Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per valutare i livelli di espressione di microRNA (Mirna) di circolazione nei campioni del plasma dai malati di cancro. In particolare, abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per estrazione di miRNA e trascrizione d'inversione di circolazione. Infine, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 utilizzando targhe personalizzate in tempo reale sonda pre-maculato.

Abstract

Vi è crescente interesse nella biopsia liquida per cancro diagnosi, prognosi e monitoraggio terapeutico, creando la necessità di biomarcatori affidabili e utili per la pratica clinica. Qui, presentiamo un protocollo per estrarre, reverse trascrivere e valutare i livelli di espressione di Mirna da campioni di plasma di pazienti con cancro colorettale (CRC) di circolazione. i microRNA (Mirna) sono una classe di RNA non codificanti di 18-25 nucleotidi di lunghezza che regolano l'espressione dei geni bersaglio a livello traduzionale e svolgono un ruolo importante, compreso quello della funzione di pro - e anti-angiogenici, nella fisiopatologia delle vari organi. i miRNA sono stabili nei fluidi biologici come siero e plasma, che li rende ideale circolanti biomarcatori per il processo decisionale di diagnosi, prognosi e trattamento di cancro e monitoraggio. Estrazione di miRNA in circolazione è stato effettuato usando un metodo rapido ed efficace che coinvolge metodologie biologiche e basata su colonne. Per retrotrascrizione di miRNA, abbiamo utilizzato una procedura multi-step che considera poliadenilazione al 3' e la legatura di un adattatore a 5' dei miRNA maturi, seguiti pre-dall'amplificazione miRNA casuale. Abbiamo selezionato un pannello personalizzato 24-miRNA per essere testato da reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e macchiato le sonde miRNA su targhe personalizzate matrice. Abbiamo effettuato qRT-PCR piastra viene eseguito su un sistema di PCR in tempo reale. Le pulizie miRNA per normalizzazione sono stati selezionati utilizzando il software GeNorm (v. 3.2). I dati sono stati analizzati utilizzando Expression suite software (v 1.1) e le analisi statistiche sono state eseguite. Il metodo ha dimostrato di essere affidabile e tecnicamente robusto e potrebbe essere utile per valutare i livelli di biomarcatore in campioni liquidi come plasma e/o del siero.

Introduzione

CRC rappresenta il terzo più frequentemente diagnosticata la malignità e la quarta causa di morte per cancro in tutto il mondo. Ad oggi, (B) il bevacizumab, un anticorpo monoclonale diretto contro il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e (C) di cetuximab o panitumumab (P), anticorpi monoclonali diretti contro il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), sono stati approvati per trattamento di prima linea in combinazione con regimi di chemioterapia (CT).

Mutazioni dei geni K-RAS e N-RAS sono i biomarcatori clinicamente utili soli in grado di identificare i pazienti che sono meno probabili trarre giovamento da basati su anti-EGFR CT. Anche se parecchi studi sono stati condotti per la ricerca di biomarcatori che sono predittivi di risposta al CT basato su B, c'è ancora una sostanziale mancanza di farmaci affidabile ed efficace per l'uso nella pratica clinica¹.

i miRNA sono piccole molecole di RNA (18-25 nucleotidi di lunghezza) che regolano la traduzione dei geni bersaglio e svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi fisiopatologici, tra cui l'embriogenesi e carcinogenesi. Queste molecole sono altamente stabili nei liquidi biologici come plasma/siero, urina e dell'espettorato, che li rende robusti biomarcatori da utilizzare per il campionamento non invasivo². Utilizzando un pannello di miRNA coinvolti nel pathway angiogenici, abbiamo mirato a identificare circolanti nuovi biomarcatori in grado di predire il risultato clinico in pazienti con CRC metastatico (mCRC) trattati con un regime di CT basato su B.

Abbiamo analizzato una serie di 52 mCRC pazienti trattati con CT B-base entro il prospettico multicentrico randomizzato di fase III prova "Italiano Trial in Advanced cancro colorettale" (ITACa). Il presente protocollo è stato approvato dal comitato etico locale (Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, n. 674) su 19^th settembre 2007. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato prima di raccolta del campione di sangue. Per ogni paziente, campioni di sangue venosi sono stati raccolti prima del trattamento e alla prima valutazione clinica (dopo 8 settimane) per valutare l'espressione dei miRNA basale e la sua modulazione durante il trattamento in relazione al risultato paziente.

Attraverso una ricerca della letteratura, abbiamo selezionato 21 miRNAs correlato con il processo angiogenetico che sono noti per essere rilevabile nel plasma umano: ha-miR-107, ha-miR-126-3 p, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a - 5p, ha-miR-200b - 3P, ha-miR-20b - 5p , ha-miR-21-5 p, ha-miR-210-3 p, p ha-miR-221-3, ha-miR-24-3 p, p ha-miR-27a - 3P, ha-miR-29b - 3P, ha-miR-335-5, ha-miR-424-5 p, ha-miR-497-5 p, p ha-miR - 520d - 3P, ha-miR-92a - 3P, ha-miR-17-5 e ha-miR-155-5 p. Abbiamo inoltre selezionato ha-miR-223-3 p e ha-mir-484 per normalizzazione endogeno^3,4,5,6e cel-miR-39 purificato dal c. elegans come spike-in per la normalizzazione esogeno. Le normalizzazioni di tutti i dati sono state eseguite utilizzando il metodo di ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

La rilevazione di Mirna in circolazione presenta alcune difficoltà tecniche, perché le molecole sono presenti a livelli molto bassi nel plasma e la loro amplificazione è chimicamente impegnativo dato loro breve sequenza. Per queste ragioni, abbiamo selezionato una procedura che ritiene sia organico estrazione con fenolo e una metodologia basata su colonna di fibra di vetro. Estrazione di miRNA di circolazione è un tema caldo nel campo della biopsia liquida, e abbiamo scelto un kit commerciale che ha dimostrato di essere uno dei più affidabili in termini di quantità e qualità di rendimenti recuperati^7,8. Abbiamo selezionato un protocollo per invertire trascrivere Mirna dall'aggiunta di un adattatore a 5' e una coda di poli (a) a 3' del quieto maturo per migliorare la selettività e specificità della reazione.

Data la robustezza del metodo, abbiamo progettato targhe personalizzate con sonde pre-macchiati per RT-PCR valutare ciascun campione in duplicato e analizzati 2 pazienti all'interno di ogni piatto, come mostrato nella Figura 1.

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Protocollo

Nota: Eseguire tutti i passaggi seguenti sotto una cappa sterilizzati secondo buona pratica di laboratorio (BPL).

1. plasma raccolta e conservazione

1. Raccogliere 3 mL di sangue venoso periferico in un tubo di K3E EDTA.
2. Centrifugare la provetta a temperatura ambiente a 1.880 x g per 15 min.
3. Recuperare il plasma surnatante in aliquote di 450 µ l.
4. Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo.
   Nota: Processo il tubo di sangue periferico entro 2 h dalla raccolta. Quando si ripristina il plasma dal tubo, non disturbano lo strato del linfocita.

2. estrazione di circolazione Mirna da campioni di Plasma (tabella materiali)

1. Preparare tutte le soluzioni necessarie e scongelare i campioni per le operazioni di estrazione.
   1. µ L 375 di 2-mercaptoetanolo per la soluzione di x denaturating 2 e mescolare bene.
   2. Aggiungere 21 mL di etanolo al 100% grado ACS per la soluzione di lavaggio di miRNA io e mescolare bene.
   3. Aggiungere 40 mL di etanolo al 100% grado ACS per la soluzione di lavaggio 2/3 e mescolare bene.
   4. Consentire un plasma aliquota per scongelare a temperatura ambiente e poi iniziare la procedura di estrazione.
2. Estrazione organica
   1. Trasferire 400 µ l di campione di plasma in una provetta da 2 mL RNAsi-libera.
   2. Aggiungere 400 µ l di soluzione di x denaturating 2, mescolare nel vortex e centrifugare brevemente.
   3. Aggiungere 4 µ l di 1 nM picco-in, mescolare nel vortex e centrifugare brevemente.
   4. Aggiungere 800 µ l di acido fenolo-cloroformio.
   5. Vortexare per 60 s e centrifugare a massima velocità (≥ 10, 000 x g) per 15 min.
   6. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta. Non disturbare l'interfase. Nota il volume recuperato e gettare la provetta contenente la fase di non-acquosa.
      Nota: 2x denaturare soluzione è conservato a 4 ° C e può solidificare a questa temperatura. Prima dell'uso, caldo la soluzione a 37 ° C, agitando ogni tanto per 10-15 minuti essere attenti a ritirare la fase inferiore contenente acido fenolo-cloroformio, non il buffer di acquosa che si trova sopra la miscela. Preriscaldare la soluzione per eluizione o nucleasi-free acqua a 95 ° C. Fare attenzione a riscaldare un adeguato volume di soluzione (100 µ l di campione + 10% in eccesso).
3. Arricchimento di piccoli RNA
   1. Aggiungere 1/3 del volume di etanolo al 100% per la fase acquosa dal punto 2.2.6 e mescolare accuratamente.
   2. Inserire una cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca per ogni campione.
   3. Transfer fino a 700 µ l di lisato da passo 2.3.1 ed etanolo nella cartuccia filtrante e centrifugare a 10.000 x g per 30 s.
   4. Se c'è > 700 µ l di miscela di sinistra, mettere il filtrato in una nuova provetta e ripetere il punto 2.3.3; Ripetere fino a quando tutto il composto è passato attraverso la cartuccia del filtro.
   5. Misurare il volume totale di flusso continuo.
   6. Aggiungere 2/3 del volume di etanolo al 100% del filtrato e mescolare accuratamente.
   7. Collocare una seconda cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca.
   8. Trasferimento fino a 700 µ l di volume di campione nella cartuccia e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. scartare il flusso continuo.
   9. Ripetere il passaggio 2.3.8 fino a quando tutto il composto è passato attraverso la cartuccia del filtro.
   10. Applicare 700 µ l di soluzione di lavaggio miRNA 1 la cartuccia filtrante e centrifugare la cartuccia del filtro con il tubo di raccolta a 10.000 x g per 15 s. scartare il flusso continuo. Posizionare la cartuccia di filtro nello stesso tubo di raccolta.
   11. Applicare 500 µ l di soluzione di lavaggio 2/3 per la cartuccia del filtro e la centrifuga la cartuccia del filtro con il tubo di raccolta a 10.000 x g per 15 s. scartare il flusso continuo. Collocare la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca.
   12. Collocare la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca e ripetere il passaggio 2.3.11 con 500 µ l di soluzione di lavaggio 2/3. Scartare il flusso continuo e trasferire la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca.
   13. Centrifugare le provette con le cartucce di filtro a 10.000 x g per 1 min.
   14. Trasferire la cartuccia di filtro in una provetta di raccolta fresca 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di soluzione per eluizione preriscaldato (95 ° C) o acqua priva di nucleasi.
   15. Centrifuga a 10.000 x g per 30 s di Mirna di recuperare e conservare a-80 ° C.
       Nota: Nella soluzione di lavaggio 2/3 può formarsi un precipitato bianco. Si tratta di EDTA in eccesso rilasciato dalla soluzione. Evitare l'elaborazione di questi cristalli durante le fasi di pipettaggio.

3. eseguire la trascrizione inversa e miRNA pre-amplificazione (tabella materiali)

1. Eseguire la reazione di poliadenilazione
   1. Scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio, poi brevemente vortex e centrifugare a girare giù il contenuto. Inoltre, disgelo 50% PEG 8000, permettendogli di raggiungere la temperatura ambiente.
   2. Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga da 0,5 mL, ottenendo un volume finale di 3 µ l di reazione cocktail per ogni campione. Utilizzare i seguenti volumi, più 10% di volume in eccesso per ciascun reagente.
   3. Aggiungere 1,7 µ l di acqua RNAsi-libera, 0,5 µ l di tampone di poli (a) 10x, 0,5 µ l di 10 mM ATP e infine 0,3 µ l 5 U / µ l PolyA enzima.
   4. Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
   5. Trasferimento 2 µ l di campione in ciascun pozzetto della piastra di reazione o del tubo di reazione e aggiungere 3 µ l del cocktail. Brevemente vortex e centrifugare a girare giù il contenuto.
   6. Posizionare il piastra/tubi in un termociclatore e procedere come segue.
   7. Incubare a 37 ° C per 45 min (poliadenilazione passo).
   8. Incubare a 65 ° C per 10 minuti (fermata reazione), con una stretta seguente a 4 ° C.
2. Eseguire la reazione di legatura.
   1. Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga con i seguenti volumi per ogni campione e il 10% del volume in eccesso.
   2. Aggiungere 0,4 µ l di acqua RNAsi-libera, 3 µ l di DNA ligasi buffer, 0,6 µ l di 25 x adattatore di legatura, 4,5 µ l del 50%: 5x PEG 8000 e infine 1,5 µ l della ligasi di RNA.
   3. Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
   4. Aggiungere 10 µ l della miscela per ogni tubo pozzo/reazione contenente il prodotto di coda di poli (a). Mescolare un agitatore per piastre a 1.900 giri/min per 1 min o brevemente su vortex e centrifugare il contenuto.
   5. Posizionare i tubi piastra/reazione in un termociclatore con le seguenti impostazioni: incubazione a 60 ° C per 60 min, con un seguito tenere a 4 ° C.
      Nota: 50% PEG 8000 è molto viscoso. Utilizzare a temperatura ambiente, aspirazione e il dosaggio lentamente. Dopo ogni aspirazione e passaggio di erogazione, tenere premuto l'otturatore per 10 s per consentire il reagente a scorrere su e giù.
3. Eseguire la reazione di trascrizione inversa.
   1. Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga, con i seguenti volumi per ogni campione e il 10% del volume in eccesso.
   2. 3,3 µ l di acqua RNAsi-libera, 6 µ l di 5 x RT buffer, 1,2 µ l di miscela del dNTP (25 mM), 1,5 µ l di primer universali RT: 20x e infine 3 µ l di miscela di enzima RT: 10x.
   3. Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
   4. Aggiungere 15 µ l della miscela a ciascuna provetta di pozzo/reazione contenente il prodotto di legatura. Mescolare un agitatore per piastre a 1.900 giri/min per 1 min o brevemente su vortex e centrifugare il contenuto.
   5. Posizionare i tubi piastra/reazione in un termociclatore con le seguenti impostazioni.
   6. Incubare a 42 ° C per 15 min (trascrizione inversa).
   7. Incubare a 85 ° C per 5 minuti (fermata reazione), con una stretta seguente a 4 ° C.
      Nota: Il prodotto di RT ora possa essere conservato a-20 ° C e rimarrà stabile fino a 2 mesi.
4. Eseguire la reazione di miR-Amp (tabella materiali).
   1. Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga con i seguenti volumi per ogni campione e il 10% del volume in eccesso.
   2. Aggiungere 25 µ l di mix master miR-Amp 2 x 17,5 µ l di acqua RNAsi-libera e 2,5 µ l di miscela di primer miR-Amp: 20x.
   3. Brevemente vortex e centrifugare il mix cocktail a girare giù il contenuto.
   4. Per ogni campione, trasferire 45 µ l di miscela di reazione in ciascun pozzetto di una piastra di reazione o di un tubo di reazione. Aggiungere 5 µ l del prodotto RT a ciascuna provetta di reazione o bene. Mescolare un agitatore per piastre a 1.900 giri/min per 1 min o brevemente su vortex e centrifugare il contenuto.
   5. Inserire le provette di reazione/piastra in un termociclatore ed eseguire come indicato nella tabella 1.

4. eseguire la PCR in tempo reale

1. Diluire ogni cDNA campione 01:10 in buffer di 0.1 x TE.
2. Calcolare il numero di pozzetti/replicati per ciascun campione. Preparare la miscela di reazione in una provetta da centrifuga con i seguenti volumi per ciascun campione, l'aggiunta di 10% del volume in eccesso.
3. Aggiungere 4 µ l di acqua RNAsi-libera, 10 µ l di 2 mix avanzato master x veloce (Tabella materiali) e infine 5 µ l di cDNA diluito.
4. Mescolare nel vortex e centrifugare brevemente per rallentare il contenuto.
5. Trasferire 19 µ l di miscela di reazione per ciascun pozzetto, sigillare la piastra e centrifugare brevemente.
6. Eseguire il protocollo termico (tabella 2) su un sistema di RT-PCR.

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Risultati

Abbiamo analizzato un panel di Mirna circolanti angiogenesi-correlate in relazione alla sopravvivenza libera da progressione (PFS), il tasso globale del sopravvivenza (OS) e risposta obiettiva (ORR) in un mCRC 52 pazienti trattati con B-base CT. La valutazione di tali biomarcatori in campioni di plasma è impegnativa a causa di difficoltà tecniche. Abbiamo utilizzato metodi consolidati per l'estrazione di miRNA da campioni di plasma paziente, trascrizione d'inversione e pre-amplificazion...

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Discussione

i miRNA sono piccoli non-codificazione RNAs (18-25 nucleotidi di lunghezza) in grado di associazione regione 3' UTR del loro obiettivo di RNA messaggero e d'inibizione e/o degradanti si. Possono quindi essere considerati regolatori di espressione genica a livello traduzionale. Nell'ultimo decennio, diversi miRNA sono stati correlati con l'inizio del cancro e lo sviluppo, che li rende utile clinici biomarcatori per la diagnosi, prognosi e terapia. Protetto da RNasi, Mirna sono presenti in una forma stabile nei liquidi bio...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes