Um estudo de Immunohistopathologic de perfil o folato receptores Beta macrófago e Vascular microambiente imune na arterite de células gigantes

Resumo

O protocolo ilustra o uso do exame histopatológico e imuno-histoquímica para perfil o macrófago de beta de receptor de folato e sua relação com a célula total imune infiltrar-se na biópsia da artéria temporal na arterite de células gigantes.

Resumo

Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença crónica, imune-mediada das artérias de tamanhos médio para grande afeta adultos mais velhos. GCA manifestos com artrite e oclusivos sintomas de dores de cabeça, derrame ou perda de visão. Macrófagos e linfócitos T-helper infiltrar a parede vascular e produzem uma resposta pro-inflamatórios que levam a lesão vascular e isquemia. Até à data, não há nenhum biomarcador de GCA que pode monitorar a resposta terapêutica guia e atividade de doença.

Beta de receptor de folato (FRB) é uma proteína de glicosilfostidilinosiol que está ancorada na membrana celular e normalmente expresso na linhagem mielomonocítica e na maioria das células de leucemia mieloide, bem como no tumor e macrófagos sinoviais reumatoides, onde sua expressão se correlaciona com a severidade da doença. A capacidade de FRB vincular compostos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados e drogas antifolate tornou um alvo druggable na pesquisa de doenças inflamatórias e câncer. Este relatório descreve os métodos de histopatológico e imuno-histoquímicos utilizados para avaliar a expressão e a distribuição de FRB em relação GCAimmunopathology.

Biópsias de artéria temporal fixada em formol e parafina do GCA e controles normais foram coradas com hematoxilina e eosina, para rever a histologia do tecido e identificar características patognomônicas. Imuno-histoquímica foi usado para detectar a expressão FRB, CD68 e CD3. Uma análise microscópica foi realizada para quantificar o número de células coradas positivamente em 10 seções selecionadas do elevado-poder-campo e seus respectivos locais na parede arterial.

Inflamação Lymphohistiocytic (LH) acompanhado por hiperplasia da íntima e lâmina elástica interrompida foi vista em GCA com nenhum encontrado nos controles. O infiltrado de LH foi composto de aproximadamente 60% macrófagos linfócitos e 40%. FRB expressão era restrito aos macrófagos, composto por 31% da população de macrófagos CD68 + total e localizado para a mídia e adventícia. Não FRB foi visto em controles.

Este protocolo demonstrou um padrão distinto de numérico e espacial do macrófago FRB em relação o microambiente imune vascular em GCA.

Introdução

Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença inflamatória das artérias de médio a grande, visando a aorta e seus ramos e afetando adultos mais velhos. Apresenta-se com leve a graves complicações isquêmicas, tais como dores de cabeça, dor no maxilar, perda de visão, acidente vascular cerebral e tecido gangrena. O diagnóstico é confirmado pela altos marcadores inflamatórios como taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR) e um padrão distinto de histopatológico na artéria temporal biópsia (TAB)¹. GCA é a vasculite mais comum de adulta e a acessibilidade da artéria temporal obtida para o diagnóstico apresenta uma vantagem sobre outros vasculopathies, permitindo que se estude a sua patogênese mais prontamente. Os achados típicos na guia incluem um infiltrado de histiócitos/macrófagos e linfócitos T, encontrados em todas as camadas vasculares da túnica íntima, mídia e adventícia com simultânea destruição da lâmina elástica que normalmente separa estas compartimentos². A evidência atual demonstra que o GCA envolve um antígeno desconhecido que ativa as células dendríticas no adventitia vascular, seguido pelo recrutamento de auxiliar células T (Th), especificamente Th1 e Th17 subtipos que secretam Interleucina-17 e interferon-gama (IFG) respectivamente. IFG então recrutas e ativa macrófagos a produzir citocinas e proteases. Estes incluem citocinas pró-inflamatórias; incluindo a IL-12, que reciprocamente, ativa as células Th1, proporcionando assim uma retroalimentação positiva; fator de necrose tumoral e interleucina-6, que causam artrite e febres e metaloproteases que danificam a lâmina elástica. Glicocorticoides (GC), que constituem a padrão terapêutica crónica, parcialmente controlam as vias de citocina, atenuando o Th17/IL-17, mas não o braço de Th1/IFG da resposta imune^3,4. Infelizmente, a descontinuação do GC resulta em recaída da doença. Como uma modalidade alternativa, metotrexato tem foi realocado para o tratamento de GCA, mas os pontos de extremidade clínicos desejados não foram consistentemente alcançados, embora mais sensíveis biomarcadores não tenham sido utilizados para terapêutica monitoramento^5,6 . Em 2017, o bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, foi aprovado para o tratamento de GCA como demonstrou efetivamente o controle de doença e esteroide poupadores efeitos^7,8.

Até à data, não há nenhuma boas biomarcadores para GCA. Como resultado, é difícil monitorar a atividade da doença e titula-se doses de drogas disponíveis para evitar efeitos adversos e reduzir a carga de custos para a sociedade. Assim, é imperativo para procurar um biomarcador de candidato que correlaciona-se com atividade de doença, fornecem introspecções novela na patogênese e ajuda nas decisões terapêuticas.

A desregulação da ativação de macrófagos é um fator crítico na patogênese do GCA. Assim, um meio eficaz de tratar a GCA pode ser a seleção de alvos de macrófagos ativados. O beta de receptor de folato (FRB) é uma glicoproteína glycosyl-fosfatidilinositol que está ancorada na membrana celular expressos nas células mielomonocítica normal, as células de leucemia mieloide e ativados macrófagos. Seu ligante, ácido fólico, é uma vitamina essencial na sua forma reduzida, o que permite que celulares DNA síntese, metilação e reparação⁹. Expressão de FRB é induzida em doença auto-imune e durante a carcinogênese. Sua expressão é restrito à superfície de monócitos ou pró-inflamatórias macrófagos M1 na artrite reumatoide, ou aos anti-inflamatórios M2 de macrófagos em órgãos sólidos e neoplasias mieloides^{10,11,12 , 13}. além de seu papel potencial como um biomarcador de macrófagos ativados, a FRB pode habilitar o transporte seletivo de drogas através de um processo de várias etapa que começa com a ligação ao receptor de ácido fólico, antifolates ou drogas conjugada com ácido fólico na célula superfície, seguido de interiorização, lançamento e eventual entrega de droga desejada para a célula interna máquinas^12,14,15,16. Em contraste com a FRB expressa em células cancerosas e ativados macrófagos, FRB, expressa em células hematopoiéticas normais é incapaz de vincular folatos, assegurando que entrega de droga FRB/ácido fólico-mediada é limitada a FRB-positivo inflamatória ou células cancerosas.

Em nosso estudo anterior, temos demonstrado pela primeira vez FRB é expressa em macrófagos GCA e sua expressão correlacionados com CD68 + e endotelina macrófagos de beta do receptor, que contribuem para a patogênese de GCA¹⁷. Neste relatório, descrevemos o histopatológico e imuno-histoquímica métodos utilizados para avaliar o macrófago FRB e analisaram os linfócitos totais e macrófago conta ganhar a introspecção em posição a FRB na paisagem vascular GCA.

Protocolo

Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional estado de Penn.

1. histopatológica preparação, processamento e após a obtenção de biópsia da artéria Temporal

Nota: A biópsia da artéria temporal (TAB) é realizada sob anestesia local e condições estéreis por um cirurgião certificado. Depois de obter cirurgicamente uma seção arterial de 3 cm no lado mais afetado, o espécime é fixado em formalina imediatamente por 24 h, dividido em seções de 3 a 4 mm e incorporado em parafina, pagando a atenção cuidadosa para o alinhamento adequado do tecido no bloco que é então armazenado em temperatura ambiente. Seleção de amostra é realizada após verificar os registros médicos. O diagnóstico baseia-se na American College of Rheumatology 1990 critérios que requer que indivíduos cumpram 3 dos 5 domínios: idade > 50 anos, Nova dor de cabeça, sensibilidade da artéria temporal, uma taxa de sedimentação de eritrócitos > 50 mm/hora pelo método de Westergren e um guia de anormal. Para segurança, luvas de proteção devem ser usadas em todos os momentos quando manusear as amostras, produtos químicos e anticorpos.

1. Dos blocos incorporados, 4-5 µm espessura seções usando um micrótomo de corte. e mancha com hematoxilina e eosina (H & E). Use uma seção de controle de tecido normal selecionado para a garantia da qualidade.
2. Flutuador cortar seções sobre um banho de água quente aquecida a 40 ° C para remover rugas e pegar com um slide microscópicas de vidro revestido.  Coloque as lâminas de vidro em um prato quente em um forno de 60 ° C por 60 minutos facilitar a secagem e a aderência da seção para o slide.
3. Coloque as lâminas de vidro em um prato quente em um forno de 60 ° C por 60 minutos facilitar a secagem e a aderência da seção para o slide.
4. Monte 3 seções em corrediças do microscópio.
5. Coloque slides em um rack vertical e secar durante a noite a 37 ° C por 24 h.
6. Coloque slides em um recipiente e em 4 ° C.

2. imuno-histoquímica preparação, desparafinagem, recuperação do antígeno e coloração^15,18,19,20

1. Carregar slides em um rack de slide. Execute o rack através de pratos como segue: duas vezes em xilol 100% por 5 minutos com 10 segundos de agitação suave em 30 segundos, uma vez em 100% de etanol com agitação de 10 segundos, uma vez em etanol a 90% com agitação de 10 segundos, uma vez em etanol a 70% com agitação de 10 segundos , e duas vezes em bidestilada H2O com agitação de 10 segundos.
   Nota: Manipulação de xileno e a acetona deve ser feita em capas ventiladas para evitar a inalação e toxicidade respiratória.
2. Recuperar o antígeno pela transferência do rack para um recipiente de vidro com 200 mL de 10 mmol/L, pH 6.0 tampão pré-aquecido a 95 ° C. Definir o timer por 30 minutos em banho-maria e, em seguida, esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos, em seguida, enxaguar com água corrente por 5 minutos.
3. Remova a atividade peroxidase endógena incubando em 200 mL de água oxigenada 3% por 10 minutos. Lave slides 3 vezes em 200 µ l de solução salina tampão Tris (TBSS).
4. Remover as lâminas do rack e pincele cada um com cuidado para limpar o buffer de excesso. Para a coloração, adicione 200 µ l dos seguintes anticorpos primários, adicionar lamínulas em slides e incubar em uma câmara úmida por 1 hora em temperatura ambiente:
   1:800 anticorpo anti-FRB diluído
   Anti-humanos de anticorpo monoclonal de rato CD68, diluição de 1: 200
   Diluição de 1: 100 policlonal de coelho anti-CD3
   Nota: Secções de parafina fixada em formol da placenta também foram processadas conforme descrito em passos 2.1 a 2.9 e incubadas com anti-FRB18 e usadas como controle positivo. Coloração resultados foram obtidos por encontrar a concentração do anticorpo e foi realizada por titulação do anticorpo em diluições duplas (por exemplo, 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600).
5. Remova a lamínula após incubação e descarte. Enxágue slides 3 vezes por 2 minutos cada com TBSS, drenar e limpar o buffer de excesso.
6. Adicione 200 µ l de solução anticorpo secundário contendo Rabbit/Mouse secundário biotinilado para reagir com o anticorpo primário unconjugated vinculado ao antígeno de tecido. Coloque as lamelas em slides e incubar em uma câmara húmida durante 45 minutos à temperatura ambiente.
7. Remova a lamínula após incubação e descarte. Enxágue slides 3 vezes por 2 minutos cada com TBS, drenar e limpar o buffer de excesso.
8. Adicionar 200 µ l de diaminobenzidina (DAB) + tampão de substrato (imidazol HCl)-sistema de cromogénio e incubar durante 10 minutos para visualizar a coloração padrão. Lavar com TBSS em seguida em água corrente por 10 minutos.
9. Counterstain com hematoxilina durante 3 minutos.
10. Monte os slides aplicando 70 µ l de meio de montagem à superfície da lâmina. Lentamente, dica a lamela sobre o meio de montagem e evitar criar bolhas como desligá-lo no lugar. Espere 24 horas para secar.

3. histopatológico e imuno-histoquímica (IHC) análise

Examine o H & E e IHC manchado seções de assuntos positivos e normais GCA, usando um microscópio de luz.

1. Para a H & E manchado seções:
   1. Avaliar a arquitetura vascular e identificam as células endoteliais na túnica íntima, células musculares lisas na túnica média e fibroblastos e vasa vasorum na túnica adventícia^21,22.
   2. Identifica características do GCA, que incluem os linfócitos e infiltração de macrófagos/histiócitos, hiperplasia celular e degradação da lâmina elástica interna.
   3. Analise o infiltrado lymphohistiocytic, identificando e quantificando o número de macrófagos em relação os linfócitos. Avaliar o grau de rompimento da lâmina elástica interna e alterações hiperplásicas nas células residentes e comparar com os controles.
2. Para a IHC manchado seções:
   1. Examinar o padrão de coloração das FRB, tomando nota de sua expressão por um determinado tipo ou tipos de células e sua distribuição dentro as camadas vasculares e sua relação para o infiltrado total imune, o marcador para macrófagos total, anti-CD68 e o pan marcador de linfócitos anti-CD3.
   2. Quantificar a expressão das FRB, CD68 e CD3 células através da contagem das células coradas positivamente em 10 vários campos selecionados aleatoriamente de alta potência (hpf) e gravar os meios.
      Nota: A identificação dessas células normais e patológicas e estruturas foram realizados por um patologista cardiovascular certificado (J.M.) e reumatologista (V.A.A) e os resultados foram registrados em todos os casos.
   3. Capture imagens representativas, usando uma câmera digital.
      Nota: Após estas etapas, permanecendo alíquotas pode ser armazenada a-80 ° C.

Resultados

Achados histopatológicos

A H & E manchas em anatomia arterial normal de espécimes normal demonstrada com células endoteliais na túnica íntima, células musculares lisas da túnica média, e uma matriz de colagénio heterogêneo incluem fibroblastos e vasos alimentador chamado vasa vasorum no adventitia túnica. Não há nenhum infiltrado inflamatório identificado. Artérias temporais positivas de GCA demon...

Discussão

GCA é a vasculite mais comum em adultos, e sua marca patológica exemplifica uma potente combinação de linfócitos T helper e ativados macrófagos que também podem ser encontrados em outras doenças granulomatosas ou vasculopathies como sarcoidose e granulomatosa poliangiite^2,3. Em GCA, a artéria temporal fornece uma boa representação de tamanho médio a grande artéria e a biópsia TA dá uma amostra considerável que pode ser armazenada em blocos de para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips	Fisher Scientific
Vertical rack	Fisher Scientific
Light microscope	Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water			concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta	Manohar Ratnam		optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68	Dako	M071801	optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody	Dako
Placental tissue			for FRB positive control