転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

要約

がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna のパネル分析を行った。

要約

関心が高まっているがん診断、予後及び治療モニタリングのための液体の生検の臨床練習のための信頼性の高い、有用なバイオ マーカーの必要性を作成します。紹介を展開する、プロトコル逆転写し、循環 (CRC) 大腸癌患者の血漿サンプルから Mirna の発現レベルを評価します。マイクロ Rna (Mirna) は翻訳レベルでの標的遺伝子の発現を調節しての生理病理学のプロおよび抗血管新生機能を含む、重要な役割を果たす長さ 18-25 のヌクレオチドの非コード Rna のクラス様々 な器官。Mirna は血清、血漿は、理想的な癌の診断、予後、治療の意思決定のため血漿中バイオ マーカーと監視にそれらをレンダリングなどの体液で安定しています。マイクロ Rna 抽出を循環を有機および列ベースの方法論では、迅速かつ効果的な方法を使用して行った。MiRNA retrotranscription 3' と 5 ' ランダム miRNA 中古増幅に続いて、成熟 Mirna のアダプターの ligation 起こるを考慮したマルチ ステップの手順を使用しました。量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) によってテストする 24 miRNA カスタム パネルを選択し、配列カスタム プレートのマイクロ Rna プローブを発見します。リアルタイム PCR システム上で qRT PCR プレート動作を行った。(3.2) 対 GeNorm ソフトウェアを使用して正規化のハウスキーピング Mirna が選ばれました。式スイート ソフトウェア (v 1.1) を使用して、データを分析し、統計的分析を行った.このメソッドでは、信頼性と技術的に堅牢なことを証明し、血漿や血清などの液体試料中のバイオ マーカーのレベルを評価する役に立つかもしれません。

概要

CRC を表す 3 番目最も頻繁に悪性腫瘍と癌関連死の世界の 4 番目の原因を診断します。日には、承認されている、ベバシズマブ (B)、パニツムマブ (P)、上皮成長因子受容体 (EGFR) に対するモノクローナル抗体やセツキシマブ (C) 血管内皮増殖因子 (VEGF) に対するモノクローナル抗体ファーストライン治療レジメン (CT) と組み合わせて。

K ‐ RASおよびN-RAS遺伝子の突然変異が唯一の臨床的に有用なバイオ マーカー少なくとも抗 EGFR 基づく CT から恩恵を受ける可能性が高い患者を識別することができます。B ベース CT への応答の予測バイオ マーカーを検索するいくつかの研究を行った、まだ臨床実習¹で使用するための信頼性の高い、効果的な薬の相当な欠乏があります。

Mirna は、標的遺伝子の翻訳を調節して胚発生と発がんを含む多数の physiopathological プロセスで重要な役割を果たす小さな Rna (18-25 のヌクレオチドの長さ) です。これらの分子は、血漿/血清、尿、喀痰、それらに非侵襲的サンプリング²に使用する堅牢なバイオ マーカーを描画するなど体液に非常に安定しました。識別するために血管新生の経路に関与する Mirna のパネルを使用して、目的とする B ベースの CT レジメンで治療新しい転移 CRC (mCRC) 症例の臨床経過を予測できるバイオ マーカーを循環します。

52 のシリーズを行った mCRC 患者 B ベース ct 内前向き多施設共同無作為化フェーズ III 試験「イタリア トライアルで高度な大腸癌」(イタカ).現在のプロトコルはローカル倫理委員会によって承認された (あたり率いる Etico エリア Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo lo スタジオ e ラ クーラ ・ デイ ・周辺 (IRST) IRCCS 号 674) 19^th 2007 年 9 月に。すべての患者は、血液サンプルのコレクションの前にインフォームド コンセントを与えた。各患者の静脈血採取 (8 週間) 後の最初の臨床評価と治療前にベースライン miRNA 発現と患者のアウトカムに関連して治療中にその変調を評価します。

文献の検索、我々 はひと血漿中に検出する知られている 21 の miRNAs 血管新生のプロセスとの相関を選択: はミール 107、ミール-126 は 3 p ミール-145 が 5 p、ミール-194 は 5 p はミール-199a-5 p は-ミール-200b-3 p が-ミール-20b-5 p、、-ミール-21-5 p、ミール-210 が 3 p、ミール-221 が 3 p、ミール-24 が 3 p、がミール-27 a-3 p は-ミール-29 b-3、p は-ミール-335-5 p、ミール-424 が 5 p、ミール-497 が 5 p、はミール-520 d-3 p、がミール-92 a-3 p、ミール-17 は 5 p とは-ミール-155-5 p。我々 はまた、ミール-223 が 3 p を選択し、内生的正規化^3,4,5,6ミールは 484 と cel-ミール-39 は外因性の正規化のスパイクとして線虫から精製します。2 ̂ ̄(ΔΔCt) メソッドを使用してすべてのデータ正規化を行った。

MiRNAs の循環の検出は、分子がプラズマで非常に低いレベルで存在と彼らの増幅が化学的に挑戦的な短いシーケンスを与えられたので、いくつかの技術的な問題を示します。これらの理由から、フェノール、有機抽出とガラス繊維の列ベースの方法論を考慮した手順を選択しました。マイクロ Rna 抽出を循環液生検の分野でホットな話題では、我々 は最も信頼性の高いであることを示している市販キットを選択した回復した利回り^7,8の量と質の面で。我々 は逆にプロトコルを選択反応の特異性と選択性を高めるために 5' と 3 ' 成熟 miRNA のポリ a テールでアダプターの追加による Mirna を書き写します。

メソッドの堅牢性を考えると、重複の各サンプルを評価するために RT-PCR 法の事前発見プローブ カスタム プレートを設計し、図 1に示すように、各プレート内 2 患者を分析.

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プロトコル

注:すべての滅菌ヒューム フードによると良い研究所プラクティス (GLP) の下で次の手順を実行します。

1. プラズマ コレクションとストレージ

1. K3E EDTA 管末梢血サンプル 3 mL を収集します。
2. 室温で 15 分間 1,880 × gチューブを遠心します。
3. 450 μ L の因数で培養上清中のプラズマを回復します。
4. 使用するまで-80 ° c のサンプルを格納します。
   注:コレクションの 2 h 以内末梢血チューブを処理します。チューブからプラズマを回復するときに、リンパ球層が不可します。

2. 循環血漿検体 (材料表) からの miRNAs の抽出

1. すべての必要なソリューションを準備し、抽出手順のサンプルを解凍します。
   1. 2 の x denaturating ソリューションに 2-メルカプトエタノールの 375 μ L を加え、よく混ぜます。
   2. 21 mL ACS グレード 100% エタノールの miRNA の洗浄ソリューションを私は、ミックスも追加します。
   3. 洗浄液 2/3 に ACS グレード 100% エタノール 40 mL を加え、よく混ぜます。
   4. プラズマは因数室温で解凍し、抽出手順を開始できます。
2. 有機抽出
   1. RNase フリー 2 mL チューブに 400 μ L の血漿サンプルを転送します。
   2. 2 x denaturating ソリューションを 400 μ l 添加、ボルテックスでミックス、遠心分離機の簡潔に。
   3. 1 nM のスパイクでの 4 μ L を加えてボルテックスによってミックス簡単に遠心分離機します。
   4. 酸フェノール-クロロホルムの 800 μ L を追加します。
   5. 60 秒の最大速度 (≥10, 000 x g) で 15 分間遠心する渦。
   6. 新鮮なチューブに上層の水相を転送します。相間が不可でした。音量にご注意は回復し、非 acqueous 相を含むチューブを破棄します。
      注:解決の変化 x 2 は 4 ° C で保存され、この温度で固まることがあります。使用する前に暖かい 37 ° c で 10-15 分のために時折攪拌ソリューションをつけて酸フェノール クロロホルム acqueous バッファー混合物の上にあるではなくを含む下相を撤回します。溶出ソリューションまたは 95 ° c. にヌクレアーゼ フリー水を予熱します。熱溶液 (100 μ L のサンプル + 10% 超過) の適切なボリュームに注意してください。
3. 小さな RNA の濃縮
   1. 2.2.6 のステップから水相をエタノール 100% の 1/3 量を加え、徹底的に混ぜます。
   2. 各サンプルのため新鮮なコレクションの管にフィルター カートリッジを配置します。
   3. フィルター カートリッジ、10,000 × gで遠心する 30 のステップ 2.3.1 とエタノールからライセートまで 700 μ に転送 s。
   4. ある場合 > 700 μ L 混合物、左の新鮮なチューブで濾液を配置し、手順 2.3.3;この操作を繰り返して、すべての混合物は、フィルター カートリッジを通過しました。
   5. フロー ・ スルーの総量を測定します。
   6. 濾液し、混和してエタノール 100% の 2/3 のボリュームを追加します。
   7. 新鮮なコレクションの管に 2 つ目のフィルター カートリッジを配置します。
   8. カートリッジに最大 700 μ L のサンプル ボリュームを転送および 30 s. 破棄の 10,000 × gで遠心分離機の流れを。
   9. 2.3.8 の手順を繰り返してすべての混合物は、フィルター カートリッジを通過しました。
   10. フィルター カートリッジに miRNA 洗浄ソリューション 1 の 700 μ L を適用し、フロースルー - 15 s. 破棄の 10,000 x gでコレクションの管にフィルター カートリッジを遠心分離機します。同じコレクションの管にフィルター カートリッジを配置します。
   11. 15 s. 廃棄の流れを 500 μ L フィルター カートリッジと遠心 10,000 × gでコレクションの管にフィルター カートリッジを洗浄ソリューション 2/3 を適用します。新鮮なコレクションの管にフィルター カートリッジを配置します。
   12. 新鮮なコレクションの管にフィルター カートリッジを配置し、500 μ L で洗浄液 2/3 の 2.3.11 手順を繰り返します。流れを破棄し、フィルター カートリッジを新鮮なコレクション チューブに転送します。
   13. 1 分の 10,000 x gでフィルター カートリッジとチューブを遠心します。
   14. 1.5 mL の新鮮なコレクションの管にフィルター カートリッジを転送し、予熱した (95 ° C) 溶出ソリューションまたはヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L を追加します。
   15. 10,000 × gで遠心する 30 の Mirna を回復し、-80 ° C で保存する s
       注: 白い沈殿物は洗浄液 2/3 のフォームがあります。これは、過剰の EDTA をソリューションからリリースです。分注ステップの間にこれらの結晶を描画しないでください。

3. 逆のトランスクリプションおよび miRNA 中古増幅 (材料表) を実行します。

1. 起こる反応を実行します。
   1. 雪解けの氷の上のすべての試薬、渦、回転する遠心分離機の内容を下へ簡単に。また、雪解けの 50% は、8000、部屋の温度に到達することができますペグします。
   2. 3 μ L の反応の各サンプルのカクテルの最終的なボリュームを取得、0.5 mL の遠心管に反応混合物を準備します。各試薬の次のボリューム プラス 10% の余分なボリュームを使用します。
   3. 最終的に 0.3 μ L 5 10 mM ATP の 0.5 μ L、0.5 μ L ポリ a バッファー x 10 の RNase フリー水の 1.7 μ L を追加 U/μ L PolyA 酵素。
   4. 簡単に渦と遠心回転するカクテル ミックス内容をダウンします。
   5. リアクション プレートまたは反作用の管の各ウェルに 2 μ L のサンプルを転送し、カクテルの反応の 3 μ L を追加します。簡単に渦、回転する遠心分離機は、内容をダウンします。
   6. プレート/チューブをサーマルサイクラーに置き、次の手順を実行します。
   7. 45 分 (起こるステップ) の 37 ° C で孵化させなさい。
   8. 10 分 (停止反応)、65 ° C で 4 ° C で次のホールドと孵化します。
2. Ligation の反作用を実行します。
   1. 各サンプルの過剰量の 10% 以下のボリュームで遠心管の反応混合物を準備します。
   2. RNase フリー水 0.4 μ、DNA リガーゼ バッファー、結紮アダプター x 25 の 0.6 μ L、50% の 4.5 μ L x 5 の 3 μ L を追加ペグ 8000 と RNA リガーゼの最後に 1.5 μ L。
   3. 簡単に渦と遠心回転するカクテル ミックス コンテンツをダウンします。
   4. ポリ a のテーリング製品を含む、各井戸/反応管にミックスの 10 μ L を追加します。ミックス プレート シェーカー 1,900 rpm で 1 分、簡単にボルテックスと内容をスピン。
   5. 次の設定でサーマルサイクラーにプレート/反応管を配置: 4 ° C で次のように、60 分の 60 ° C で培養を保持
      注: 50% PEG 8000 は高粘度です。吸引・吐出をゆっくりと、常温で使用します。後、誤嚥および調剤手順ごと 10 栓を保持、上下流に試薬を許可する s。
3. 逆転写反応を実行します。
   1. 各サンプルの過剰量の 10% 以下のボリュームでの遠心管に反応混合物を準備します。
   2. RNase フリー水、RT バッファー、dNTP ミックス (25 mM) の 1.2 μ L、1.5 μ ユニバーサル RT プライマー x 20 x 5 の 6 μ L と RT 酵素ミックス x 10 の最後に 3 μ L の 3.3 μ L を追加します。
   3. 簡単に渦と遠心回転するカクテル ミックス内容をダウンします。
   4. 結紮製品を含む、各井戸/反応管にミックスの 15 μ L を追加します。ミックス プレート シェーカー 1,900 rpm で 1 分、簡単にボルテックスと内容をスピン。
   5. 次の設定でサーマルサイクラーにプレート/反応管を配置します。
   6. 15 分 (逆転写) 42 ° C で孵化させなさい。
   7. 4 ° C で次の保留で 5 分 (停止反応)、85 ° C でインキュベートします。
      注:RT 製品は-20 ° C で保存することができます今、2 ヶ月の安定したままになります。
4. ミール アンプ反応 (材料表) を実行します。
   1. 各サンプルの過剰量の 10% 以下のボリュームで遠心管の反応混合物を準備します。
   2. RNase フリー水 17.5 μ、25 μ L 2 x ミール アンプのマスター ミックスのミール アンプ プライマー ミックス x 20 の 2.5 μ L を追加します。
   3. 簡単に渦と遠心回転するカクテル ミックス内容をダウンします。
   4. 各サンプルでは、新しい反応プレートまたは反作用の管の各ウェルに反応混合物の 45 μ L を転送します。各井戸や反応管に RT 製品の 5 μ L を追加します。ミックス プレート シェーカー 1,900 rpm で 1 分、簡単にボルテックスと内容をスピン。
   5. サーマルサイクラーにプレート/反応管を置き、表 1に示すように実行します。

4. リアルタイム PCR を行い

1. 各 cDNA サンプル 1:10 0.1 x TE バッファーで希釈します。
2. 各サンプルの井戸/複製の数を計算します。各サンプルは、過剰量の 10% を追加する次のボリュームを遠心管に反応混合物を準備します。
3. RNase フリー水の 4 μ L、2 x 高速高度なマスター ミックス (材料表) の 10 μ L および希薄化後の cDNA の最後に 5 μ L を追加します。
4. ボルテックスでミックスし、簡単に内容を回転する遠心。
5. 反作用の組合せ、各プレートをシールし、簡潔に遠心分離機の 19 μ L を転送します。
6. RT-PCR システムで熱プロトコル (表 2) を実行します。

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結果

無進行生存期間 (PFS) との関係の循環の miRNAs の血管新生関連のパネルを用いて、全体的な生存 (OS) 客観的反応速度 (ORR) 52 mCRC 患者 B ベース CT. で治療で血漿検体でこのようなバイオ マーカーの評価は技術的な難しさのため挑戦です。中古増幅、逆のトランスクリプション患者血漿サンプルからマイクロ Rna 抽出に確立された方法を使用しました。製造元の指示に従っ?...

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ディスカッション

Mirna が小さい非コード Rna (18-25 のヌクレオチドの長さで) 彼らのターゲットのメッセンジャー RNA の 3' UTR 領域をバインドおよび抑制および/またはそれを分解することができます。翻訳レベルで遺伝子式レギュレータ従って見なされます。過去 10 年間でいくつかの miRNAs は癌の開始とし、診断、予後、治療の役に立つ臨床バイオ マーカー開発に関連しました。MiRNAs は、RNases によって保護され...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes