מחקר Immunohistopathologic פרופיל חומצה פולית קולטן בטא מקרופאג של כלי הדם Microenvironment המערכת החיסונית ב Arteritis תא ענק

Summary

הפרוטוקול מדגים את השימוש היסטופתולוגיות אימונוהיסטוכימיה לפרופיל מקרופאג בטא קולטן של חומצה פולית ועל מערכת היחסים שלה עם המערכת החיסונית בתא סכום לחדור ביופסיות מהעורק arteritis תא ענק.

Abstract

תא ענק arteritis (GCA) היא בתיווך החיסון מחלה כרונית של העורקים בגודל בינוני וגדולים המשפיעה על מבוגרים. מניפסטים GCA עם דלקת מפרקים, ריטלין סימפטומים של כאבי ראש, שבץ או חזון הפסד. מאקרופאגים לימפוציטים T-helper לחדור את הקיר וסקולרית ומפיקים תגובה פרו דלקתיים להוביל כלי נזק ו איסכמיה. נכון להיום, יש אין סמן GCA יכול לפקח המחלה פעילות ומדריך תגובה טיפולית.

חומצה פולית קולטן בטא (FRB) הוא חלבון glycosylphosphatidylinositol מעוגנים על קרום התא, בדרך כלל לידי ביטוי בשושלת myelomonocytic, ברוב המכריע של תאים לוקמיה מיאלואידית כמו גם הגידול, מקרופאגים synovial לקומה, מאיפה הביטוי שלה בקורלציה עם חומרת המחלה. היכולת של FRB כדי לאגד תרכובות חומצה פולית, חומצה פולית-conjugates וסמים antifolate הפכה אותו למטרה druggable בסרטן, מחלה דלקתית מחקר. הדו ח מתאר את histopathologic immunohistochemical ושיטות להערכת ביטוי והפצה של FRB ביחס GCAimmunopathology.

פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע מהעורק ביופסיות מ GCA ופקדים רגילה היו מוכתמים Hematoxylin ואאוזין כדי לסקור את רקמת היסטולוגיה לזהות תכונות pathognomonic. אימונוהיסטוכימיה שימש כדי לזהות ביטוי FRB, CD68 ו- CD3. ניתוח מיקרוסקופי בוצעה לכמת את מספר התאים מוכתם באופן חיובי על 10 חלקים גבוה-power-שדות נבחרים ומקומות המתאימים שלהם בדופן העורקים.

דלקת Lymphohistiocytic (LH) בליווי היפרפלזיה intimal וראו פרופריה אלסטי שיבשו ב- GCA עם אף מצאה בפקדים. לחדור LH הולחן של 60% לימפוציטים ו- 40% מקרופאגים. FRB הביטוי הוגבל מקרופאגים, הכוללת 31% מכלל CD68 + מקרופאג האוכלוסייה, לוקליזציה מדיה ו- adventitia. FRB לא נראתה בפקדים.

פרוטוקול זה הפגין דפוס ברור של macrophage FRB ביחס microenvironment המערכת החיסונית כלי הדם ב- GCA הגיאופוליטיות והמרחביות מספריים.

Introduction

תא ענק arteritis (GCA) היא מחלה דלקתית של העורקים בינוניים וגדולים, מיקוד העורקים ואת סניפיה ומשפיע מבוגרים. הוא מציג עם קלה סיבוכים איסכמיים חמורים כגון כאבי ראש, כאבים בלסת, אובדן ראייה, משיכת לבין רקמת נמק. האבחנה אושר על ידי גבוהה סמנים דלקתיים כמו שקיעת דם (ESR) ודפוס histopathologic ברור על ה מהעורק ביופסיה (הכרטיסיה)¹. GCA דלקת בכלי הדם הנפוצים ביותר למבוגרים, הנגישות של העורק הטמפורלי השיג עבור אבחון מציג יתרון על פני אחרים vasculopathies, ובכך מאפשר אחד ללמוד פתוגנזה שלה בקלות רבה יותר. הממצאים טיפוסי בכרטיסיה כוללים לחדור של מקרופאגים/histiocytes ו- T לימפוציטים שנמצאו על פני כל השכבות כלי הדם של אינטימה tunica, מדיה, adventitia עם הרס בו-זמניות של הנדן אלסטי שמפריד אלה בדרך כלל תאי². הראיות הנוכחי מדגים GCA כרוך לאנטיגן לא ידוע מפעילה תאים דנדריטים ב- adventitia כלי הדם, ואחריו הגיוס של המסייע בתאי T (ה), במיוחד Th1 ו Th17 יחוברו אשר מפרישים אינטרלוקין-17 ו אינטרפרון-גמא (והסכמות) בהתאמה. והסכמות ואז מגייס ומפעיל מקרופאגים לייצר ציטוקינים, פרוטאזות. אלה כוללים ציטוקינים פרו-דלקתיים; כולל IL-12, אשר קישור הדדי מפעיל תאי Th1 המספקות מעגל משוב חיובי; הגידול גורם לנמק ו interleukin-6, אשר לגרום דלקת מפרקים, חום, metalloproteases זה גורם נזק הנדן אלסטי. Glucocorticoids (GC), אשר מהוות את טיפול כרוני סטנדרטי, שליטה חלקית המסלולים ציטוקין מאת attenuating ה-Th17/IL-17 אבל לא Th1/והסכמות הזרוע של התגובה החיסונית^3,4. למרבה הצער, הפסקה של GC תוצאות התדרדרות המחלה. כמו מודאליות חלופית, מטוטרקסט יש כבר לשנות את ייעודו לטיפול GCA, אבל הקצה קליניים הרצוי לא עקבי הושגו למרות סמנים ביולוגיים יותר רגישים שלא נוצלו טיפולית ניטור^5,6 . ב-2017, החוסם אינטרלוקין 6, טוסיליזומב, אושרה לטיפול GCA כמו זה ביעילות הפגינו מחלות ו סטרואידים ממעט אפקטים^7,8.

נכון להיום, ישנם אין סמנים ביולוגיים טוב עבור GCA. כתוצאה מכך, קשה לעקוב אחר פעילות המחלה, titrate מינונים של תרופות זמינות כדי למנוע תופעות לוואי להפחית את הנטל של עלות לחברה. לכן, זה הכרחי כדי לחפש סמן המועמד כי בקורלציה עם פעילות המחלה, מספק תובנות הרומן על פתוגנזה וסיוע בקבלת החלטות טיפוליות.

Dysregulation של הפעלת מקרופאג הוא גורם קריטי GCA פתוגנזה. לפיכך, ייתכן אמצעי יעיל לטיפול GCA מיקוד סלקטיבי של מקרופאגים מופעל. חומצה פולית קולטן בטא (FRB) הוא גליקופרוטאין glycosyl-phosphatidylinositol זה מעוגנת על קרום התא הביע בתאים myelomonocytic נורמלי, תאים לוקמיה מיאלואידית ומופעל מקרופאגים. ליגנד שלה, חומצה פולית, היא ויטמין חיוני בצורתו מופחתת, המאפשרת הסלולר DNA סינתזה, מתילציה ותיקון⁹. FRB ביטוי מושרה במחלות אוטואימוניות, ובמהלך carcinogenesis. הביטוי שלה היא מוגבלת השטח של monocytes או הפרו דלקתיים מקרופאגים M1 ב דלקת מפרקים שגרונית, או אנטי-דלקתי M2 מקרופאגים מוצק איברים, ממאירות מיאלואידית^{10,11,12 , 13}. בנוסף לתפקידה פוטנציאלי כמו סמן של מקרופאגים מופעל, FRB יכול לאפשר תחבורה סלקטיבית סמים thru תהליך רב שלבי שמתחיל עם האיגוד קולטן חומצה פולית, antifolates או מצומדת חומצה פולית סמים מהתא על פני השטח, ואחריו הפנמה, שחרור, בסופו של דבר מסירת הסם הרצוי ה תא פנימי מכונות^12,14,15,16. בניגוד ל FRB לידי ביטוי תאים סרטניים ומופעל מקרופאגים, FRB לידי ביטוי תאים נורמליים hematopoietic הוא אפשרות לבצע איגוד folates ובכך מבטיחה כי FRB/חומצה פולית-מתווכת משלוח סמים הוא מוגבל FRB-חיוביות דלקתית או תאים סרטניים.

במחקר הקודם שלנו, להדגים בפעם הראשונה FRB מתבטאת GCA מקרופאגים, הביטוי שלה בקורלציה עם CD68 +, endothelin קולטן בטא מקרופאגים, אשר תורמים GCA פתוגנזה¹⁷. בדו ח זה, אנו מתארים את histopathological ואת immunohistochemical שיטות להערכת macrophage FRB את, וניתח את לימפוציט הכולל וסופרת מקרופאג כדי לזכות בתובנה מיקום של FRB בתוך הנוף GCA כלי הדם.

Protocol

כל השיטות המתוארות אושרו על ידי ועדת הבדיקה פן מוסדיים המדינה.

1. histopathological הכנה, עיבוד לאחר קבלת מהעורק ביופסיה

הערה: מהעורק ביופסיה (הכרטיסיה) מבוצע תחת הרדמה מקומית, בתנאים סטריליים על-ידי מנתח מוסמך. לאחר קבלת בניתוח מקטע עורקי 3 ס מ בצד המושפע יותר, הדגימה קבוע בפורמלין מיד במשך 24 שעות ביממה, מחולק למקטעים של 3-4 מ מ, והוא מוטבע, משלם תשומת-לב רבה יישור תקין של רקמות בבלוק פרפין אשר מאוחסנת לאחר מכן בטמפרטורת החדר. הבחירה הדגימה מבוצעת לאחר אימות הרפואיים. האבחנה מבוססת על המכללה האמריקאית של 1990 ראומטולוגיה קריטריונים אשר דורשת כי הנבדקים למלא 3 של 5 תחומים: גיל > 50 שנה, כאב ראש חדש, רוך בעורק הרקה, שקיעת דם של > 50 מ מ/שעה בשיטה Westergren, טאב חריג. בטיחות, כפפות מגן חובה לחבוש בכל עת בעת טיפול דגימות, כימיקלים נוגדנים.

1. מבלוקים מוטבע, חותכים 4-5 מיקרומטר עבה למקטעים באמצעות מיקרוטום. הכתם ועם Hematoxylin אאוזין (H & E). השתמש מקטע בקרה של הרקמות שנבחר עבור אבטחת איכות.
2. לצוף לחתוך קטעים על אמבט מים חמים מחומם עד 40 ° C כדי להסיר קמטים לאסוף עם מגלשת מיקרוסקופיים מצופה זכוכית.  במקום שקופיות זכוכית על צלחת חמה בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות להקל על ייבוש תוך היצמדות של מקטע לשקופית.
3. במקום שקופיות זכוכית על צלחת חמה בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות להקל על ייבוש תוך היצמדות של מקטע לשקופית.
4. הר 3 סעיפים על שקופיות מיקרוסקופ.
5. המקום בשקופיות אנכי לארון תקשורת ויבש בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
6. למקם את השקופיות מכולות וחנות ב 4 º C.

2. Immunohistochemical הכנה, Dewaxing, אחזור אנטיגן, צביעת^15,18,19,20

1. לטעון מגלשות לתוך ארון תקשורת שקופית. להפעיל את המדף דרך מנות כדלקמן: פעמיים ב- 100% קסילן למשך 5 דקות עם 10 שניות של עצבנות עדין כל 30 שניות, פעם ב 100% אתנול עם 10 שניות עצבנות, פעם ב- 90% אתנול עם 10 שניות עצבנות, פעם ב- 70% אתנול עם 10 שניות עצבנות , פעמיים בתוך זוגיות מזוקק H2O עם 10 שניות עצבנות.
   הערה: טיפול של קסילן, אצטון צריך להיעשות בברדסים מאוורר כדי למנוע שאיפת ורעילות בדרכי הנשימה.
2. לאחזר אנטיגן על-ידי העברת ארון התקשורת לתוך מיכל הזכוכית עם 200 מיליליטר 10 mmol/L, pH ציטראט 6.0 מאגר prewarmed עד 95 מעלות צלזיוס. את הטיימר ל-30 דקות באמבט מים, ואז להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים זורמים במשך 5 דקות.
3. הסר peroxidase אנדוגני פעילות על ידי המקננת ב 200 מ של 3% מי חמצן למשך 10 דקות. רחץ שקופיות 3 פעמים ב- µL 200 תמיסת באגירה טריס (TBSS).
4. הסר את השקופיות מהמדף, כי אמחה קלות כל אחד בעדינות לנגב מאגר עודף. עבור צביעת, הוסף 200 µL של הנוגדנים הראשית הבאה, להוסיף שער גולשת בשקופיות, דגירה בחדר לחים למשך שעה בטמפרטורת החדר:
   נוגדן anti-FRB מדולל 1:800
   העכבר monoclonal האנטי-האדם CD68, 1:200 דילול
   ארנב polyclonal anti-CD3 מטריים דילול
   הערה: פורמלין-קבוע קטעים פרפין-מוטבע של השליה היו גם מעובד כפי שמתואר בספר 2.1 מדרגות 2.9, מודגרות עם אנטי-FRB18, משמש בקרה חיובית. צביעת התוצאות התקבלו על ידי מציאת ריכוז נוגדן אופטימלית, בוצע על ידי titrating הנוגדן ב דילולים זוגי (למשל 1:50 מטריים, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
5. הסר את מכסה לאחר דגירה של ביטול. שקופיות 3 פעמים במשך 2 דקות כל אחד עם TBSS, ניקוז ושטפו מאגר עודף.
6. להוסיף 200 µL של נוגדנים משניים, לאודנום biotinylated אנטי-Rabbit/עכבר נוגדנים משניים להגיב עם unconjugated נוגדן ראשוני מאוגדים רקמות אנטיגן. מקם coverslips בשקופיות ולאחר תקופת דגירה בחדר לחים של 45 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הסר את מכסה לאחר דגירה של ביטול. שקופיות 3 פעמים במשך 2 דקות כל אחד עם TBS, לנקז ושטפו מאגר עודף.
8. להוסיף 200 µL של diaminobenzidine (DAB) + מאגר המצע (Imidazole HCl)-chromogen מערכת דגירה ל-10 דקות להמחיש מכתים דפוס. לשטוף עם TBSS אז במים מהברז זורמים במשך 10 דקות.
9. Counterstain עם hematoxylin במשך 3 דקות.
10. הר השקופיות על-ידי החלת µL 70 של הרכבה בינונית על פני השטח של השקופית. לאט לאט עצה את coverslip אל המדיום הרכבה, הימנע מיצירת בועות כפי שאתה להנמיך אותו למקומו. המתן 24 שעות לייבוש.

3. histopathologic וניתוח Immunohistochemical (IHC)

לבחון את H & E ו- IHC צבעונית קטעים מן GCA חיובי ונורמלי הנבדקים באמצעות מיקרוסקופ אור.

1. עבור H & E צבעונית סעיפים:
   1. להעריך את הארכיטקטורה וסקולרית ולזהות תאי אנדותל אינטימה tunica, תאי שריר חלק tunica מדיה, ו fibroblasts ואת ואזא וזורום tunica adventitia^21,22.
   2. לזהות תכונות GCA, אשר כוללים לימפוציטים, הסתננות מקרופאג/histiocyte, היפרפלזיה הסלולר והשפלות פרופריה אלסטית פנימית.
   3. לנתח לחדור lymphohistiocytic ידי בזיהוי וכימות המספר של מקרופאגים ביחס לימפוציטים. להעריך את מידת ההפרעה פרופריה אלסטית פנימית ושינויים hyperplastic בתאים תושב ולהשוות עם פקדים.
2. עבור IHC צבעונית סעיפים:
   1. לבחון את דפוס ההגדלה של FRB, לוקח הערה של הביטוי שלה על-ידי סוג מסוים או סוגים של תאים בתוך הרבדים כלי הדם ועל מערכת היחסים שלה כדי לחדור המערכת החיסונית הכולל, דה מרקר מקרופאג הכולל, anti-CD68 למחבת לימפוציט סמן אנטי CD3.
   2. לכמת הביטוי של תאים FRB, CD68 ו- CD3 על ידי ספירת התאים מוכתם באופן חיובי על 10 שדות שנבחרו באקראי מתח גבוה מרובים (hpf) והקלט את האמצעים.
      הערה: זיהוי של תאים נורמליים ופיפטות ומבנים אלה בוצעו על ידי פתולוג מוסמך לב וכלי דם (קיבלתן), rheumatologist (אמ מ) והתוצאות נרשמו כל המקרים.
   3. לכידת תמונות נציג באמצעות מצלמה דיגיטלית.
      הערה: לאחר שלבים אלה, שנותרו aliquots ניתן לאחסן ב- 80 ° c

תוצאות

ממצאים histopathologic

H & E כתמי באנטומיה עורקי נורמלי והפגינו דגימות נורמלי עם תאי אנדותל אינטימה tunica, תאי שריר חלק בתקשורת tunica, וקרא מטריצה קולגן heterogenous הכוללים fibroblasts וכלי מזין ואזא וזורום ב- adventitia tunica. יש לחדור דלקתיות לא מזוהה. העורק?...

Discussion

GCA וסקוליטיס הנפוצות ביותר אצל מבוגרים, והוא סימן ההיכר פיפטות שלה מדגימה שילוב חזק של לימפוציטים מסוג T helper ומופעל מקרופאגים שניתן למצוא גם מחלות גרגירומת ממושכת או vasculopathies כמו סרקואידוזיס אחרים, ^2,polyangiitis גרגירומת ממושכת³. ב- GCA, העורק הטמפורלי מספק ייצוג טו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips	Fisher Scientific
Vertical rack	Fisher Scientific
Light microscope	Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water			concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta	Manohar Ratnam		optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68	Dako	M071801	optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody	Dako
Placental tissue			for FRB positive control