Un estudio de Immunohistopathologic a perfil el folato del Receptor Beta macrófago y microambiente inmunológico Vascular en Arteritis de células gigantes

Resumen

El protocolo muestra el uso de la examinación histopatológica e inmunohistoquímica al perfil el macrófago de beta del receptor de folato y su relación con el total de la célula inmune infiltran en las biopsias de arteria temporal en la arteritis de células gigantes.

Resumen

Arteritis de células gigantes (ACG) es una mediada inmune enfermedad crónica de las arterias de tamaño mediano a grande que afecta a los adultos mayores. GCA se manifiesta con síntomas oclusivos de dolores de cabeza y artritis, movimiento o pérdida de la visión. Linfocitos T-helper y macrófagos infiltran la pared vascular y producen una respuesta pro-inflamatorias que conducen a daño a los vasos e isquemia. Hasta la fecha, no hay ningún biomarcador GCA que puede monitorear la respuesta terapéutica guía y actividad de la enfermedad.

Beta del receptor de folato (FRB) es una proteína glicosilfosfatidilinositol anclada en las membranas celulares y normalmente se expresa en la estirpe mielomonocítica y en la mayoría de las células de la leucemia mieloide, así como en el tumor y los macrófagos sinoviales reumatoides, donde su expresión se correlaciona con la severidad de la enfermedad. La capacidad de FRB compuestos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados y fármacos antifolatos ha hecho un blanco druggable en cáncer y la investigación de la enfermedad inflamatoria. Este informe describe los métodos histopatológicos e immunohistochemical para evaluar la expresión y distribución de FRB en lo referente a GCAimmunopathology.

Las biopsias de arteria temporal fijados con formol y embebido en parafina de ACG y controles normales fueron teñidas con hematoxilina y eosina para revisar la histología del tejido e identificar características patognomónicas. Immunohistochemistry fue utilizado para detectar expresión de FRB, CD68 y CD3. Se realizó un análisis microscópico para cuantificar el número de células teñidas positivamente en 10 secciones de campo de alta potencia seleccionadas y sus respectivas ubicaciones en la pared arterial.

Inflamación lymphohistiocytic (LH) acompañada de hiperplasia intimal y lámina elástica interrumpido fue visto en GCA con ninguno en los controles. El infiltrado de LH fue compuesto de aproximadamente 60% linfocitos y 40% macrófagos. Expresión de FRB se restringió a los macrófagos, que comprende el 31% de la población de macrófagos CD68 + total y localizada a la media y adventicia. No FRB se observó en los controles.

Este protocolo demostró un patrón numérico y espacial distinto del macrófago FRB en relación con el microambiente inmunológico vascular en ACG.

Introducción

Arteritis de células gigantes (ACG) es una enfermedad inflamatoria de las arterias medianas a grandes, dirigidos a la aorta y sus ramas y que afectan a los adultos mayores. Presenta leves a severas complicaciones isquémicas tales como dolores de cabeza, dolor de mandíbula, pérdida de la visión, movimiento y tejidos gangrena. La diagnosis es confirmada por altos marcadores inflamatorios como tarifa de sedimentación de eritrocito (ESR) y un patrón histopatológico distinto en la biopsia (ficha) de arteria temporal¹. GCA es la vasculitis más común de adultos, y la accesibilidad de la arteria temporal obtenida para diagnóstico presenta una ventaja sobre otros vasculopathies, así que permiten estudiar más fácilmente su patogenesia. Los resultados típicos en ficha incluyen un infiltrado de macrófagos/histiocitos y linfocitos T encontrados todas las capas vasculares de la intima del tunica, media y adventicia con simultánea destrucción de la lámina elástica que normalmente separa estos compartimientos de². La evidencia actual demuestra que GCA implica un antígeno desconocido que activa las células dendríticas en la adventicia vascular, seguido por la contratación de ayudante células de T (Th), subtipos específicamente Th1 y Th17 que secretan interleucina-17 y interferón-gamma (IFG) respectivamente. IFG y recluta y activa los macrófagos para producir citocinas y proteasas. Estos incluyen las citoquinas pro inflamatorias; incluyendo la IL-12, que recíprocamente activa Th1 células proporcionando así un bucle de retroalimentación positiva; factor de necrosis tumoral y la interleucina-6, que causa la artritis y fiebres y metaloproteasas que dañan la lámina elástica. Glucocorticoides (GC), que constituyen la terapia crónica estándar, controlan parcialmente las vías del cytokine atenuando la Th17/IL-17, pero no el brazo Th1/IFG de la respuesta inmune^3,4. Desafortunadamente, discontinuación de la GC resulta en recaída de la enfermedad. Como una modalidad alternativa, metotrexato ha sido repurposed para el tratamiento de la GCA y los puntos finales clínicos deseados no siempre lograron aunque biomarcadores más sensibles no han sido utilizados para el monitoreo terapéutico^5,6 . En 2017, el bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, era aprobado para el tratamiento de ACG como demostró con eficacia control de la enfermedad y esteroides sparing efectos^7,8.

Hasta la fecha, no hay ninguna buena biomarcadores para GCA. Como resultado, es difícil supervisar actividad de la enfermedad y valorar la dosis de fármacos disponibles para evitar los efectos adversos y reducir la carga de costo a la sociedad. Por lo tanto, es imperativo buscar un biomarcador de candidato que se correlaciona con la actividad de la enfermedad, proporcionar nuevos conocimientos sobre patogénesis y ayuda en las decisiones terapéuticas.

La desregulación de la activación de los macrófagos es un factor crítico en la patogénesis de la GCA. Así, puede ser un medio eficaz de tratar la GCA la focalización selectiva de macrófagos activados. La beta del receptor del folato (FRB) es una glicoproteína de glicosil-fosfatidilinositol que está anclada en la membrana de la célula expresados en células myelomonocytic normal, las células de la leucemia mieloide y activa los macrófagos. Su ligando, el ácido fólico es una vitamina esencial en su forma reducida, que permite que celular DNA síntesis, reparación y metilación del⁹. FRB expresión es inducida en la enfermedad autoinmune y durante la carcinogénesis. Su expresión se limita a la superficie de monocitos o macrófagos pro-inflamatorias de M1 en la artritis reumatoide o a antiinflamatorios macrófagos M2 en órganos sólidos y malignidades mieloides^{10,11,12 , 13}. Además de su papel potencial como un biomarcador de macrófagos activados, la unidad FRB puede habilitar el transporte de droga selectiva a través de un proceso de múltiples paso que comienza con el atascamiento del receptor para ácido fólico, antifolates o medicamentos conjugados con ácido fólico en la célula superficie, seguida de la internalización, la liberación y la eventual entrega de droga deseada a la interna de la célula maquinaria^12,14,15,16. En contraste con FRB expresado en las células cancerosas y activa macrófagos, FRB expresado en las células hematopoyéticas normales es incapaz de enlazar folatos garantizando que FRB/folato-mediado entrega de la droga se limita a FRB-positiva inflamatoria o las células cancerosas.

En nuestro estudio anterior, demostramos por primera vez que FRB se expresa en los macrófagos de la GCA y su expresión correlaciona con CD68 + y endotelina macrófagos de receptores beta, que contribuyen a la patogénesis de GCA¹⁷. En este informe, describimos el histopatológico y métodos inmunohistoquímicos utilizan para evaluar el macrófago de la FRB y analizan el total de linfocitos y macrófagos cuenta para ganar la penetración en la posición de la FRB en el paisaje vascular GCA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los métodos descritos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional del estado de Penn.

1. histopatológico preparación y procesamiento después de obtener la biopsia de arteria Temporal

Nota: La biopsia de arteria temporal (ficha) se realiza bajo anestesia local y las condiciones de esterilidad por un cirujano certificado. Tras obtener quirúrgicamente una sección arterial de 3 cm en el lado más afectado, la muestra fijada en formalina inmediatamente por 24 h, dividida en secciones de 3 a 4 mm y embebida en parafina, prestando especial atención a la alineación correcta de tejido en el bloque que se almacena a temperatura ambiente. Selección de la muestra se realiza después de verificar los informes médicos. El diagnóstico se basa en el Colegio Americano de Reumatología 1990 criterios que requiere que sujetos cumplan 3 de los 5 dominios: edad > 50 años, nuevo dolor de cabeza, sensibilidad de la arteria temporal, una eritrosedimentación > 50 mm/hora por el método de Westergren y una pestaña anormal. Por seguridad, deben llevarse guantes de protección en todo momento al manipular las muestras, productos químicos y los anticuerpos.

1. De los bloques integrados, cortar secciones de 4-5 μm espesor utilizando un micrótomo. y tinción con hematoxilina y eosina (H & E). Utilice una sección de control de tejido normal seleccionado para el aseguramiento de la calidad.
2. Flotador cortar secciones en un baño de agua caliente calentada a 40 ° C para eliminar las arrugas y recoger con una diapositiva microscópica de vidrio revestido.  Coloque el portaobjetos sobre una placa caliente en un horno de 60 ° C durante 60 minutos facilitar el secado y el cumplimiento de la sección de la diapositiva.
3. Coloque el portaobjetos sobre una placa caliente en un horno de 60 ° C durante 60 minutos facilitar el secado y el cumplimiento de la sección de la diapositiva.
4. 3 secciones de montaje en portaobjetos.
5. Coloque los portaobjetos en un bastidor vertical y seque durante la noche a 37 ° C durante 24 h.
6. Coloque los portaobjetos en un recipiente y conservar a 4 ° C.

2. Immunohistochemical preparación, desparafinado, recuperación de antígeno y tinción^15,18,19,20

1. Cargue los portaobjetos en una parrilla. Ejecutar la rejilla a través de platos como sigue: dos veces en xileno 100% durante 5 minutos con 10 segundos de agitación suave cada 30 segundos, una vez en 100% de etanol con agitación 10 segundos, una vez en el 90% de etanol con agitación 10 segundos, en etanol al 70% con agitación 10 segundos , y doble dos veces en agua destilada H2O con agitación de 10 segundos.
   Nota: Manejo de xileno y acetona debe hacerse en campanas de ventilación para evitar la inhalación y la toxicidad respiratoria.
2. Recuperar el antígeno mediante la transferencia de la parrilla en un recipiente de cristal con 200 mL de 10 mmol/L, pH tampón citrato 6.0 precalentado a 95 ° C. Ajustar el temporizador de 30 minutos en el baño de agua, luego enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego enjuague con agua corriente durante 5 minutos.
3. Eliminar actividad de peroxidasa endógena por incubación en 200 mL de peróxido de hidrógeno 3% durante 10 minutos. Lave el portaobjetos 3 veces en 200 μL de solución salina tamponada con Tris (TBS).
4. Quite las diapositivas de la rejilla y frote cada una suavemente para eliminar el exceso de tampón. Para la tinción, añadir 200 μL de los siguientes anticuerpos primarios, añadir cubreobjetos en portaobjetos e incubar en cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente:
   Anticuerpo anti-FRB diluido 1: 800
   Humano anticuerpo monoclonal de ratón CD68, dilución 1: 200
   Dilución de 1: 100 de anti-CD3 policlonal de conejo
   Nota: Formalina-fijo secciones parafina-encajadas de la placenta también se procesaron como se describe en pasos 2.1 a 2.9 e incubados con anti-FRB18 y utilizadas como control positivo. Resultados de tinción fueron obtenidos por encontrar la concentración óptima del anticuerpo y fue realizada por valorar el anticuerpo en diluciones dobles (e.g. 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:1600).
5. Quite el cubreobjetos después de la incubación y descarte. Enjuague los portaobjetos durante 2 minutos con TBS 3 veces, drene y limpie el exceso de tampón.
6. Añadir 200 μL de solución de anticuerpo secundario biotinilado anticuerpo secundario de ratón-anti-conejo para reaccionar con el anticuerpo primario no conjugado a antígeno tisular. Coloque el cubreobjetos en portaobjetos e incubar en cámara húmeda durante 45 minutos a temperatura ambiente.
7. Quite el cubreobjetos después de la incubación y descarte. Enjuague los portaobjetos durante 2 minutos con TBS 3 veces, drene y limpie el exceso de tampón.
8. Añadir 200 μL de diaminobenzidina (DAB) + buffer sustrato (imidazol HCl)-sistema cromógeno e incubar 10 minutos a visualizar el patrón de coloración. Lavado con TBS luego en chorro del grifo durante 10 minutos.
9. Contratinción con hematoxilina durante 3 minutos.
10. Montar las diapositivas aplicando 70 μl de medio de montaje a la superficie de la diapositiva. Lentamente incline el cubreobjetos en el medio de montaje y evitar crear burbujas como bajarlo en su lugar. Espere 24 horas para secarse.

3. histopatológico y análisis inmunohistoquímico (IHQ)

Examinar la H & E y IHC manchado secciones de GCA normales y positivas los temas usando un microscopio de luz.

1. Para la H & E tinción de secciones:
   1. Evaluar la arquitectura vascular e identificar las células endoteliales en la intima del tunica, células de músculo liso en la túnica media y los fibroblastos y vasa vasorum en la túnica adventicia^21,22.
   2. Identificación de las características de la GCA, que incluyen linfocitos y macrófagos/histiocitos infiltración, hiperplasia celular y degradación de la lámina elástica interna.
   3. Analizar el lymphohistiocytic infiltra por identificar y cuantificar el número de macrófagos en relación a los linfocitos. Evaluar el grado de interrupción de la lámina elástico interna y hyperplastic cambios en células residentes y comparar con controles.
2. Para el IHC secciones manchada:
   1. Examinar el patrón de coloración de la FRB, tomando nota de su expresión por un determinado tipo o tipos de células y su distribución dentro de las capas vasculares y su relación a la infiltración inmunitaria total, el marcador de macrófagos total, anti-CD68 y el pan marcador de linfocitos anti CD3.
   2. Cuantificar la expresión de células de FRB, CD68 y CD3 contando las células teñidas positivamente en 10 varios campos seleccionados al azar de alto poder (hpf) y registrar los medios.
      Nota: Identificación de estas células normales y patológicas y las estructuras fueron realizadas por un patólogo cardiovascular certificado (J.M.) y reumatólogo (S.A.A.) y los resultados se registraron en todos los casos.
   3. Captura de imágenes representativas con una cámara digital.
      Nota: Después de estos pasos restantes alícuotas pueden ser almacenadas a-80 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Resultados histopatológicos

La H & E mancha en anatomía arterial normal demostrada muestras normales con células endoteliales en la intima del tunica, células de músculo liso en la túnica media, y una matriz de colágeno heterogéneos que incluyen fibroblastos y alimentador vasos llamados vasa vasorum en el adventitia de tunica. Hay no hay infiltrado inflamatorio identificado. Arterias temporales positivas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

GCA es la vasculitis más común en adultos, y su seña de identidad patológica ejemplifica una potente combinación de linfocitos del ayudante T y activa los macrófagos que se encuentran también en otras enfermedades granulomatosas o vasculopathies como sarcoidosis y polyangiitis granulomatosa^2,3. En ACG, la arteria temporal proporciona una buena representación de una arteria de tamaño mediano a grande y la biopsia TA da una muestra de tamaño considerable ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips	Fisher Scientific
Vertical rack	Fisher Scientific
Light microscope	Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water			concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta	Manohar Ratnam		optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68	Dako	M071801	optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody	Dako
Placental tissue			for FRB positive control