Обнаружение циркулирующего микроРНК пользовательские группы больных с метастатическим колоректальным раком

Резюме

Мы представляем протокол для оценки выражения уровня циркулирующих микроРНК (интерферирующим) в образцах плазмы от больных раком. В частности мы использовали коммерчески доступных комплект для распространения Мирна извлечения и обратной транскрипции. Наконец мы проанализировали Группа 24 отдельных адаптивной, с использованием реального времени предварительно пятнистый зонд пользовательских пластины.

Аннотация

Растет интерес к жидким биопсии для диагностики рака, прогноз и терапевтического мониторинга, создание потребность в надежной и полезной биомаркеров для клинической практики. Здесь мы представляем протокол для извлечения, реверс транскрибировать и оценить выражение уровня циркулирующих интерферирующим из плазмы образцы больных колоректальный рак (CRC). микроРНК (интерферирующим) являются класс некодирующих RNAs 18-25 нуклеотидов в длину, которые регулируют выражение генов-мишеней на уровне поступательные и играют важную роль, включая про - и анти ангиогенных функции, в предлежания из различные органы. интерферирующим являются стабильными в биологических жидкостях, например сыворотки и плазмы, которая делает их идеальным циркулирующих биомаркеров для рака, диагноз, прогноз и лечение решений и мониторинга. Циркулирующих Мирна извлечения проводилось с использованием быстрый и эффективный метод, который включает в себя как органических, так и на основе столбцов методологий. Для retrotranscription miRNA мы использовали многоступенчатый процедуру, которая считает сплайсингу на 3' и перешнуровка переходник на 5' Пожилая адаптивной, следуют случайных Мирна предварительного усиления. Мы выбрали пользовательскую панель 24-miRNA проверяемый количественных реального времени полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) и заметили Мирна зонды на массив пользовательских пластины. Мы исполняли qRT ПЦР плита работает на систему ПЦР в реальном времени. Уборка интерферирующим для нормализации были отобраны с использованием программного обеспечения GeNorm (v. 3.2). Данные были проанализированы с помощью выражения suite программного обеспечения (v 1.1) и статистические анализы. Метод оказался надежным и технически надежной и может быть полезным для оценки уровней биомаркеров в жидких проб например плазме или сыворотке.

Введение

КПР является третьим наиболее часто диагноз злокачественных и четвертой причиной связанных с раком смерти во всем мире. На сегодняшний день, Бевацизумаб (B), моноклональные антитела, направленные против Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и cetuximab (C) или Панитумумаб (P), моноклональные антитела, направленные против рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), были одобрены для первой линии лечения в сочетании с схем химиотерапии (CT).

Мутации в генах K-RAS и N-РАН являются только клинически полезным биомаркеров, способных определять пациентов, которые наименее вероятно, воспользоваться на основе анти EGFR CT. Хотя было проведено несколько исследований для поиска биомаркеров, которые прогнозирования ответа на основе B CT, по-прежнему сохраняется существенный недостаток надежных и эффективных препаратов для использования в клинической практике¹.

интерферирующим являются малые РНК (18-25 нуклеотидов в длину), которые регулируют перевод генов-мишеней и играть решающую роль в многочисленных процессах выкидышей, включая эмбриогенеза и канцерогенеза. Эти молекулы являются весьма стабильными в биологических жидкостях, например сыворотки/плазмы, мочи и мокроты, который делает их надежной биомаркеров для неинвазивной выборки². С помощью панели интерферирующим участвующих в ангиогенных пути, мы стремились выявить новые циркулирующих биомаркеров, способных предсказать клинических исходов у больных с метастатическим CRC (mCRC) относились с режима на основе B CT.

Мы проанализировали серии 52 mCRC пациентов с B-основе КТ в пределах потенциальных многоцентрового рандомизированного Фаза III пробную» итальянского суда в расширенный колоректального рака» (ITACa). Настоящий Протокол был одобрен Комитетом по этике местных (Comitato Etico области Васта e Istituto Scientifico романьольское за Ло студия e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, № 674) на 19^й сентября 2007. Все пациенты дал осознанного согласия до взятия пробы крови. Для каждого пациента были собраны пробы венозной крови до начала лечения и в первой клинической оценки (после 8 недель) для оценки базовых Мирна выражение и его модуляции во время лечения в отношении пациентов результат.

Через поиск литературы, мы выбрали 21 интерферирующим коррелирует с процессом ангиогенных, которые известны как обнаружить в плазме крови человека: имеет мир-107, имеет мир-126-3 p, имеет мир-145-5 p, имеет мир-194-5 p, имеет мир 199a - 5p, имеет мир 200b - 3p, имеет мир 20b - 5p , имеет мир-21-5 p, имеет мир-210-3 p, имеет мир-221-3 p, имеет мир-24-3 p, имеет мир 27А - 3p, имеет мир 29В - 3p, имеет мир-335-5 p, имеет мир-424-5 p, p имеет мир-497-5, имеет мир - 520d - 3p, имеет мир 92a - 3p, имеет мир-17-5 p и имеет мир-155-5 p. Мы также выбрали имеет мир-223-3 p и имеет мир-484 для эндогенного нормализации^3,4,5,6и чел мир-39 очищенного от C. elegans как Спайк в экзогенных нормализации. Все данные нормировок были проведены с использованием метода ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

Выявление циркулирующих интерферирующим представляет некоторые технические трудности, поскольку молекулы присутствуют на очень низком уровне в плазме и их усиления химически сложной, учитывая их короткую последовательность. По этим причинам мы выбрали процедура, которая считает органической экстракции с фенолом и стекло волокна методологии на основе столбцов. Циркулирующих Мирна добыча является горячей темой в области жидкого биопсии, и мы выбрали показали, чтобы быть одним из самых надежных коммерческих комплект с точки зрения количества и качества восстановленных урожайности^7,8. Мы выбрали протокол обратить вспять транскрибировать интерферирующим путем добавления адаптера на 5' и poly(A) хвост к 3' Зрелые Мирна повышения селективности и специфичность реакции.

С учетом надежности метода, мы разработаны пользовательские пластины с предварительно пятнистый зонды для RT-PCR для оценки каждого образца в двух экземплярах и проанализированы 2 больных в пределах каждой пластины, как показано на рисунке 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Выполните все следующие шаги под стерилизованные Зонта согласно надлежащей лабораторной практики (НЛП).

1. плазмы сбор и хранение

1. Соберите 3 мл периферической крови в K3E ЭДТА трубы.
2. Центрифуга трубки при комнатной температуре в 1880 x g за 15 мин.
3. Восстановите супернатанта плазмы в аликвоты 450 мкл.
4. Хранение образцов-80 ° C до использования.
   Примечание: Процесс периферической крови трубки в течение 2 ч коллекции. При восстановлении плазмы из трубки, не беспокоить уровень лимфоцитов.

2. Добыча циркулирующих интерферирующим от образцов плазмы (таблица материалов)

1. Подготовить все необходимые решения и оттаивания образцов для извлечения шагов.
   1. 375 мкл 2-меркаптоэтанол в 2 x denaturating решение и хорошо перемешать.
   2. Добавьте 21 мл ACS класс 100% этанола в Мирна промывочный раствор я и перемешать хорошо.
   3. Добавить 40 мл ACS класс 100% этанола в Вымойте решения 2/3 и хорошо перемешать.
   4. Разрешить плазмы аликвота разморозить при комнатной температуре и затем начать добычу шаги.
2. Органические извлечения
   1. Перевести 400 мкл плазмы образца в 2-мл пробирку, RNase бесплатно.
   2. 400 мкл раствора 2 x denaturating, смесь vortexing и кратко центрифуги.
   3. Мкл 4 Спайк в-1 Нм, смешивать, vortexing и кратко центрифуги.
   4. 800 мкл кислоты фенол хлороформ.
   5. Вортекс для 60 s и центрифуги на максимальной скорости (≥10, 000 x g) за 15 мин.
   6. Передать свежие трубки верхняя водной фазе. Не беспокоить интерфазе. Обратите внимание, объем восстановленные и отбросить трубка, содержащая этапа не acqueous.
      Примечание: 2 x денатурации раствора хранится при температуре 4 ° C и может укрепить при этой температуре. Перед использованием теплый решение до 37 ° C, агитирующие иногда на 10-15 мин будьте осторожны вывести нижней фазе, содержащие кислоты фенол хлороформ, не acqueous буфер, который лежит на вершине смеси. Разогрейте Элюирующий раствор или нуклеиназы свободной воды до 95 ° C. Будьте осторожны, чтобы нагреть адекватного объема раствора (100 мкл пример + 10% избыток).
3. Малых РНК обогащения
   1. Добавить 1/3 объема 100% этанола в водной фазе шага 2.2.6 и тщательно перемешать.
   2. Поместите картридж фильтра в трубу свежие коллекции для каждого образца.
   3. Передача до 700 мкл lysate от шаг 2.3.1 и этанола в картридж фильтра и центрифуги на 10000 x g 30 s.
   4. Если есть > 700 мкл смеси слева, фильтрат в трубу свежие и повторите шаг 2.3.3; Повторяйте, пока все смеси прошло через картридж фильтра.
   5. Измерьте общий объем потока через.
   6. Добавьте 2/3 объема 100% этанола фильтрата и тщательно перемешать.
   7. Место второй картриджа фильтра в трубке свежие коллекции.
   8. Передача до 700 мкл пример тома в патрон и центрифуги на 10000 x g для 30 s. отклонения потока через.
   9. Повторите шаг 2.3.8 до тех пор, пока все смеси прошло через картридж фильтра.
   10. Применить 700 мкл Мирна промывочного раствора 1 картридж фильтра и центрифуги картриджа фильтра с коллекции трубки на 10000 x g для 15 s. отклонения потока через. Поместите картридж фильтра в же коллекции трубки.
   11. Применить 500 мкл Вымойте решения 2/3 картриджа фильтра и центрифуги картриджа фильтра с коллекции трубки на 10000 x g для 15 s. отмены потока через. Поместите картридж фильтра в трубу свежие коллекции.
   12. Поместите фильтр-картридж в трубке свежие коллекции и повторите шаг 2.3.11 с 500 мкл Вымойте решения 2/3. Отказаться от потока через и передать трубку свежие коллекции картриджа фильтра.
   13. Центрифуга трубки с Фильтр картриджи на 10000 x g за 1 мин.
   14. Передача картриджа фильтра в коллекции свежие 1,5 мл трубку и 100 мкл разогретой (95 ° C) Элюирующий раствор или воды, свободной от нуклеиназы.
   15. Центрифуга на 10000 x g для 30 s, чтобы восстановить адаптивной и хранить при температуре-80 ° C.
       Примечание: Белый преципитат могут образовывать в Вымойте решения 2/3. Это избыток ЭДТА, выпустили из решения. Избегайте составления этих кристаллов во время дозирования шаги.

3. выполнение обратной транскрипции и Мирна предварительного усиления (таблица материалов)

1. Выполнять сплайсингу реакции
   1. Оттепель все реагенты на льду, а затем кратко вихря и центрифуги крутиться вниз содержимое. Кроме того оттепель 50% КОЛЫШЕК 8000, позволяя ему достичь комнатной температуры.
   2. Подготовьте смесь реакции в 0,5 мл пластиковых пробирок, получение окончательный объем 3 мкл реакции коктейль для каждого образца. Используйте следующие тома, плюс 10% избыток объем для каждого реагента.
   3. Добавить 1.7 мкл РНКазы свободной воды, 0,5 мкл 10 x буфер Poly(A), 0.5 мкл 10 мм АТФ и наконец 0,3 мкл 5 U/мкл поля фермента.
   4. Кратко вихря и центрифуги коктейль смесь спин вниз содержимое.
   5. Передача 2 мкл пример для каждой скважины пластина реакции или реакции трубки и 3 мкл реакции коктейль. Кратко вихря и центрифуги крутиться вниз содержимое.
   6. Поместите пластины/трубы в тепловая велосипедист и выполните следующие действия.
   7. Инкубируйте при 37 ° C 45 мин (сплайсингу шаг).
   8. Инкубируйте на 65 ° C для 10 минут (остановка реакции), с следующих провести при 4 ° C.
2. Выполните реакции перешнуровки.
   1. Подготовьте смесь реакции в пластиковых пробирок с следующих томов для каждого образца и 10% от объема в избытке.
   2. Добавить 0.4 мкл РНКазы свободной воды, 3 мкл 5 x ДНК лигаза буфера, 0,6 мкл 25 x перешнуровка переходник, 4.5 мкл 50% PEG 8000 и наконец 1.5 мкл лигаза РНК.
   3. Кратко вихря и центрифуги коктейль смесь спин вниз содержимое.
   4. 10 мкл смеси, для каждой скважины/реакции трубка, содержащая poly(A) хвостохранилище продукта. Смешайте шейкер пластины при 1900 об/мин за 1 мин или кратко vortexing и спин вниз содержимое.
   5. Поместите пластины/реакции трубы в тепловая велосипедист со следующими параметрами: инкубации при 60 ° C 60 мин, с последующим провести на 4 ° C.
      Примечание: 50% PEG 8000 вязкие. Использовать при комнатной температуре, аспирационных и дозирования медленно. После каждого аспирации и дозирования шаг, удерживайте штопфер для 10 s чтобы позволить реагент течь вверх и вниз.
3. Выполните реакция обратной транскрипции.
   1. Подготовьте смесь реакции в пластиковых пробирок с следующих томов для каждого образца и 10% от объема в избытке.
   2. 3.3 мкл РНКазы свободной воды, 6 мкл 5 x RT буфера, 1.2 мкл dNTP смеси (по 25 мм), 1,5 мкл 20 x Грунтовки универсальные RT и наконец 3 мкл 10 x RT фермент смесь.
   3. Кратко вихря и центрифуги коктейль смесь спин вниз содержимое.
   4. Мкл 15 смеси для каждой скважины/реакции трубка, содержащая продукт перешнуровки. Смешайте шейкер пластины при 1900 об/мин за 1 мин или кратко vortexing и спин вниз содержимое.
   5. Поместите пластины/реакции трубы в тепловая велосипедист со следующими параметрами.
   6. Инкубируйте на 42 ° C 15 мин (обратная транскрипция).
   7. Инкубируйте на 85 ° C за 5 минут (остановка реакции), с следующих провести при 4 ° C.
      Примечание: RT продукт теперь могут храниться при температуре-20 ° C и будет оставаться стабильным на срок до 2 месяцев.
4. Выполните мир Amp реакции (таблица материалов).
   1. Подготовьте смесь реакции в пластиковых пробирок с следующих томов для каждого образца и 10% от объема в избытке.
   2. Добавление 17,5 мкл РНКазы свободной воды, 25 мкл микс Мастер мир Amp 2 x и 2,5 мкл 20 x мир Amp грунтовка микс.
   3. Кратко вихря и центрифуги коктейль смесь спин вниз содержимое.
   4. Для каждого образца передачи 45 мкл реакция смеси для каждой скважины Новая пластина реакции или реакции трубки. 5 мкл RT продукта, для каждой скважины или реакции трубки. Смешайте шейкер пластины при 1900 об/мин за 1 мин или кратко vortexing и спин вниз содержимое.
   5. Плиты/реакции трубы в тепловая велосипедист и запустить, как показано в таблице 1.

4. выполнять ПЦР в реальном времени

1. Разбавьте 1:10 образцов каждого cDNA 0.1 x TE буфера.
2. Рассчитайте количество скважин/репликация для каждого образца. Подготовьте смесь реакции в пластиковых пробирок с следующих томов для каждого образца, добавляя 10% от объема в избытке.
3. Добавьте 4 мкл РНКазы свободной воды, 10 мкл 2 x быстрый расширенный мастер смеси (Таблица материалов) и наконец 5 мкл разбавленного cDNA.
4. Смесь vortexing и кратко центрифуга крутиться вниз содержимое.
5. Передача 19 мкл реакция смеси каждый хорошо, печать пластину и кратко центрифуги.
6. Выполните тепловой протокол (Таблица 2) на систему RT-PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы проанализировали группу связанных с ангиогенеза циркулирующего интерферирующим относительно выживаемости без прогрессирования (PFS), общего выживания (ОС) и объективный ответ ставка (ОРР) в 52 mCRC, которую пациентов с B-основе CT. Оценка таких биомаркеров в образцах пла?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

интерферирующим малы некодирующих РНК (18-25 нуклеотидов в длину) способны привязки 3' УТР регионе их целевого РНК и ингибирования и/или унижающего его достоинство. Таким образом они могут рассматриваться в регуляторы выражения гена на уровне поступательное. В течение последнего десятил?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes