Uno studio di Immunohistopathologic per profilare il folato recettore Beta macrofago e microambiente vascolare immuni nella arterite a cellule giganti

Riepilogo

Il protocollo viene illustrato l'utilizzo dell'esame istopatologico e immunohistochemistry al profilo il macrofago di folato recettore beta e il suo rapporto con il totale delle cellule immuni infiltrarsi in biopsie temporali dell'arteria in arteritis gigante delle cellule.

Abstract

Arteritis gigante delle cellule (GCA) è un'immuno-mediata malattia cronica delle arterie di dimensioni medio-grandi che colpisce gli adulti più anziani. GCA manifesti con artrite e occlusivi sintomi di mal di testa, colpo o perdita della vista. Macrofagi e linfociti T-helper infiltrano nella parete vascolare e producono una risposta pro-infiammatoria che conducono a danno del vaso e ischemia. Ad oggi, non c'è nessun biomarcatore di GCA che può controllare la malattia attività e guida risposta terapeutica.

Folato del recettore beta (FRB) è una proteina di glicosilfosfatidilinositolo che è ancorata sulle membrane cellulari e normalmente espressi nella stirpe myelomonocytic e nella maggior parte delle cellule di leucemia mieloide pure come nel tumore e macrofagi sinoviali reumatoidi, dove la sua espressione correla con la severità di malattia. La capacità di associare composti di folati, acido folico-coniugati e droghe antifolati FRB ha reso una destinazione trattabili in cancro e la malattia infiammatoria ricerca. Questo rapporto descrive i metodi istopatologici e immunohistochemical, utilizzati per valutare l'espressione e la distribuzione di FRB in relazione GCAimmunopathology.

Le biopsie dell'arteria temporale formalina-fisso e paraffina-incastonati da GCA e comandi normali erano macchiate con ematossilina ed eosina per rivedere l'istologia del tessuto e identificare caratteristiche patognomoniche. Immunohistochemistry è stato usato per rilevare l'espressione FRB, CD68 e CD3. Stata effettuata un'analisi microscopica per quantificare il numero di celle positivamente macchiate in 10 sezioni selezionate di high-power-campo e nelle rispettive posizioni nella parete arteriosa.

L'infiammazione lymphohistiocytic (LH) accompagnato da iperplasia intimale e perturbata lamina elastica è stata veduta nel GCA con nessuno trovato nei controlli. L'infiltrazione di LH era composta di circa il 60% di linfociti e il 40% di macrofagi. Espressione di FRB era limitata ai macrofagi, che comprende il 31% della popolazione di macrofagi CD68 + totale e localizzato ai media e avventizia. Nessun FRB è stato visto nei controlli.

Questo protocollo ha dimostrato un modello distinto di numerico e spaziale del macrofago FRB rispetto al microambiente immune vascolare nel GCA.

Introduzione

Arteritis gigante delle cellule (GCA) è una malattia infiammatoria delle medio-grandi arterie, l'aorta ed i relativi rami di targeting e che interessa gli adulti più anziani. Si presenta con lievi a gravi complicanze ischemiche quali mal di testa, perdita della vista, dolore alla mascella, gangrene del colpo e del tessuto. La diagnosi è confermata dall'alti indicatori infiammatori come tasso di sedimentazione dell'eritrocito (ESR) e un modello istopatologico distinto sull'arteria temporale biopsia (scheda)¹. GCA è la più comune vasculite adulta, e l'accessibilità dell'arteria temporale ottenuta per diagnosi presenta un vantaggio rispetto altre vasculopatie, così permettendo ad uno di studiare la relativa patogenesi più prontamente. I risultati tipici nella scheda includono un'infiltrazione dei macrofagi/istiociti e linfociti T trovati attraverso tutti gli strati vascolari della tonaca intima, media e avventizia con concomitante distruzione della lamina elastica che normalmente separa questi vani². L'evidenza attuale dimostra che GCA comporta un antigene sconosciuto che attiva le cellule dendritiche nel adventitia vascolare, seguita dall'assunzione di helper cellule di T (Th), in particolare Th1 e Th17 sottotipi che secernono interleuchina-17 e interferone-gamma (IFG) rispettivamente. IFG poi recluta e attiva i macrofagi a produrre citochine e proteasi. Questi includono le citochine pro-infiammatorie; compreso IL-12, che reciprocamente si attiva le cellule Th1, fornendo così un ciclo di feedback positivo; fattore di necrosi tumorale e l'interleuchina-6, che causano artrite e febbri e metalloproteasi che danneggiare la lamina elastica. I glucocorticoidi (GC), che costituiscono la terapia cronica standard, controllano parzialmente le vie di citochina attenuando Th17/IL-17, ma non il braccio Th1/IFG di risposta immunitaria^3,4. Purtroppo, l'interruzione del GC provoca in ricaduta di malattia. Come modalità alternativa, metotrexato è stato reimpiegato per trattamento di GCA, ma il desiderato endpoint clinici non sono stati raggiunti costantemente anche se biomarcatori più sensibili non sono stati utilizzati per il monitoraggio terapeutico^5,6 . Nel 2017, il blocco di interleuchina 6, tocilizumab, è stato approvato per il trattamento del GCA quanto dimostrato efficacemente il controllo delle malattie e con parsimonia effetti^7,8steroide.

Fin qui, non ci sono nessun buoni biomarcatori per GCA. Di conseguenza, è difficile monitorare l'attività di malattia e titolare di dosi di farmaci disponibili per evitare gli effetti negativi e ridurre l'onere del costo per la società. Pertanto, è imperativo per cercare un biomarcatore di candidato che correla con attività di malattia, fornire nuove conoscenze sulla patogenesi e l'aiuto nelle decisioni terapeutiche.

La disregolazione dell'attivazione macrofagica è un fattore critico nella patogenesi di GCA. Quindi, un mezzo efficace di trattare GCA può essere il targeting selettivo dei macrofagi attivati. La versione beta del recettore di folato (FRB) è una glicoproteina di glicosil fosfatidilinositolo che è ancorata sulla membrana cellulare espressa in cellule myelomonocytic normale, le cellule di leucemia mieloide e macrofagi attivati. Suo ligando, acido folico, è una vitamina essenziale nella sua forma ridotta, che consente la sintesi, la metilazione e la riparazione del DNA cellulare⁹. FRB espressione è indotta nella malattia autoimmune e durante la carcinogenesi. La sua espressione è limitata alla superficie dei monociti o pro-infiammatorie M1 macrofagi nell'artrite reumatoide, o a antinfiammatori M2 macrofagi in organo solido e neoplasie mieloidi^{10,11,12 , 13}. oltre al suo ruolo potenziale come biomarcatore di macrofagi attivati, FRB può abilitare il trasporto del farmaco selettivo attraverso un processo a più fasi che inizia con l'associazione del recettore per l'acido folico, antifolici o folato-coniugati di droga dalla cella superficie, seguita da interiorizzazione, rilascio e consegna eventuale di farmaco desiderata per l'interno cella macchinari^12,14,15,16. A differenza di FRB espressi su cellule tumorali e macrofagi attivati, FRB espresso in cellule emopoietiche normali è in grado di associare i folati assicurando che FRB/folato-ha mediato la consegna della droga è limitata a FRB-positiva infiammatoria o cellule tumorali.

Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato per la prima volta che FRB è espresso nei macrofagi GCA e sua espressione correlata con CD68 + ed endotelina macrofagi beta del recettore, che contribuiscono alla patogenesi di GCA¹⁷. In questo rapporto, descriviamo l'istopatologico e immunohistochemical metodi utilizzati per valutare il macrofago FRB e analizzato il totale dei linfociti e macrofago conta per guadagnare la comprensione nella posizione di FRB nel paesaggio vascolare GCA.

Protocollo

Tutti i metodi descritti sono stati approvati da Penn State Institutional Review Board.

1. istopatologico preparazione ed elaborazione previa biopsia dell'arteria temporale

Nota: La biopsia dell'arteria temporale (scheda) viene eseguita in anestesia locale e condizioni sterili di un chirurgo certificato. Dopo aver ottenuto chirurgicamente una sezione arteriosa di 3 cm dal lato più commovente, l'esemplare è fissato in formalina immediatamente per 24 h, diviso in sezioni da 3 a 4 mm e inclusi in paraffina, prestando molta attenzione all'allineamento corretto del tessuto nel blocco che allora è conservato a temperatura ambiente. Selezione del campione viene eseguita dopo aver verificato la documentazione medica. La diagnosi si basa sull'American College of Rheumatology 1990 criteri che richiede che i soggetti compiono 3 di 5 domini: età > 50 anni, nuova cefalea, tenerezza dell'arteria temporale, un tasso di sedimentazione dell'eritrocito > 50 mm/ora dal metodo Westergren e una scheda anormale. Per sicurezza, guanti di protezione devono essere indossati in ogni momento nel maneggiare i campioni, prodotti chimici e gli anticorpi.

1. Dai blocchi incorporati, tagliare sezioni spesse 4-5 µm, utilizzando un microtomo. e macchia con ematossilina ed eosina (H & E). Utilizzare una sezione di controllo del tessuto normale selezionato per garantire la qualità.
2. Galleggiante di tagliare sezioni su un bagno di acqua calda riscaldata a 40 ° C per rimuovere le grinze e pick up con una diapositiva microscopica di vetro rivestito.  Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 ° C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione alla diapositiva.
3. Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 ° C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione alla diapositiva.
4. Montare 3 sezioni su vetrini da microscopio.
5. Mettere i vetrini in un rack verticale e asciugare durante la notte a 37 ° C per 24 h.
6. Mettere i vetrini in un contenitore e conservare a 4 ° C.

2. Immunohistochemical preparazione, deparaffinazione, ricupero dell'antigene e la macchiatura^15,18,19,20

1. Caricare diapositive in un portavetrini. Eseguire il rack attraverso piatti come segue: due volte in xilene 100% per 5 minuti con 10 secondi di agitazione delicata ogni 30 secondi, una volta in etanolo al 100% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 90% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 70% con agitazione di 10 secondi , e due volte nel doppio distillata H2O con agitazione di 10 secondi.
   Nota: Gestione di acetone e xilene deve essere eseguita in cappucci ventilati per evitare l'inalazione e tossicità respiratoria.
2. Recuperare l'antigene trasferendo il rack in un contenitore di vetro con 200 mL di 10 mmol/L, tampone a pH 6.0 citrato preriscaldata a 95 ° C. Impostare il timer per 30 minuti a bagnomaria, poi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti, poi sciacquare con acqua corrente per 5 minuti.
3. Rimuovere attività perossidasica endogena incubando in 200 mL di perossido di idrogeno 3% per 10 minuti. Lavare i vetrini 3 volte in 200 µ l di soluzione salina tamponata (TBSS).
4. Rimuovere le diapositive dal rack e tamponare ciascuno delicatamente per strofinare il tampone in eccesso. Per la colorazione, aggiungere 200 µ l dei seguenti anticorpi primari, aggiungere vetrini su vetrini e incubare in camera umida a temperatura ambiente per 1 ora:
   Anticorpo anti-FRB diluito 1: 800
   Monoclonale murino anti-umano CD68, diluizione 1: 200
   Diluizione 1: 100 di policlonale di coniglio anti-CD3
   Nota: Sezioni di paraffina-incastonato formalina-fisso della placenta sono stati anche trattati come descritto nella procedura 2.1 a 2,9 e incubate con anti-FRB18 e utilizzati come controllo positivo. Risultati della colorazione sono state ottenute trovando la concentrazione ottimale dell'anticorpo ed interpretata dalla titolazione l'anticorpo in diluizioni doppie (es. 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:1600).
5. Rimuovere coprioggetto dopo incubazione e scartare. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBSS, svuotare e pulire il tampone in eccesso.
6. Aggiungere 200 µ l di soluzione di anticorpo secondario contenente anticorpo secondario biotinilato Anti-coniugato/Mouse per reagire con l'anticorpo primario non coniugata legata all'antigene del tessuto. Posizionare le lamelle su diapositive e incubare in camera umida per 45 minuti a temperatura ambiente.
7. Rimuovere coprioggetto dopo incubazione e scartare. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBS, svuotare e pulire il tampone in eccesso.
8. Aggiungere 200 µ l di diaminobenzidina (DAB) + tampone substrato (imidazolo HCl)-sistema cromogeno e incubare per 10 minuti per visualizzare il modello di macchiatura. Lavare con TBSS poi in acqua corrente per 10 minuti.
9. Colorante di contrasto con ematossilina per 3 minuti.
10. Montare le diapositive applicando 70 µ l di soluzione di montaggio sulla superficie del vetrino. Lentamente il suggerimento per il coprioggetto sul supporto di montaggio ed evitare la creazione di bolle e verso il basso in posizione. Attendere 24 ore per asciugare.

3. istopatologico e analisi immunoistochimica (IHC)

Esaminare la H & E e IHC macchiato sezioni da soggetti di GCA positivi e normale utilizzando un microscopio ottico.

1. Per la H & E sezioni colorate:
   1. Valutare l'architettura vascolare e identificare le cellule endoteliali in tonaca intima, cellule di muscolo liscio nel mezzi di tunica e fibroblasti e vasa vasorum della tunica avventizia^21,22.
   2. Identificare le caratteristiche di GCA, che comprendono dei linfociti e l'infiltrazione del macrofago/del histiocyte, iperplasia cellulare e la degradazione di lamina elastica interna.
   3. Analizzare l'infiltrazione lymphohistiocytic per identificare e quantificare il numero di macrofagi rispetto i linfociti. Valutare l'entità della rottura della lamina elastica interna e iperplastiche nella cellule residenti e confrontare con i controlli.
2. Per l'IHC sezioni colorate:
   1. Esaminare il modello di macchiatura di FRB, prendendo atto della sua espressione di un determinato tipo o tipi di cellule e la sua distribuzione all'interno degli strati vascolari e la sua relazione per l'infiltrazione totale immune, l'indicatore del macrofago totale, anti-CD68 e la padella marcatore del linfocita anti CD3.
   2. Quantificare l'espressione delle cellule FRB, CD68 e CD3 contando le cellule marcate positivamente il 10 più campi selezionati in modo casuale ad alta potenza (hpf) e registrare i mezzi.
      Nota: Identificazione di queste cellule normali e patologiche e le strutture sono state eseguite da un patologo cardiovascolare certificato (J.M.) e reumatologo (SAA) e i risultati sono stati registrati per tutti i casi.
   3. Catturare immagini rappresentative utilizzando una fotocamera digitale.
      Nota: Dopo questi passaggi, i restanti aliquote possono essere conservati a-80 ° C.

Risultati

Risultati istopatologici

La H & E macchie in anatomia arteriosa normale dimostrata di esemplari normali con le cellule endoteliali in tonaca intima, cellule di muscolo liscio nella tunica media, e una matrice di collagene eterogenea che fibroblasti e vasi dell'alimentatore sono chiamati vasa vasorum nel adventitia di tunica. Non c'è nessun infiltrato infiammatorio identificato. Arterie temporali positive GCA ha...

Discussione

GCA è la vasculite più comune negli adulti, e relativo marchio di garanzia patologico esemplifica una potente combinazione di linfociti T helper e macrofagi che possono essere trovati anche in altre malattie granulomatose o vasculopatie come sarcoidosi attivati e granulomatosa polyangiitis^2,3. Nel GCA, l'arteria temporale fornisce una buona rappresentazione di un'arteria di dimensione medio-grandi e la biopsia TA dà un esempio considerevole che possa essere me...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips	Fisher Scientific
Vertical rack	Fisher Scientific
Light microscope	Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water			concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta	Manohar Ratnam		optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68	Dako	M071801	optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody	Dako
Placental tissue			for FRB positive control