Folate 수용 체 베타 대 식 세포와 거 대 세포 동맥에서 혈관 면역 Microenvironment를 프로 파일링 하는 Immunohistopathologic 연구

요약

프로토콜은 조직 검사 및 immunohistochemistry folate 수용 체 베타 macrophage와 총 면역 세포와의 관계는 거 대 세포 동맥 생 검 측 두 엽 동맥에에서 침투 하는 프로 파일의 사용을 보여 줍니다.

초록

거 대 세포 동맥 (GCA) 만성 면역 중재 매체-큰 크기의 동맥의 영향을 미치는 질병 노인 이다. GCA 매니페스트 관절염과 두통의 폐색 증상, 뇌졸중 또는 손실 비전. 대 식 세포 및 T-헬퍼 세포 혈관 벽에 침투 하 고 선박 손상 및 허 혈 이어질 프로 염증 반응을 생산. 날짜 하려면, 아무 GCA 바이오 마커 질병 활동 및 가이드 치료 응답을 감시할 수 있는 있다.

Folate 수용 체 베타 (FRB)는 glycosylphosphatidylinositol 단백질을 세포 막에 정박 하 고 일반적으로 myelomonocytic 혈통 및 또한 종양 및 류 마티스 활 액 세포, 골수성 백혈병 세포의 대부분을 표현 어디의 식을 질병의 심각도와 상관 한다. FRB의 능력 화합물 엽 산, 엽 산-어원이 같은 말 및 antifolate 마약을 했다 druggable 대상을 암 및 염증 성 질환 연구. 이 보고서 식 및 GCAimmunopathology에 관하여 FRB의 배포를 평가 하는 데 사용 하는 조직 및 immunohistochemical 방법을 설명 합니다.

GCA 및 일반 컨트롤에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 및 측 두 엽 동맥 biopsies Hematoxylin 및 오신 조직 조직학을 검토 하 여 pathognomonic 기능 스테인드 했다. Immunohistochemistry는 FRB, CD68 CD3 식 감지 하 사용 되었다. 현미경 분석 척도 10 선택 된 고 전력 필드 섹션 및 동맥 벽에 그들의 각각 위치에 긍정적으로 얼룩진된 셀의 수를 수행 했다.

Lymphohistiocytic (LH) 염증 내 증식 동반 및 방해 탄력 있는 lamina 컨트롤에 없음 GCA에 보였다. LH 침투는 약 60% 40%와 세포 대 식 세포의 구성 되었다. FRB 식 세포, CD68 + macrophage 총인구의 31%를 구성 하 고 미디어와 adventitia로 제한 했다. 아니 FRB 컨트롤에서 보였다.

이 프로토콜 GCA에 혈관 면역 microenvironment 기준으로 FRB macrophage의 고유한 숫자 및 공간 패턴을 보여주었다.

서문

거 대 세포 동맥 (GCA)의 매체-큰 동맥, 대동맥 및 그것의 분 지를 대상으로 하 고 노인에 영향을 미치는 염증 성 질환 이다. 그것은 온화한 두통, 턱 통증, 시력 손상, 뇌졸중과 조직 괴 저 등 심각한 허 혈 성 합병증을 선물 한다. 진단은은 적혈구 침 강 속도 (ESR)와 측 두 엽 동맥 생 검 (탭)¹에 별개 조직 패턴 같은 높은 염증 성 마커에 의해 확인 된다. GCA는 가장 일반적인 성인 맥 고 진단에 대 한 얻은 측 두 엽 동맥의 내게 필요한 옵션 하나 더 쉽게 그것의 병 인 연구를 활성화 하는 다른 vasculopathies에 비해 우위를 선물 한다. 탭에 일반적인 연구 결과 세포/histiocytes 및 일반적으로이 구분 하는 탄력 있는 lamina의 동시 파괴 tunica intima, 미디어, 그리고 adventitia의 모든 혈관 층에 걸쳐 발견 하는 T 세포의 침투를 포함 구획². 도우미의 채용 다음 T (Th) 세포, 특히 Th1과 Th17 하위 인터 루 킨-17 분 비는, 현재 증거 보여줍니다 GCA 혈관 adventitia에 수지상 세포를 활성화 하는 알 수 없는 항을 포함 하 고 인터페론-감마 (IFG) 각각. IFG 다음 신병 고 cytokines 및 프로 테아 제를 생산 하는 세포를 활성화 합니다. 이러한 프로 염증 성 cytokines; 포함 IL-12, 상호 긍정적인 피드백 루프; 제공 Th1 세포 활성화를 포함 하 여 종양 괴 사 인자와 인터 루 킨-6, 관절염과 열과 metalloproteases는 원인이 손상 탄력 있는 lamina. 스테로이드 제제 (GC), 표준 만성 치료를 구성 하는 부분적으로 약하게 Th17/IL-17 하지만 면역 반응^3,4의 Th1/IFG 팔 하지 여 cytokine 경로 제어 합니다. 불행히도, GC의 중지 질병 재발 발생합니다. 대체 양식 적임으로 토트 GCA 치료 용도가 변경 하지만 더 민감한 생체 치료 모니터링^{5,6에 대 한 활용 하지는 않지만 원하는 임상 끝점 일관 되 게 달성 하지 했다} . 2017 년, 인터 류 킨 6 차단기, tocilizumab, 같이 그것은 효과적으로 질병 관리 및 스테로이드 효과^7,8살려주는 GCA의 치료를 위해 승인 되었다.

날짜 하려면, GCA에 대 한 더 좋은 생체 있다. 결과적으로, 그것은 질병 활동을 모니터링 하 고 부작용을 방지 하 고 사회 비용의 부담을 줄이기 위해 사용할 수 있는 약물의 복용량을 적정 어렵다. 따라서, 질병 활동 상호 병 인 및 치료 결정에 있는 원조에 새로운 통찰력을 제공 하는 후보 biomarker에 대 한 보고는 것이 필수적 이다.

대 식 세포 활성화의 dysregulation GCA 병 인에 중요 한 요소 이다. 따라서, GCA 치료의 효과적인 수단 활성화 된 대 식 세포의 선택적 대상 수 있습니다. Folate 수용 체 베타 (FRB)는 세포 막에 정박 glycosyl phosphatidylinositol 당단백질 정상적인 myelomonocytic 셀, 골수성 백혈병 세포에에서 표현 하 고 대 식 세포를 활성화. 그것의 ligand, 엽 산, 세포질 DNA 합성, 메 틸 화 및 수리⁹수 감소 형태로 필수적인 비타민 이다. 자가 면역 질환 및 발암 중 FRB 식이 유도 된다. 그 식이 고체 기관 및 골수성 악성^10,,1112 monocytes 또는 류 마티스 관절염, 프로-염증 성 M1 세포의 표면에 또는 항 염증 제 M2 세포에 제한 ^{, 13}. 활성화 된 대 식 세포의 biomarker로 그것의 잠재적인 역할, FRB는 엽 산, antifolates 또는 셀에서 folate 활용 약물 수용 체 바인딩으로 시작 하는 다단계 프로세스를 통해 선택적 약물 전송 가능 표면, 국제화, 릴리스 및 내부 셀 기계^12,14,,1516원하는 약물의 최종 배달 합니다. 대조적으로 FRB 암 세포에 표현 하 고 대 식 세포 활성화, 정상 조 혈 세포에 표현 하는 FRB는 FRB/엽 산 중재 약물 전달 FRB 양성 염증 성 또는 암 세포가 되도록 folates 바인딩할 수.

우리의 이전 연구에서 우리는 FRB GCA 대 식 세포에 표현 되는 처음으로 시연 하 고 표현 연관 CD68 + 및 endothelin 수용 체 베타 세포, GCA pathogenesis¹⁷을. 이 보고서에서 우리는 histopathological 설명 및 immunohistochemical 방법 FRB macrophage를 평가 하는 데 사용 총 림프 구 분석 그리고 macrophage GCA 혈관에 FRB의 위치에 대 한 통찰력을 얻기 위해 계산.

프로토콜

설명 된 모든 방법은 펜 주 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

1. histopathological 준비, 그리고 측 두 엽 동맥 생 검 후 처리

참고: 측 두 엽 동맥 생 검 (탭) 로컬 마 취 및 무 균 상태에서 인증 된 외과 의사에 의해 수행 됩니다. 후 수술 더 영향을 받는 쪽에 3 cm 동맥 섹션, 표본 즉시 24 h에 대 한 포 르 말린에 고정, 3 ~ 4 m m 섹션으로 나누어 이며 파라핀, 조직 블록에 적절 한 맞춤에 주의 깊은 관심을 지불에 포함 된는 다음 상 온에 저장 됩니다. 견본 선택 진료 기록을 확인 한 후 수행 됩니다. 진단은 류 마티스 1990 기준의 과목 3 5 도메인의 충족을 요구 하는 미국 대학에 기반: 나이 > 50 년, 새로운 두통, 측 두 엽 동맥 부드러움, 적혈구 침 강 속도 > 50 mm/시간 Westergren 메서드에서 비정상적인 탭입니다. 안전을 위해, 보호 장갑을 착용 해야 합니다 항상 표본, 화학 물질과 항 체를 처리 하는 경우.

1. 포함 된 블록에서는 톰을 사용 하 여 4-5 µ m 두꺼운 섹션을 잘라. 그리고 얼룩 Hematoxylin와 오신 (H & E). 품질 보증에 대 한 선택 된 정상 조직의 제어 섹션을 사용 합니다.
2. 플 로트 따뜻한 물 목욕에 대 한 섹션을 잘라 주름 제거와 코팅된 유리 현미경 슬라이드를 데리 러 40 ° C에가 열.  유리 슬라이드 건조 및 슬라이드 섹션의 준수를 촉진 하기 위하여 60 분 동안 60 ° C 오븐에서 따뜻한 접시에 놓습니다.
3. 유리 슬라이드 건조 및 슬라이드 섹션의 준수를 촉진 하기 위하여 60 분 동안 60 ° C 오븐에서 따뜻한 접시에 놓습니다.
4. 현미경 슬라이드에 3 섹션을 탑재 합니다.
5. 37 ° C에서 24 h 건조 하룻밤에 수직 랙 슬라이드를 놓습니다.
6. 컨테이너에 4 ° c.에 게 슬라이드를 배치

2. Immunohistochemical 준비, Dewaxing, 항 원 검색 및^15,18,,1920 얼룩

1. 슬라이드 랙 슬라이드를 로드 합니다. 요리를 통해 랙을 다음과 같이 실행: 10 초의 부드러운 동요 10 초 동요와 함께 70% 에탄올에 한 번 10 초 동요와 90% 에탄올에 한 번 10 초 동요와 함께 100% 에탄올에 한 번 30 초 마다 5 분 동안 100% 크 실 렌에 두 번 두 번에 더블 10 초 동요와 H2O를 증 류 하는 고.
   참고: 크 실 렌과 아세톤의 처리는 흡입과 호흡기 독성을 피하기 위해 환기 후드에서 행해져야 한다.
2. 랙 10 mmol/L, pH 6.0 구 연산 염 버퍼 95 ° c.에 prewarmed의 200 mL와 함께 유리 용기에 전송 하 여 항 원 검색 물 욕조에 30 분 동안 타이머를 설정 후 20 분 후 5 분 동안 실행 하는 물으로 씻어 실 온에서 냉각.
3. 10 분 동안 3%의 과산화 수소의 200 mL에 배양 하 여 내 인 성 과산화 효소 활동을 제거 합니다. Tris 버퍼 염 (TBSS)의 200 µ L에 슬라이드 3 번을 씻어.
4. 랙에서 슬라이드를 제거 하 고 부드럽게 닦아 초과 버퍼에 각 하나 줘 봐. 얼룩, 추가 다음 주 항 체의 200 µ L 커버 슬립 슬라이드에 추가 하 고 실 온에서 1 시간 동안 습 실에서 품 어.
   안티-FRB 항 체 희석 1:800
   단일 클로 널 마우스 안티 인간 CD68, 1: 200 희석
   Polyclonal 토끼 안티-CD3 1: 100 희석
   참고: 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 부분의 태 또한 2.9 및 안티-FRB18와 incubated 단계 2.1에 명시 된 대로 처리 되었고 긍정적인 통제로 사용. 얼룩 결과 최적의 항 체 농도 찾는 하 여 가져온와 두 배 희석 (1시 50분, 1: 100, 1: 200, 1:400, 1:800, 1:1600)에서 항 체를 titrating에 의해 수행 됐다.
5. 부 화 후 폐기 커버 슬립을 제거 합니다. TBSS 각 2 분 동안 3 번 슬라이드를 린스, 배수 및 초과 버퍼를 닦아.
6. 조직 항 원에 바인딩된 결합형된 기본 항 체와 반응 biotinylated 안티 Rabbit/마우스 이차 항 체를 포함 하는 이차 항 체 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. Coverslips 슬라이드에 배치 하 고 실 온에서 45 분 동안 습 실에서 품 어.
7. 부 화 후 폐기 커버 슬립을 제거 합니다. 슬라이드 3 번 TBS 각 2 분 동안 린스, 배수와 초과 버퍼를 닦아.
8. Diaminobenzidine (한 덩어리) + 기판 버퍼 (이미 HCl)의 200 µ L 추가-chromogen 시스템 및 얼룩 패턴을 시각화 하는 10 분 동안 품 어. 씻어 TBSS 다음 10 분 동안 실행 하는 수돗물에.
9. 3 분으로 되며 counterstain.
10. 슬라이드의 표면에 장착 매체의 70 µ L을 적용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다. 천천히 설치 매체에 coverslip 팁 고로에 낮은 거품을 만들지 마십시오. 건조 24 시간 기다립니다.

3. 조직 및 Immunohistochemical (IHC) 분석

H & E와 IHC 스테인드 GCA 긍정적이 고 정상적인 과목 가벼운 현미경을 사용 하 여 섹션을 검사 합니다.

1. H 조 & 전자에 대 한 스테인드 섹션:
   1. 혈관 아키텍처를 평가 하 고 tunica 매체, 및 섬유 아 세포에서 평활 근 세포와 tunica adventitia^21,22바사 vasorum tunica intima에 내 피 세포를 식별 합니다.
   2. 림프 구 및 대 식 세포/histiocyte 침투, 세포 증식, 내부 탄력 있는 lamina 저하 GCA 기능을 식별 합니다.
   3. Lymphohistiocytic 침투 식별 하 고 세포를 기준으로 대 식 세포의 수를 측정 하 여 분석 합니다. 내부 탄력 있는 lamina 중단 및 주민 셀과 변경의 정도 평가 하 고 컨트롤과 비교 합니다.
2. IHC 스테인드 섹션에 대 한:
   1. FRB, 총 면역 침투, 총 대 식 세포 마커, 안티-CD68, 그리고 팬을 특정 유형 또는 종류의 세포와 혈관 레이어와 관계 내에서 분포는 식의 노트를 복용의 얼룩 패턴 검사 림프 구 마커 CD3 안티.
   2. 여러 개의 무작위로 선택 된 고성능 필드 (hpf) 10에 긍정적으로 얼룩진된 셀을 계산 하 여 FRB, CD68 CD3 셀 식 계량 하 고 수단을 기록 합니다.
      참고: 이러한 정상적이 고 pathologic 셀 및 구조 식별 인증된 심장 병리학 자 (J.M.)에 의해 수행 했다 고 즘 (S.A.A.) 및 결과 모든 경우에 대 한 기록 했다.
   3. 디지털 카메라를 사용 하 여 대표 이미지를 캡처하십시오.
      참고: 이 단계 후 aliquots 남은 저장 될 수 있습니다-80 ° c.에

결과

조직 결과

H & E tunica intima, tunica 매체에 있는 평활 근 세포에서에서 내 피 세포와 함께 정상 표본 시연된 정상적인 동맥 해부학에 얼룩과 섬유 아 세포와 피더 선박 등 이기종 콜라겐 매트릭스 라는 바사 vasorum tunica adventitia에서. 없는 염증 성 침투 식별 있다. GCA 긍정적인 일시적인 동맥 보통 심한 염증 세포/histiocyte...

토론

GCA는 성인에서 가장 흔한 맥 그리고 그것의 pathologic 특징 T 조 수 세포의 강력한 조합을 보여준다 또한 다른 granulomatous 질병 또는 sarcoidosis 같은 vasculopathies에서 찾을 수 있는 대 식 세포를 활성화 하 고 granulomatous polyangiitis^2,3. GCA, 측 두 엽 동맥 매체-큰 크기의 동맥의 좋은 표시를 제공 합니다 및 조교 생 저장 될 수 있는 파라핀 블록에 년, 따라서 진단 신...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips	Fisher Scientific
Vertical rack	Fisher Scientific
Light microscope	Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water			concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta	Manohar Ratnam		optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68	Dako	M071801	optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody	Dako
Placental tissue			for FRB positive control