JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol histopatolojik tetkik ve folat reseptör beta makrofaj ve toplam bağışıklık hücre ilişki içinde dev hücreli arterit temporal arter biyopsisi sızmak profiline immünhistokimya kullanımını göstermektedir.

Özet

Dev hücreli arterit (GCA) büyük yetişkin etkileyen kronik immün aracılı orta-büyük ölçekli arterlerin bir hastalıktır. GCA bildirimleri artrit ve tıkayıcı belirtiler baş ağrısı, kontur veya vizyon kaybı. Makrofajlar ve T-helper lenfositler vasküler duvar sızmak ve gemi hasar ve iskemi neden bir pro-inflamatuar yanıt üretmek. Bugüne kadar hastalık aktivite ve Kılavuzu terapötik yanıt izleyebilirsiniz hiçbir GCA biyomarker olduğunu.

Folat reseptör beta (FRB) hücre zarı üzerinde bağlantılı ve normalde myelomonocytic soy ve myeloid lösemi hücreleri de tümör ve romatoid sinovyal makrofajlar gibi çoğunluğu ifade bir glycosylphosphatidylinositol proteindir, nerede ifadesini hastalık şiddeti ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. FRB folat bileşikleri, folik asit conjugates ve antifolate ilaçlar bağlama yeteneği o kanser ve inflamatuar hastalıkları araştırma druggable bir hedef yaptı. Bu rapor ifade ve GCAimmunopathology ile ilgili olarak FRB dağılımı değerlendirmek için kullanılan histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri açıklar.

Formalin sabit ve parafin gömülü temporal arter biyopsisi GCA ve normal denetimlerin Hematoksilen ve eozin ile doku histolojisi gözden geçirin ve patognomonik olan özellikleri bulmak için lekeli. İmmünhistokimya FRB, CD68 ve CD3 ifade algılamak için kullanıldı. Mikroskopik analiz 10 seçilen yüksek power alanlı bölümler ve ilgili konumlarını arteryel duvardaki olumlu lekeli hücre sayısı ölçmek için gerçekleştirildi.

İntimal hiperplazi tarafından Lymphohistiocytic (LH) inflamasyon eşlik ve kesintiye elastik lamina GCA içinde yok denetimlerde bulunamadı ile görüldü. LH infiltrat yaklaşık % 60 lenfositler ve % 40 makrofajlar oluşmaktadır. FRB ifade toplam CD68 + makrofaj nüfusunun % 31'i oluşan ve medya ve adventitia için yerelleştirilmiş makrofajlar, sınırlı. Hiçbir FRB denetimlerde görüldü.

Bu iletişim kuralı FRB makrofaj vasküler bağışıklık microenvironment GCA içinde göre farklı sayısal ve kayma örnek gösterdi.

Giriş

Dev hücreli arterit (GCA) orta büyük arter, aorta ve dalları hedefleme ve eski yetişkin etkileyen iltihabi bir hastalıktır. Hafif baş ağrısı, çene ağrısı, görme kaybı, kontur ve doku kangren gibi ağır iskemik komplikasyonlara sunar. Tanı eritrosit sedimantasyon hızı (ESR) ve farklı bir histopatolojik desen temporal arter biyopsisi (sekmesi)1gibi yüksek inflamatuar işaretleri tarafından onaylanır. GCA en yaygın yetişkin vaskülit ve tanı için elde edilen temporal arter erişilebilirliğini böylece bir daha kolay onun patogenezi okumaya etkinleştirme diğer vasculopathies üzerinde bir avantaj sunuyor. Tipik bulguları sekmesinde bir infiltrat makrofajlar/histiyosit ve normalde bunlar ayıran elastik lamina eşzamanlı imha ile tunica intima, medya ve adventitia tüm vasküler katmanları arasında bulunan T lenfosit içerir bölmeleri2. Geçerli kanıt GCA vasküler adventitia dendritik hücrelerde etkinleştirir bilinmeyen bir antijen içerdiğini gösterir, yardımcı işe alma tarafından takip T (Th) hücreleri, hangi interlökin-17 salgılar özellikle Th1 ve Th17 alt türlerini ve interferon-gamma (IFG) anılan sıraya göre. IFG sonra acemi ve makrofajlar sitokinler ve proteaz üretmek için etkinleştirir. Bunlar pro-inflamatuar sitokinlerin karşılıklı Th1 hücre böylece pozitif geribesleme sağlamak etkinleştirir IL-12 de dahil olmak üzere; tümör nekroz faktör ve interlökin-6, artrit ve ateş ve metalloproteases neden elastik lamina zarar verebilir. Standart kronik tedavi oluşturan sebepler (GC), kısmen Th17/IL-17 ama değil Th1/bag kol bağışıklık yanıtı3,4inceltiyorum sitokin yolları kontrol. Ne yazık ki, GC kesilmesi hastalığın nüks içinde sonuçlanır. Alternatif bir yöntem olarak metotreksat GCA tedavisinde repurposed ama daha duyarlı biyolojik tedavi izleme5için,6 kullanılmıştır değil, ancak istenen klinik bitiş noktaları sürekli olarak elde edildi değil . Hastalık kontrol ve steroid etkileri7,8tutumlu etkili bir şekilde gösterildiği gibi 2017 yılında, interlökin 6 kütük parçası, tocilizumab, GCA tedavisi için onaylanmıştır.

Bugüne kadar hiçbir iyi biyolojik GCA için vardır. Sonuç olarak, hastalık etkinliğini izlemek ve yan etkileri önlemek ve topluma maliyet yükü azaltmak için kullanılabilir uyuşturucu doz titre zordur. Böylece, bir aday biyomarker hastalık aktivitesi ile ilişkilendirir sağlamak yeni anlayışlar patogenez ve tedavi edici kararlar yardım aramak için zorunludur.

Makrofaj harekete geçirmek bozukluk GCA patogenezinde önemli bir faktördür. Böylece, GCA tedavi için etkili bir yol aktif makrofajlar seçici hedefleme olabilir. Folat reseptör beta (FRB) hücre membran üzerinde bağlantılı bir glikosil-phosphatidylinositol glikoprotein ifade normal myelomonocytic hücrelerde, myeloid lösemi hücreleri ve makrofajlar harekete geçirmek olduğunu. Onun ligand, folik asit, hücresel DNA sentezi, metilasyonu ve onarım9sağlar onun azaltılmış formundaki gerekli bir vitamindir. FRB ifade otoimmün hastalığı ve karsinojenezis sırasında indüklenen. İfadesini solid organ ve myeloid maligniteler10,11,12 monosit veya pro-inflamatuar M1 makrofajlar Romatoid Artritte yüzeyine veya anti-inflamatuar M2 makrofajlar sınırlıdır , 13. bir biyomarker aktif makrofajlar gibi potansiyel rolüne ek olarak, FRB seçici uyuşturucu taşıma başlatmak için folik asit, antifolates veya folat Birleşik ilaçlar hücre reseptör bağlama ile bir çok adımlı işlem aracılığıyla etkinleştirebilirsiniz yüzey, ardından içselleştirilmesi, yayın ve istenen uyuşturucu nihai teslimat iç hücre makine12,14,15,16. Aksine FRB kanser hücrelerinde ifade ve makrofajlar aktif, normal hematopoetik hücrelerin içinde ifade FRB böylece FRB/folat-aracılı ilaç dağıtım FRB pozitif enflamatuar veya kanser hücrelerinin sınırlıdır sağlanması folates bağlamak yapamaz.

Bizim önceki çalışmada FRB GCA makrofajlar içinde ifade edilir ilk kez gösterdi ve ifadesini CD68 + ve endotelin reseptör beta makrofajlar, GCA Patogenez17' ye katkıda korelasyon. Bu raporda, tarif biz histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri FRB makrofaj değerlendirmek için kullanılan ve toplam lenfosit analiz ve makrofaj GCA vasküler manzara FRB'ın bulunduğu bir anlayış kazanmak için sayar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak Penn State kurumsal İnceleme Kurulu tarafından kabul edildi.

1. histopatolojik hazırlık ve Temporal arter biyopsi alma sonra işleme

Not: Temporal arter biyopsisi (sekmesi) lokal anestezi ve steril koşullarda sertifikalı bir cerrah tarafından gerçekleştirilir. Cerrahi olarak 3 cm arteryel kısım daha etkilenen tarafta elde ettikten sonra numune formalin 24 h için hemen sabit, 3-4 mm bölümlere ayrılmış ve parafin blok dokusunun doğru hizalaması dikkatli dikkat, gömülü olan daha sonra oda sıcaklığında depolanır. Örnek seçimi tıbbi kayıtları doğruladıktan sonra gerçekleştirilir. Tanı Amerikan konular 3 5 etki alanlarının yerine getirmek gerektiren Koleji üzerinde Romatoloji 1990 kriterlerinin dayanmaktadır: Yaş > 50 yıl, yeni baş ağrısı, temporal arter hassasiyet, eritrosit sedimentasyon hızı > 50 mm/saat Westergren yöntemi tarafından ve anormal bir sekme. Güvenliğiniz için koruyucu eldiven giymiş her zaman numuneler, kimyasallar ve antikorlar işlerken.

  1. Gömülü bloklardan bir microtome kullanma 4-5 µm kalınlığında bölümlerine kesti. ve hematoksilen eozin (H & E) ile leke. Seçili normal doku denetim bölümünü kalite güvencesi için kullanın.
  2. Kırışıklıkların kaldırmak ve kaplamalı cam mikroskobik slayt ile almak için 40 ° c sıcak su banyosu bölümlerde kesmek float ısıtmalı.  Cam slaytlar kurutma ve slayt bölümünün bağlılık kolaylaştırmak 60 dakika 60 ° C fırında sıcak bir tabak yerleştirin.
  3. Cam slaytlar kurutma ve slayt bölümünün bağlılık kolaylaştırmak 60 dakika 60 ° C fırında sıcak bir tabak yerleştirin.
  4. 3 bölümden mikroskop slaytlarda bağlayın.
  5. Slaytları dikey raf ve 37 ° C'de kuru gece 24 h için yerleştirin.
  6. Bir konteyner ve mağaza 4 ° C'de slaytlar yeri

2. immunohistokimyasal hazırlık, mum eritme, antijen alma ve15,18,19,20 boyama

  1. Slaytları bir slayt raf yükleyin. Raf yemekleri ile aşağıdaki gibi çalıştırın: % 100 ksilen nazik ajitasyon her 30 saniyede, bir kez bir kez bir kez 10 saniye ajitasyon ile % 70 etanol içinde 10 saniye ajitasyon ile % 90 etanol içinde 10 saniye ajitasyon ile % 100 etanol 10 saniye ile 5 dakika içinde iki kere , ve iki kez içinde çift distile H2O 10 saniye ajitasyon ile.
    Not: Ksilen ve aseton taşıma havalandırılmış davlumbaz inhalasyon ve solunum toksisite önlemek için yapılmalıdır.
  2. Bir cam kaba 10 mmol/L, pH 6,0 sitrat arabellek 95 ° C'ye prewarmed 200 mL ile raf aktararak antijen almak Su banyosunda 30 dakika çekim ayarlayın, sonra oda sıcaklığında 20 dakika sonra 5 dakika boyunca akan su ile durulama için serin.
  3. Endojen peroksidaz aktivitesi 10 dakika boyunca 200 mL %3 hidrojen peroksit kuluçka tarafından kaldırın. Slaytlar tuzlu çözüm (TBSS) Tris tamponlanmış 200 µL içinde 3 kez yıkayın.
  4. Slaytlar rafa kaldırmak ve her birine aşırı arabellek hafifçe silin kurulamak. Boyama için aşağıdaki birincil antikorların 200 µL slaytlarda kapak irsaliyeleri eklemek ve nemli bir odası, oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya ekleyin:
    1:800 Anti-FRB antikor seyreltilmiş
    Monoklonal fare anti-insan CD68, 1: 200 seyreltme
    Poliklonal tavşan anti-CD3 1: 100 seyreltme
    Not: Parafin gömülü bölümleri plasenta Formalin sabit Ayrıca adımlar 2,1 2,9 ve anti-FRB18 ile inkübe özetlenen işlenen ve pozitif kontrol olarak kullanılan. Boyama sonuçları en iyi antikor konsantrasyon bularak elde edilmiştir ve çift dilutions (1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600) antikor titrating tarafından gerçekleştirildi.
  5. Kapak notu kuluçka ve atma sonra kaldırın. TBSS ile her 1 dakika için 3 kez slaytlar durulama, drenaj ve aşırı arabellek silin.
  6. 200 µL çekimsiz birincil antikor bağlı doku antijen ile tepki biotinylated Rabbit/fare ikincil antikor içeren ikincil antikor çözüm ekleyin. Coverslips slaytlar üzerine yerleştirin ve nemli bir odasında 45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  7. Kapak notu kuluçka ve atma sonra kaldırın. TBS ile her 1 dakika için 3 kez slaytlar durulama, drenaj ve aşırı arabellek silin.
  8. Diaminobenzidine (DAB) + substrat arabellek (Imidazole HCl) 200 µL eklemek-Kromojen sistem ve desen boyama görselleştirmek için 10 dakika için kuluçkaya. TBSS ile sonra 10 dakika için musluk suyu çalışan yıkayın.
  9. Hematoksilen ile 3 dakika counterstain.
  10. Slaytları Slayt yüzeye montaj orta 70 µL uygulayarak bağlayın. Yavaş yavaş coverslip üzerine montaj orta uç ve yerine düşürdükçe kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Kuru için 24 saat bekleyin.

3. histopatolojik ve immunohistokimyasal (IHC) analiz

H & E ve hafif bir mikroskop kullanarak GCA olumlu ve normal konular bölümlerden lekeli IHC inceleyin.

  1. H & E için bölümler lekeli:
    1. Vasküler mimari değerlendirmek ve tunica intima düz kas hücrelerinde tunica medya ve fibroblast ve vasa vasorum tunica adventitia21,22endotel hücrelerine tanımlar.
    2. Lenfosit, makrofaj/histiocyte infiltrasyon, hücresel hiperplazi ve iç elastik lamina bozulması içermektedir GCA özellikleri tanımlayın.
    3. Belirlenmesi ve makrofajlar göre lenfosit sayısı miktarının lymphohistiocytic infiltrat analiz. İç elastik lamina bozulma ve yerleşik hücre hyperplastic değişiklikler değerlendirmek ve kontrolleri ile karşılaştırın.
  2. Bölümler lekeli IHC için:
    1. FRB toplam bağışıklık infiltrat, toplam makrofaj marker, anti-CD68 ve pan onun ifade belirli bir tip veya hücreleri ve vasküler katmanları ve ilişki içinde dağıtım türleri tarafından not alma, boyama desen incelemek lenfosit marker CD3 anti.
    2. Ifade FRB, CD68 ve CD3 hücre 10 olumlu lekeli hücreleri sayarak birden fazla rasgele seçilen yüksek güç alanı (hpf) ölçmek ve kayıt anlamına gelir.
      Not: Bu normal ve patolojik hücre ve yapıları sertifikalı kardiyovasküler patolog (J.M.) tarafından gerçekleştirilen ve romatolog (S.A.A.) ve sonuçları tüm durumlar için kaydedildi.
    3. Bir dijital kamera ile temsilcisi çekim.
      Not: Bu adımlardan sonra aliquots kalan-80 ° C'de depolanmış olabilir

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Histopatolojik bulgular

H & E normal örnekler gösterdi normal damar anatomi içinde tunica intima, düz kas hücreleri tunica ortamda, endotel hücreleri ile lekeleri ve fibroblast ve besleyici damarları içeren bir hànzú kollajen matris vasa vasorum denilen tunica adventitia. Tanımlanan hiçbir enflamatuar infiltrat vardır. GCA olumlu temporal arter orta şiddetli inflamasyon Toplamları makrofajlar/hist...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

GCA erişkinlerde en sık görülen vaskülit ve onun patolojik hallmark T helper lenfositler güçlü bir kombinasyon örneğidir ve ayrıca diğer granülomatöz hastalıkların ya da sarkoidoz gibi vasculopathies bulunabilir makrofajlar aktif ve granülomatöz polyangiitis2,3. GCA, temporal arter orta-büyük ölçekli arter iyi bir gösterimini sağlar ve böylece ortaya çıkan tanı rolleri çalışma için fırsatlar yaratmak için yıl, parafin blok için...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Dr. Douglas merdiven, Marianne Klinger, Ann Benko, bölünme, Romatoloji/bölümü tıp ve moleküler ve histopatolojik çekirdek laboratuvar, Penn State Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hershey PA de desteğiyle mümkün yapıldı

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
MicrotomeReichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slipsFisher Scientific 
Vertical rackFisher Scientific 
Light microscopeOlympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled waterconcentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS) Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting MediumFisher Scientific SP-15-100
Harleco Gill's III HematoxylinFiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock SolutionFisher Scientific 23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta Manohar Ratnamoptimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68Dako M071801optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3Agilent DakoA0452optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibodyDako
Placental tissue for FRB positive control

Referanslar

  1. Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
  2. Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
  3. Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
  4. Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
  5. Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
  6. Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
  7. Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
  8. Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63(2017).
  9. Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
  10. Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
  11. Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
  12. Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
  13. Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
  14. Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
  15. vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
  16. Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
  17. Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
  18. Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
  19. Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
  20. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13(2008).
  21. Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
  22. Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
  23. Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
  24. Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
  25. Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
  26. Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 144imm nhistokimyafolat resept r beta makrofajdev h creli arteritvask litba kl k microenvironmenttemporal arter biyopsisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır