葉酸受容体ベータ マクロファージと巨細胞性動脈炎で微小血管免疫環境をプロファイリングする Immunohistopathologic 研究

要約

プロトコルは、病理組織学的検査および免疫組織化学葉酸受容体ベータ マクロファージと総免疫細胞との関係は、巨細胞性動脈炎、側頭動脈生検に潜入のプロファイルの使用方法を示します。

要約

巨細胞性動脈炎 (GCA) は高齢者に影響を与える慢性免疫介在する病気中型-大型サイズ動脈です。GCA マニフェスト関節炎と頭痛の閉塞症状、脳卒中または視野の損失。マクロファージと T ヘルパー リンパ球、血管壁に潜入し、血管損傷や虚血につながるプロ炎症性応答を生成します。日には、疾患活動とガイド治療反応を監視することができます GCA バイオ マーカーはありません。

葉酸受容体 β (FRB) は細胞膜に固定され、通常骨髄単球性系統および腫瘍や関節リウマチの滑膜マクロファージのように同様に骨髄性白血病細胞の大半でを表す一種のタンパク質どこその表現は疾患重症度と相関。葉酸化合物、葉酸酸抱合体、antifolate 薬をバインドする FRB の機能は、がんや炎症性疾患の研究で druggable ターゲットをしました。このレポートでは、GCAimmunopathology に関連して FRB の分布と発現を評価するために使用される病理組織学的および免疫組織化学的方法について説明します。

GCA と健常者からホルマリン固定、パラフィン包埋側頭動脈生検はティッシュの組織学を復習して特徴的機能を識別するには、ヘマトキシリンとエオシンで染色しました。免疫組織化学は、FRB、CD68、CD3 の表現を検出する使用されました。選択した高電力フィールド セクション 10 および動脈壁のそれぞれの場所に積極的にステンド グラスのセルの数を定量化する顕微解析を行った。

Lymphohistiocytic (LH) 炎症を伴う内膜肥厚と乱れた弾性板はどれもコントロールは、GCA で見られました。LH 潜入は、約 60% 40% リンパ球とマクロファージの作曲されました。FRB の式は、マクロファージ、CD68 + マクロファージの総人口の 31% を構成して、メディアと外膜にローカライズされたに制限されました。コントロールで FRB は認められなかった。

このプロトコルは、GCA の血管免疫微小環境を基準にして FRB マクロファージの明確な数値的および空間的パターンを示した。

概要

巨細胞性動脈炎 (GCA) は、中型-大型の動脈、大動脈とその枝を対象とし、高齢者に影響を与える炎症性疾患です。それは軽度の頭痛、顎の痛み、視力低下、脳卒中と組織の壊疽など重篤な虚血性合併症を呈する。赤血球沈降速度 (ESR) と側頭動脈生検 (タブ)¹に明確な病理組織学的パターンのような高い炎症性マーカーによる診断は確定します。GCA は最も一般的な成人血管炎と診断の得られる側頭動脈のアクセシビリティ提示他の vasculopathies、従ってより容易にその病因を研究する 1 つを有効にするのにはない利点。タブ上の典型的な所見は、通常これらを分離する弾性板の破壊が同時内膜や外膜メディアのすべての血管層にわたって発見した T リンパ球とマクロファージ ・組織球の浸潤コンパートメント²。GCA は、血管の外膜に樹状細胞を活性化する未知の抗原を含む現在の証拠を示して、ヘルパーの募集が続きます T (Th) 細胞、特に Th1 と th17 細胞サブタイプ インターロイキン 17 を分泌してインターフェロン-γ (IFG) それぞれ。IFG は募集し、サイトカインおよびプロテアーゼを生産するマクロファージを活性化します。炎症性サイトカイン; が含まれますIL-12 相互従って肯定的なフィードバック ループを提供する Th1 細胞を活性化するを含む関節炎、発熱および分解酵素を引き起こす腫瘍壊死因子やインターロイキン 6、弾性板を損傷します。標準的な慢性的な治療ではありません、グルココルチコイド (GC) は、部分的に th17 細胞/IL-17 が免疫応答の^3,4の Th1/IFG 腕ないを減衰させることによってサイトカイン経路を制御します。残念ながら、GC の停止結果病気再発。代替療法としてメトトレキサートは GCA 治療の用途が変更されてより敏感なバイオ マーカーが治療モニタリングの^{5,6 活用されていませんが、ない目的の臨床的エンドポイントは達成された一貫して}.それは効果的に疾病とステロイド効果^7、8をさかんに示すよう、2017 年でインターロイキン 6 ブロック、トシリツマブ、GCA の治療のため承認されました。

日には、GCA の良いバイオ マーカーがないです。その結果、疾患活動性を監視し、副作用を回避し、社会コストの負担を軽減する使用可能な薬品の投与量を滴定することは困難です。したがって、疾患活動性と相関が病態および治療方針の決定の援助に関する知見を提供する候補者のバイオ マーカーを探すことが不可欠です。

マクロファージ活性化の調節不全は、GCA の発症の重要な要因です。したがって、活性化マクロファージの選択的ターゲティング GCA の治療の効果的な手段があります。葉酸受容体 β (FRB) は糖ホスファチジルイノシトールの糖タンパク質が細胞膜に固定される通常骨髄単球性白血病細胞で表され、マクロファージを活性化します。リガンド、葉酸は細胞の DNA 合成、メチル化および修理⁹を有効にその減少のフォームで必須のビタミンです。自己免疫疾患で、中の発がん、FRB の式が誘導されます。その式は、単球やリウマチ性関節炎、炎症性 M1 マクロファージの表面または抗炎症 M2 マクロファージに制限されて固形臓器や骨髄性悪性疾患^{10、11,12,13}活性化マクロファージのバイオ マーカーとして、その潜在的な役割のほか、FRB は、葉酸、antifolates またはセルで葉酸共役薬物受容体結合から始まるマルチ ステップ プロセスを介して選択的薬物輸送を有効にすることはできます。表面、内面化、リリースおよび内部の細胞機械^12,14,15,16に必要な薬物の最終的に配信が続きます。対照的に FRB 癌細胞で発現し、マクロファージを活性化、正常造血細胞で発現した FRB はバインド葉酸 FRB/葉酸を介した薬物送達が FRB 陽性炎症や癌細胞に限定されることを確保することができます。

以前の研究では、FRB は、GCA マクロファージで表される初めてのデモンストレーションを行ったし、その発現相関 CD68 + とエンドセリン受容体ベータ マクロファージを GCA 病因¹⁷に貢献。本報告で述べるは、病理組織学的、免疫組織化学的方法 FRB マクロファージを評価するために使用分析総リンパ球およびマクロファージ カウントを GCA 血管風景で FRB の位置への洞察力を得るために。

プロトコル

記載されているすべてのメソッドは、ペンシルベニア州制度検討委員会によって承認されました。

1 病理組織学的の準備、および側頭動脈生検を取得した後の処理

注:側頭動脈生検 (タブ) は、認定外科医によって局所麻酔および生殖不能の条件の下で実行されます。供試体手術より影響を受ける側に 3 cm の動脈断面を取得後、24 h のすぐにホルマリンで固定、3 〜 4 mm のセクションに分かれて、後パラフィン包埋、ブロックの組織の適切なアライメントに細心の注意を払っています。室温では保存されます。標本選択が医療記録を確認した後実行されます。診断はリウマチ 1990 基準科目が 5 ドメインの 3 を満たすことを必要とするアメリカの大学基づいて: 年齢 > 50 年、新しい頭痛、側頭動脈の圧痛、赤血球沈降速度 > Westergren 法による 50 ミリメートル/時間と異常のタブ。安全のため、保護手袋を着用する必要がありますすべての標本、化学薬品および抗体処理時します。

1. 埋め込みのブロックからミクロトームを使用して 4-5 μ m 厚いセクションをカットします。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) で染色します。品質保証のため選択した正常組織の制御] セクションを使用します。
2. 温水浴のセクションをカットのフロートは、しわを除去し、コーティングされたガラス顕微鏡スライドでピックアップに 40 ° C まで加熱します。 乾燥とセクションのスライドへの付着を容易にする 60 分の 60 ° C のオーブンで温かみのあるプレートにスライド ガラスを配置します。
3. 乾燥とセクションのスライドへの付着を容易にする 60 分の 60 ° C のオーブンで温かみのあるプレートにスライド ガラスを配置します。
4. 顕微鏡のスライドには、3 つのセクションをマウントします。
5. 垂直ラックと 37 ° C で 24 時間の一晩乾燥にスライドを配置します。
6. コンテナーと 4 ° C でストア内のスライドを配置します。

2. 免疫組織化学的準備、脱脂、抗原検索や染色^15,18,19,20

1. スライド ラックにスライドをロードします。料理を通じてラックを次のように実行: 穏やかな攪拌 10 秒撹拌で 70% エタノールに一度、10 秒間撹拌で 90% エタノールに一度、10 秒間撹拌で 100% エタノールに一度、30 秒ごとの 10 秒と 5 分間の 100% キシレンの 2 回、と 2 倍のダブルは 10 秒攪拌と H2O を蒸留します。
   注: キシレン、アセトンの取り扱いは呼吸器毒性吸入を避けるために換気フードでされるべきであります。
2. 10 ミリ モル/L、pH 6.0 クエン酸バッファー 95 ° c. に prewarmed の 200 mL のガラス容器にラックを転送することによって抗原を取得します。風呂の水で 30 分のタイマーを設定し、20 分その後 5 分間流水ですすぎで部屋の温度を冷却します。
3. 内因性ペルオキシダーゼ活性を削除するには、3% 過酸化水素の 200 mL で 10 分間インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水液 (TBSS) 200 μ L で 3 回スライドを洗います。
4. スライドをラックから取り外して、優しく余分なバッファーを消去する各 1 つを軽く押えます。染色、次の一次抗体を 200 μ l 添加のスライド カバー スリップを追加し、湿気の多い室内の室温で 1 時間インキュベートを追加します。
   反 FRB 抗体希釈 1:800
   マウスのモノクローナル抗ひと CD68、希釈 1: 200
   ウサギ ポリクローナル抗 CD3 1: 100 希釈
   注: 胎盤のホルマリン固定パラフィン切片も手順 2.1 2.9 と反 FRB18 で説明されているように処理されますされ、肯定的な制御として使用します。染色結果最適な抗体濃度を見つけることによって得られた 2 倍希釈 (1:50、1: 100, 1: 200、1: 400、1:800、1:1600) で抗体を滴定を行った.
5. インキュベーションと破棄後カバー スリップを削除します。TBSS と 2 分ごとに 3 回スライドをすすぎ、ドレインし、余分なバッファーを拭いてください。
6. ビオチン標識抗うさぎ/マウス組織抗原にバインドされている非一次抗体と反応する二次抗体二次抗体溶液 200 μ L を追加します。スライド coverslips を置き、湿気の多い室内で常温で 45 分間インキュベートします。
7. インキュベーションと破棄後カバー スリップを削除します。TBS で 2 分ごとに 3 回スライドをすすぎ、ドレインし、余分なバッファーを拭いてください。
8. ジアミノベンジジン (軽打) + 基板バッファー (イミダゾール塩酸) を 200 μ l 添加-発色システムと, 染色パターンを視覚化する 10 分間インキュベートします。10 分間、水道の流水で、TBSS で洗浄します。
9. 3 分間対比ヘマトキシリンで染色
10. スライドの表面に取り付け中の 70 μ L を適用することによって、スライドをマウントします。ゆっくりとメディアをマウントに coverslip のヒントし、所定の位置に下げると泡を作成しないように。乾燥に 24 時間を待ちます。

3. 病理組織学的および免疫組織化学 (IHC) 分析

H & E と GCA 正通常科目は、光学顕微鏡からのセクションを染色 IHC を調べます。

1. H & E 染色のセクション。
   1. 血管構築を評価し、, 中膜の線維芽細胞、平滑筋細胞、チュニカ adventitia^21,22vasa vasorum チュニカ内膜の血管内皮細胞を識別します。
   2. リンパ球とマクロファージ ・組織球浸潤、細胞過形成、内弾性板の劣化など、GCA 機能を識別します。
   3. Lymphohistiocytic 潜入を分析するには、識別し、マクロファージ、リンパ球を基準にして数を定量化します。内弾性板の破壊と住民の細胞の過形成性変化の程度を評価し、コントロールと比較します。
2. IHC のセクションを染色しました。
   1. 総免疫潜入、合計マクロファージ マーカー、抗 CD68、パンに細胞と血管の層との関係の中でその分布のタイプまたは特定のタイプによってその表現のメモを取って、FRB の染色パターンを調べるリンパ球のマーカー CD3 アンチ。
   2. 10 上積極的にステンド グラスのセルをカウントすることによって複数のランダムに選択された高出力フィールド (hpf) FRB、CD68、CD3 細胞の発現を定量化し、手段を記録します。
      注:これらの正常および病的細胞や構造の同定を行った認定心臓血管病理学者 (j. m.) とリウマチ専門医 (初級)、結果すべてのケースを記録しました。
   3. デジタル カメラを用いた代表的な画像をキャプチャします。
      注:これらのステップの後残りの因数で保存されるかもしれない-80 ° C

結果

病理組織学的所見

H & E は、チュニカ内膜、チュニカ メディアで平滑筋細胞の内皮細胞と正常標本実証正常動脈解剖学の汚れや線維芽細胞およびフィーダー船を含む異種コラーゲン マトリックス呼ばれる栄養血管で外膜。識別される炎症性浸潤はありません。GCA の肯定的な側頭動脈は、マクロファージ ・組?...

ディスカッション

GCA は、成人では、最も一般的な血管炎および病理学的特徴例証するヘルパー リンパ球の強力な組み合わせとその他の肉芽腫性疾患またはサルコイドーシスのような vasculopathies で見つけることができるもマクロファージを活性化し、肉芽腫性多発血管炎^2,3。GCA、側頭動脈には中型-大型サイズ動脈の良い表現が用意されていて、TA 生検診断新興国の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips	Fisher Scientific
Vertical rack	Fisher Scientific
Light microscope	Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water			concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta	Manohar Ratnam		optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68	Dako	M071801	optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody	Dako
Placental tissue			for FRB positive control