Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

Resumo

Apresentamos um protocolo para avaliar os níveis de expressão de microRNA (miRNAs) em circulação em amostras de plasma de pacientes com câncer. Em particular, usamos um kit comercialmente disponível para circulação miRNA extração e transcrição reversa. Finalmente, analisamos um painel de 24 miRNAs selecionados usando placas personalizadas em tempo real sonda pre-manchado.

Resumo

Existe uma crescente interesse na biópsia líquida para câncer diagnóstico, prognóstico e monitorização terapêutica, criando a necessidade de biomarcadores confiáveis e úteis para a prática clínica. Aqui, apresentamos um protocolo para extrair, reverso transcrever e avaliar os níveis de expressão de miRNAs de amostras de plasma de pacientes com câncer colorretal (CRC) em circulação. microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNA não-codificante de 18-25 nucleotides no comprimento que regulam a expressão de genes-alvo a nível translacional e desempenham um papel importante, incluindo o da função de pro - e antiangiogênico, na fisiopatologia da vários órgãos. os miRNAs são estáveis em fluidos biológicos, tais como soro e plasma, que processa-los ideal circulando biomarcadores para tomada de decisão diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer e monitoramento. Extração de miRNA de circulação foi realizada usando um método rápido e eficaz que envolve metodologias orgânicas e baseados em colunas. Para miRNA retrotranscription, foi utilizado um processo de várias etapa que considera poliadenilação 3' e a ligadura de um adaptador em 5' dos miRNAs maduros, seguidos de Pre-amplificação aleatória miRNA. Selecionamos um painel personalizado 24-miRNA para ser testado por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) e avistou as sondas de miRNA em placas personalizadas de matriz. Realizamos qRT-PCR placa é executado em um sistema de PCR em tempo real. Os miRNAs limpeza para normalização foram selecionados usando o software GeNorm (v. 3.2). Os dados foram analisados utilizando o software suite de expressão (v 1.1) e análises estatísticas foram realizadas. O método mostrou-se tecnicamente robusto e confiável e pode ser útil para avaliar os níveis de biomarcador em amostras líquidas, tais como o plasma ou soro.

Introdução

CRC representa o terceiro mais frequentemente diagnosticado malignidade e a quarta causa de morte relacionada com câncer em todo o mundo. Até à data, bevacizumab (B), um anticorpo monoclonal dirigido contra o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e cetuximab (C) ou panitumumab (P), anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), foram aprovados para tratamento de primeira linha, em combinação com regimes de quimioterapia (CT).

Mutações nos genes K-RAS e N-RAS são os biomarcadores clinicamente útil única capazes de identificar os pacientes que são menos susceptíveis de beneficiar de anti EGFR-baseado em CT. Embora vários estudos têm sido conduzidos para procurar biomarcadores que são preditivos da resposta ao CT B-baseado, há ainda uma falta substancial de drogas confiáveis e eficazes para a prática clínica¹.

os miRNAs são pequenos RNAs (18-25 nucleotides no comprimento) que regulamentam a tradução de genes-alvo e desempenham um papel crucial em inúmeros processos fisiopatológicos, incluindo embriogénese e carcinogénese. Estas moléculas são altamente estáveis em fluidos biológicos como plasma/soro, urina e escarro, que processa-los robustos biomarcadores para usar para a amostragem não-invasivo². Usando um painel de miRNAs envolvidos na via angiogênico, tivemos como objetivo identificar circulando nova biomarcadores capazes de prever resultados clínicos em pacientes com metástase CRC (mCRC) tratados com um regime de CT B-baseado.

Analisamos uma série de 52 mCRC pacientes tratados com CT B-baseado dentro o multicêntrico prospectivo randomizado de fase III trial "italiano experimental em avançado câncer colorretal" (ITACa). O presente protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética Local (Comitato Etico área Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo por lo dei Tumori (IRST) IRCCS, n. º 674 Cura la do e Studio) em 19^th de setembro de 2007. Todos os pacientes deram consentimento informado antes da coleta de amostra de sangue. Para cada paciente, amostras de sangue venoso foram coletadas antes do tratamento e na primeira avaliação clínica (após 8 semanas) para avaliar a expressão de miRNA de linha de base e sua modulação durante o tratamento em relação ao resultado do paciente.

Através de uma pesquisa da literatura, nós selecionamos 21 miRNAs correlacionados com o processo angiogênico que são conhecidos por serem detectáveis no plasma humano: p tem-miR-107, tem-miR-126-3, tem-miR-145-5 p, tem-miR-194-5 p, tem-miR-199a - 5p, tem-miR-200b - 3P, tem-miR-20b - 5P , tem-miR-21-5 p, tem-miR-210-3 p, tem-miR-221-3 p, tem-miR-24-3-p, tem-miR-27a - 3P, tem-miR-29oB - 3P, tem-miR-335-5 p, tem-miR-424-5 p, tem-miR-497-5 p, p tem-miR - 520d - 3P, tem-miR-92a - 3P, tem-miR-17-5 e tem-miR-155-5 p. Também selecionamos tem-miR-223-3 p... e tem-mir-484 para normalização endógena^3,4,5,6e cel-miR-39 purificado de c. elegans como pico de normalização exógenos. Todas as normalizações de dados foram realizadas usando o método de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

A detecção de circulação miRNAs apresenta algumas dificuldades técnicas, porque as moléculas estão presentes em níveis muito baixos no plasma e sua amplificação é quimicamente um desafio, dada sua pequena sequência. Por estas razões, nós selecionamos um procedimento que considera tanto orgânica extração com fenol e uma metodologia baseada em coluna de fibra de vidro. MiRNA extração de circulação é um tema quente no campo da biópsia líquida, e nós selecionamos um kit comercial que tem demonstrado ser um dos mais confiável em termos de quantidade e qualidade dos rendimentos recuperado^7,8. Nós selecionamos um protocolo para reverter transcrever os miRNAs pela adição de um adaptador em 5' e uma cauda poli a 3' da miRNA maduro para melhorar a seletividade e especificidade da reação.

Dada a robustez do método, projetamos placas personalizadas com sondas pre-manchadas por RT-PCR avaliar cada amostra em duplicado e analisados 2 pacientes em cada prato, como mostrado na Figura 1.

Protocolo

Nota: Execute todas as etapas seguintes sob uma coifa esterilizados de acordo com boas práticas de laboratório (BPL).

1. armazenamento e coleta de plasma

1. Colete 3 mL de amostra de sangue periférico em um tubo de EDTA K3E.
2. Centrifugar o tubo à temperatura ambiente a 1.880 x g durante 15 min.
3. Recupere o plasma sobrenadante em alíquotas de 450 µ l.
4. Armazene as amostras a-80 ° C até o uso.
   Nota: Processo de tubo até 2 horas após a coleta de sangue periférico. Quando recuperar o plasma do tubo, não perturbe a camada de linfócitos.

2. extração de circulantes miRNAs de amostras de Plasma (tabela de materiais)

1. Preparar todas as soluções necessárias e descongelar as amostras para as etapas de extração.
   1. Adicionar a solução de x denaturating a 2 µ l 375 de 2-Mercaptoetanol e misture bem.
   2. Adicione 21 mL de etanol de 100% de grau de ACS para a solução de lavagem de miRNA eu e misture bem.
   3. Adicionar 40 mL de etanol de 100% de grau de ACS para a solução de lavagem de 2/3 e misture bem.
   4. Permitir que um plasma alíquota para descongelar à temperatura ambiente e então começar as etapas de extração.
2. Extração orgânica
   1. Transferência de 400 µ l da amostra de plasma em um tubo de 2 mL RNase-livre.
   2. Adicione 400 µ l de solução de x denaturating 2, misture vortexing e brevemente centrifugar.
   3. Adicione 4 µ l de 1 nM pico-no, misturar vortexing e brevemente centrifugar.
   4. Adicione 800 µ l de ácido fenol-clorofórmio.
   5. Vórtice para 60 s e centrifugar a máxima velocidade (≥ 10 000 x g) por 15 min.
   6. Transferi a fase aquosa superior para um tubo de fresco. Não perturbe a interfase. Nota o volume recuperado e descartar o tubo contendo a fase não-aquosas.
      Nota: O 2 x solução de desnaturação é armazenado em 4 ° C e pode solidificar a esta temperatura. Antes da utilização, quente a solução a 37 ° C, agitando ocasionalmente durante 10-15 min. cuidado ao retirar a fase inferior contendo o ácido fenol-clorofórmio, não o buffer aquosas que se encontra no topo da mistura. Pré-aqueça a solução de eluição ou água livre nuclease para 95 ° C. Tenha cuidado para aquecer um volume adequado de solução (100 µ l por exemplo + 10% de excesso).
3. Enriquecimento de RNA pequeno
   1. Adicione 1/3 volume de etanol 100% para a fase aquosa da etapa 2.2.6 e misture bem.
   2. Coloque um cartucho de filtro num tubo de colheita fresca para cada amostra.
   3. Transferir até 700 µ l de lisado de passo 2.3.1 e etanol para o refil do filtro e centrifugar 10.000 x g por 30 s.
   4. Se houver > 700 µ l da mistura à esquerda, coloque o filtrado em um tubo de fresco e repita a etapa 2.3.3; Repita até que toda a mistura passou através do cartucho do filtro.
   5. Medir o volume total da passagem.
   6. Adicione 2/3 volume de etanol 100% filtrado e misture bem.
   7. Coloque um segundo cartucho de filtro em um tubo de coleção fresca.
   8. Transferir até 700 µ l volume de amostra para o cartucho e centrifugar a 10.000 x g durante 30 s. descarte o escoamento.
   9. Repita a etapa 2.3.8 até toda a mistura tenha passado através do cartucho do filtro.
   10. Aplicar 700 µ l da solução de lavagem de miRNA 1 refil do filtro e centrifugar o refil do filtro com o tubo de coleta a 10.000 x g durante 15 s. descarte o escoamento. Coloque o cartucho de filtro no tubo da mesma coleção.
   11. Aplica 500 µ l de solução de lavagem de 2/3 para o refil do filtro e centrifugar o refil do filtro com o tubo de coleta a 10.000 x g por 15 s. descarte o escoamento. Coloque o cartucho de filtro em um tubo de coleção fresca.
   12. Coloque o cartucho de filtro no tubo coleção fresca e repita a etapa 2.3.11 com 500 µ l da solução de lavagem 2/3. Descartar o escoamento e transfira o refil do filtro para um tubo de coleção fresca.
   13. Centrifuga os tubos com os cartuchos de filtro a 10.000 x g por 1 min.
   14. Transferir o refil do filtro para um tubo de coleta de 1,5 mL e adicionar 100 µ l de solução de eluição pré-aquecido (95 ° C), ou água livre de nuclease.
   15. Centrifugar a 10.000 x g por 30 s para recuperar os miRNAs e armazenar a-80 ° C.
       Nota: Um precipitado branco pode formar na solução de lavagem de 2/3. Este é o EDTA em excesso, lançado a partir da solução. Evite elaborar estes cristais durante as etapas de pipetagem.

3. executar a transcrição reversa e miRNA pré-amplificação (tabela de materiais)

1. Realizar a reação de poliadenilação
   1. Descongele todos os reagentes no gelo, em seguida, brevemente vórtice e centrifugar a girar para baixo o conteúdo. Além disso, o degelo 50% PEG 8000, permitindo-lhe atingir a temperatura.
   2. Prepare a mistura de reação em um tubo de centrífuga de 0,5 mL, obtendo um volume final de 3 µ l de reação cocktail para cada amostra. Use os seguintes volumes, mais volume em excesso de 10% para cada reagente.
   3. Adicionar 1,7 µ l de água livre de RNase, 0,5 µ l de 10x buffer de poli, 0,5 µ l de 10mm ATP e finalmente 0,3 µ l 5 U / µ l PolyA enzima.
   4. Brevemente, vórtice e centrifugar a cocktail mistura a girar para baixo o conteúdo.
   5. Transferência de 2 µ l da amostra para cada poço da placa de reação ou tubo de reação e adicione 3 µ l da reação de cocktail. Brevemente, vórtice e centrifugar a girar para baixo o conteúdo.
   6. Coloque os prato/tubos em um termociclador e execute as seguintes etapas.
   7. Incube a 37 ° C, durante 45 min (poliadenilação passo).
   8. Incubar a 65 ° C por 10 min (reação de parada), com uma espera seguir a 4 ° C.
2. Realize a reação da ligadura.
   1. Prepare a mistura de reação num tubo de centrífuga com os seguintes volumes para cada amostra e 10% do volume em excesso.
   2. Adicione 0,4 µ l de água livre de RNase, 3 µ l de 5 x buffer de DNA ligase, 0,6 µ l de 25 x adaptador de ligadura, 4,5 µ l 50% PEG 8000 e finalmente 1,5 µ l de ligase do RNA.
   3. Brevemente, vórtice e centrifugar a cocktail mistura a girar para baixo o conteúdo.
   4. Adicione 10 µ l da mistura para cada tubo de reação/poço que contém o produto de rejeito de poli (a). Misture por um agitador de placa a 1.900 rpm durante 1 min ou brevemente num Vortex e spin-down o conteúdo.
   5. Coloque os tubos de placa/reação em um termociclador com as seguintes configurações: incubação a 60 ° C por 60 min, com um seguimento segurar a 4 ° C.
      Nota: 50% PEG 8000 é altamente viscoso. Use em temperatura ambiente, aspiração e dispensação lentamente. Após cada aspiração e dispensação passo, segure a ponteira para 10 s para permitir que o reagente a fluir para cima e para baixo.
3. Realize a reação de transcrição reversa.
   1. Prepare a mistura de reação num tubo de centrífuga, com os seguintes volumes para cada amostra e 10% do volume em excesso.
   2. Adicione 3,3 µ l de RNase-livre água 6 µ l de 5 x tampão RT, 1,2 µ l do dNTP mix (25 mM cada), 1,5 µ l de 20 x primeiras demão RT Universal e finalmente 3 µ l de mistura de enzima RT de 10x.
   3. Brevemente, vórtice e centrifugar a cocktail mistura a girar para baixo o conteúdo.
   4. Adicione 15 µ l da mistura para cada tubo de reação/poço que contém o produto da ligadura. Misture por um agitador de placa a 1.900 rpm durante 1 min ou brevemente num Vortex e spin-down o conteúdo.
   5. Coloque os tubos de placa/reação em um termociclador com as seguintes configurações.
   6. Incube a 42 ° C por 15 min (transcrição reversa).
   7. Incubar a 85 ° C por 5 min (reação de parada), com uma espera seguir a 4 ° C.
      Nota: O produto RT agora pode ser armazenado a-20 º C e permanecerá estável por até 2 meses.
4. Realize a reação de miR-Amp (tabela de materiais).
   1. Prepare a mistura de reação num tubo de centrífuga com os seguintes volumes para cada amostra e 10% do volume em excesso.
   2. Adicione 17,5 µ l de água livre de RNase e 25 µ l do mix master 2 x miR-Amp 2,5 µ l de mistura de cartilha de miR-Amp de 20x.
   3. Brevemente, vórtice e centrifugar a cocktail mistura a girar para baixo o conteúdo.
   4. Para cada amostra, transferi 45 µ l da mistura de reação para cada poço de uma nova placa de reação ou um tubo de reação. Adicione 5 µ l do produto RT a cada tubo bem ou reação. Misture por um agitador de placa a 1.900 rpm durante 1 min ou brevemente num Vortex e spin-down o conteúdo.
   5. Coloque os tubos de placa/reação em um termociclador e executar conforme mostrado na tabela 1.

4. realizar o PCR em tempo real

1. Dilua cada cDNA amostra 01:10 em buffer de TE x 0,1.
2. Calcule o número de poços/repetições para cada amostra. Prepare a mistura de reação num tubo de centrífuga com os seguintes volumes para cada amostra, adicionando 10% do volume em excesso.
3. Adicione 4 µ l de água livre de RNase, 10 µ l de 2 x rápido avançado mestre mix (Mesa de materiais) e finalmente 5 µ l de cDNA diluído.
4. Mix vortexing e brevemente centrífuga para spin para baixo o conteúdo.
5. Transferência de 19 µ l da mistura de reação de cada poço, selar a placa e brevemente centrifugar.
6. Execute o protocolo térmico (tabela 2) em um sistema de RT-PCR.

Resultados

Analisou-se um painel de angiogênese relacionados miRNAs circulantes em relação a sobrevivência livre de progressão (PFS), global sobrevivência (OS) e objetiva resposta taxa (ORR) em um mCRC 52 pacientes tratados com tomografia baseada em B. A avaliação de tais biomarcadores em amostras de plasma é um desafio, devido a dificuldades técnicas. Utilizamos métodos estabelecidos para miRNA extração de amostras de plasma do paciente, transcrição reversa e pré-amplificação. Seg...

Discussão

os miRNAs são pequenos RNAs (18-25 nucleotides no comprimento) capazes de ligação 3' UTR região do alvo do RNA mensageiro e inibindo e/ou degradante, não-codificante. Assim, podem ser considerados reguladores de expressão do gene no nível de translação. Na última década, vários miRNAs tem sido correlacionados com câncer iniciação e desenvolvimento, tornando-os úteis biomarcadores clínicos para diagnóstico, prognóstico e terapia. Protegido por RNases, miRNAs estão presentes em uma forma estável em flu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes