in eine 0,5 mL Zentrifugenröhrchen, einem Endvolumen von 3 µL Reaktion cocktail für jede Probe erhalten. Verwenden Sie die folgenden Bände plus 10 % mehr Volumen für jedes Reagens.
   3. Hinzufügen von 1,7 µL RNase-freies Wasser, 0,5 µL 10 x Poly(A) Puffer, 0,5 µL 10 mM ATP und schließlich 0,3 µL 5 U/µL PolyA Enzym.
   4. Wirbel und Zentrifuge der cocktail Mix zu drehen unten kurz den Inhalt.
   5. 2 µL der Probe in jede Vertiefung der Reaktion Platte oder Reaktionsgefäß übertragen und 3 µL der Reaktion cocktail hinzufügen. Wirbel und Zentrifuge zu drehen unten kurz den Inhalt.
   6. Legen Sie die Platte/Rohre in einem Thermocycler und führen Sie die folgenden Schritte.
   7. Inkubation bei 37 ° C für 45 min. (Polyadenylation Schritt).
   8. Bei 65 ° C für 10 min (Stop-Reaktion), mit einer folgenden Halt bei 4 ° c inkubieren
2. Führen Sie die Ligatur Reaktion.
   1. Bereiten Sie die Reaktion Mischung in ein Zentrifugenröhrchen mit die folgenden Bände für jede Probe und 10 % des Volumens im Übermaß.
   2. Fügen Sie 0.4 µL RNase-freies Wasser, 3 µL 5 x DNA Ligase Puffer, 0,6 µL 25 x Ligatur Adapter, 4,5 µL 50 % PEG 8000 und schließlich 1,5 µL RNA-Ligase.
   3. Wirbel und Zentrifuge der cocktail Mix zu drehen unten kurz den Inhalt.
   4. Jeder Brunnen/Reaktionsgefäß mit dem Poly-Tailing-Produkt fügen Sie 10 µL der Mischung hinzu. Durch eine Platte Shaker bei 1.900 u/min für 1 min oder kurz aufschütteln und Spin-down den Inhalt zu mischen.
   5. Legen Sie die Platte/Reaktionsgefäßen in einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen: Inkubation bei 60 ° C für 60 min, mit einer folgenden halten bei 4 ° C.
      Hinweis: 50 % PEG 8000 ist hochviskos. Verwenden Sie bei Raumtemperatur, Absaugen und langsam dosieren. Nach jedem Anspruch und Dosierschritt halten die Plugger für 10 s, um das Reagenz rauf und runter fließen zu lassen.
3. Führen Sie die reverse Transkription Reaktion.
   1. Bereiten Sie die Reaktion Mischung in ein Zentrifugenröhrchen mit die folgenden Bände für jede Probe und 10 % des Volumens im Übermaß.
   2. 3.3 µL RNase-freies Wasser, 6 µL 5 x RT Puffer, 1,2 µL dNTP-Mix (25 mM), 1,5 µL 20 x Universal RT Primer und schließlich 3 µL 10 x RT-Enzym-Mix hinzufügen.
   3. Wirbel und Zentrifuge der cocktail Mix zu drehen unten kurz den Inhalt.
   4. Jeder Brunnen/Reaktionsgefäß, die Ligatur-Produkt enthält fügen Sie 15 µL der Mischung hinzu. Durch eine Platte Shaker bei 1.900 u/min für 1 min oder kurz aufschütteln und Spin-down den Inhalt zu mischen.
   5. Legen Sie die Platte/Reaktionsgefäßen in einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen.
   6. Inkubieren Sie bei 42 ° C für 15 min (reverse Transkription).
   7. Bei 85 ° C für 5 min (Stop-Reaktion), mit einer folgenden Halt bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: Die RT-Produkt kann jetzt bei-20 ° C gelagert werden und für bis zu 2 Monate stabil bleiben.
4. Führen Sie die MiR-Amp-Reaktion (Table of Materials).
   1. Bereiten Sie die Reaktion Mischung in ein Zentrifugenröhrchen mit die folgenden Bände für jede Probe und 10 % des Volumens im Übermaß.
   2. 17.5 µL RNase-freies Wasser, 25 µL 2 X MiR-Amp-master-Mix und 2,5 µL 20 x MiR-Amp-Grundierung-Mischung hinzufügen.
   3. Wirbel und Zentrifuge der cocktail Mix zu drehen unten kurz den Inhalt.
   4. Übertragen Sie für jede Probe 45 µL der Reaktion Mischung in jede Vertiefung eine neue Reaktion Platte oder einem Reaktionsgefäß Jeder Brunnen oder Reaktion Tube 5 µL RT-Produkt hinzufügen. Durch eine Platte Shaker bei 1.900 u/min für 1 min oder kurz aufschütteln und Spin-down den Inhalt zu mischen.
   5. Legen Sie die Platte/Reaktionsgefäßen in einem Thermocycler und laufen Sie, wie in Tabelle 1dargestellt.

4. führen Sie Real-Time PCR

1. Verdünnen Sie jede cDNA Probe 01:10 in 0,1 X TE-Puffer.
2. Berechnen Sie die Anzahl der Brunnen/Wiederholungen für jede Probe. Bereiten Sie die Reaktion Mischung in ein Zentrifugenröhrchen mit die folgenden Bände für jede Probe, Hinzufügen von 10 % des Volumens im Übermaß.
3. Fügen Sie 4 µL RNase-freies Wasser, 10 µL 2 X schnell erweiterte master-Mix (Table of Materials) und schließlich 5 µL verdünnter cDNA.
4. Durch Vortexen mischen Sie und kurz Zentrifugieren Sie, um den Inhalt zu drehen.
5. 19 µL Reaktion Mischung jeweils gut Dichtplatte und kurz Zentrifugieren zu übertragen.
6. Führen Sie das thermische Protokoll (Tabelle 2) in eine RT-PCR-System.

Ergebnisse

Analysierten wir ein Gremium von Angiogenese-bezogene zirkulierenden MiRNAs in Bezug auf progressionsfreies Überleben (PFS), insgesamt überleben (OS) und objektives Ansprechen (ORR) in einem 52 mCRC behandelt Patienten mit B-basierten CT. Die Bewertung solcher Biomarker in Plasma-Proben ist aus technischen Gründen schwierig. Wir haben bewährte Methoden für MiRNA-Extraktion aus Patienten Plasmaproben, reverse Transkription und Vorverstärkung. Nach den Anweisungen des Herstellers und ...

Diskussion

MiRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs (18-25 Nukleotide in der Länge) in der Lage, verbindliche 3' UTR und Umgebung ihr Ziel Boten-RNA und Hemmung bzw. es erniedrigend. Sie können somit gen Ausdruck Regulierungsbehörden auf der translationalen Ebene betrachtet werden. In den letzten zehn Jahren haben mehrere MiRNAs mit Krebs Initiierung und Entwicklung, so dass sie nützliche klinische Biomarker für die Diagnose, Prognose und Therapie korreliert. Geschützt durch RNases, sind MiRNAs in eine stabile Form in biologi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes