Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

Resumen

Las mutaciones en el gen de la quinasa 2 de la leucina rica causan la enfermedad de Parkinson hereditaria. Hemos desarrollado un método fácil y robusto para evaluar la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 en neutrófilos de sangre periférica humana. Esto puede ayudar a identificar a las personas con aumento de la actividad de la vía de la quinasa LRRK2.

Resumen

La quinasa de repetición rica en leucina 2 (LRRK2) es el gen mutado con más frecuencia en la enfermedad hereditaria de Parkinson (PD) y todas las mutaciones patógenas de LRRK2 resultan en la hiperactivación de su función quinasa. Aquí, describimos un ensayo fácil y robusto para cuantificar la actividad de la vía quinasa LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica humana midiendo la fosforilación controlada por LRRK2 de uno de sus sustratos fisiológicos, Rab10 en la threonina 73. El análisis de inmunoblotting descrito requiere un anticuerpo totalmente selectivo y fosfoespecífico que reconozca el epítopeno Rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10. Utiliza neutrófilos de sangre periférica humana, porque la sangre periférica es fácilmente accesible y los neutrófilos son un componente abundante y homogéneo. Es importante destacar que los neutrófilos expresan niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab10. Un inconveniente potencial de los neutrófilos es su alta actividad intrínseca de proteasa de serina, que requiere el uso de inhibidores de la proteasa muy potentes como la neurotoxina organofosfora diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte del tampón de lisis. Sin embargo, los neutrófilos son un recurso valioso para la investigación de la actividad in vivo de la vía quinasa LRRK2 y deben considerarse para su inclusión en las colecciones de biorrepositorios de DP.

Introducción

Los intentos de reducir o detener la enfermedad de Parkinson (PD) han fracasado hasta ahora. El descubrimiento de mutaciones hiperactivadoras en la quinasa repetitiva rica en leucina 2 (LRRK2) que causan y/o aumentan el riesgo de DP ha llevado al desarrollo de inhibidores de la quinasa LRRK2^1,,2,,3. Estos han entrado ahora en ensayos clínicos⁴. La función exacta de LRRK2 no está clara, pero un avance importante ha sido la identificación de un subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluyendo Rab10, como los primeros sustratos fisiológicos de buena fe de la quinasa LRRK2^5,,6,7. Los principales desafíos en la era de las terapias modificadoras de la enfermedad son los marcadores bioquímicos del estado de activación de la quinasa LRRK2 y la participación objetivo de los inhibidores de la quinasa LRRK2.

Hasta ahora, el principal marcador farmacocinético de los inhibidores de LRRK2 in vivo ha sido un grupo de residuos de serina fosforilada constitutivamente de LRRK2, en particular la serina 935, que se desfosforilan en respuesta a diversos inhibidores de LRRK2^8,9. Sin embargo, la fosforilación de la serina 935 no se correlaciona con la actividad celular intrínseca de la quinasa LRRK2 porque no está fosforilada directamente por LRRK2 y sigue fosforiladaendo en LRRK2¹⁰inactivo para la quinasa. La actividad de la quinasa LRRK2 se correlaciona bien con la autofosforilación de la serina 1292, pero en términos prácticos no es una lectura adecuada para la actividad endógena de la quinasa LRRK2 mediante el análisis de inmunoblot de extractos de células enteras debido a la falta actual de anticuerpos fiables y fosfoespecíficos para este sitio^10,11.

Hemos desarrollado un ensayo robusto y fácil para cuantificar la actividad de la vía de la quinasa LRRK2 en células sanguíneas periféricas humanas que mide la fosforilación controlada por LRRK2 de su diana fisiológica Rab10 en la threonina 73¹¹. La sangre periférica es fácilmente accesible por venesection, que es un procedimiento rápido y de bajo riesgo que causa un mínimo malestar. Nos centramos en los neutrófilos de sangre periférica humana porque constituyen una población abundante (37-80% de todos los glóbulos blancos) y células homogéneas que expresa niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab10¹¹. Además, los neutrófilos de sangre periférica pueden aislarse de forma rápida y eficiente mediante el empleo de un enfoque negativo inmunomagnético. Para garantizar que la posterior fosforilación Rab10 observada sea mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos se incuba con o sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK2 (utilizamos y recomendamos MLi-2)^2,12. Esto es seguido por la lisis celular en un tampón que contiene el inhibidor de la proteasa diisopropilo fluorofosfato (DIFP), que es necesario para suprimir la actividad intrínseca de la proteasa de serina que se sabe que es alta en neutrófilos¹³. Para el análisis final mediante inmunoblotting cuantitativo, recomendamos utilizar el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10 que detecta específicamente el Rab10 Thr73-fosfoepitope y no reacciona cruzadamente con otras proteínas Rab fosforiladas¹⁴. La selectividad y especificidad de este anticuerpo ha sido validada en modelos de sobreexpresión de diferentes proteínas Rab y una línea celular de nocaut A549 Rab10¹⁴. Por lo tanto, medimos la diferencia en la fosforilación de Rab10 en los lisatos de neutrófilos que han sido tratados con y sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK2². Alternativamente, las muestras también podrían ser analizadas por otros métodos, como la espectrometría cuantitativa de masas.

En conclusión, la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2 es un marcador superior de la actividad de quinasa LRRK2 a la fosforilación LRRK2 en la serina 935 y los neutrófilos de sangre periférica humana son un recurso valioso para la investigación de DP en LRRK2. Nuestro protocolo proporciona un ensayo robusto y fácil para interrogar la actividad de la vía LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica y permite la estratificación bioquímica de individuos con mayor actividad quinasa LRRK2¹⁵. Es importante destacar que estos individuos pueden beneficiarse del futuro tratamiento con inhibidores de la quinasa LRRK2.

Protocolo

Según la normativa local del Reino Unido, todas las manipulaciones y pipeteos de sangre humana se llevan a cabo en un gabinete de seguridad biológica de categoría 2. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la junta local de revisión ética y todos los participantes han dado su consentimiento informado.

1. Preparación

1. Preparar 0,1 ml de EDTA Stock Solution 1 que contiene 100 mM edtA en solución salina con búfer de fosfato (PBS).
2. Preparar 60 mL de EDTA Stock Solution 2 que contiene 1 mM de EDTA en PBS.
3. Preparar el tampón de lisis que contenga 50 mM Tris-HCl (pH a 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 mM de glicerofosfato, 5 mM de pirofosfato sódico, 0,27 M de sacarosa, 0,1% (v/v) de é-mercaptoetanol, 1 cóctel inhibidor de la proteasa, 1 g/ml de microcistocina-LR y 0,5 mM de diisopropilFP(DI).
   NOTA: Los autores utilizan habitualmente un producto libre de EDTA, pero un cóctel inhibidor de proteasa que contiene EDTA también debe funcionar. El tampón de lisis se puede hacer de antemano sin el é-mercaptoetanol, inhibidores de la proteasa, microcistina-LR y DIFP, y se almacena a 4 oC hasta su uso. Asegúrese de que el é-mercaptoetanol, los inhibidores de la proteasa, la microcistina-LR y el DIFP solo se añaden inmediatamente antes de su uso.
   ADVERTENCIA: El DIFP es tóxico y debe manipularse con cuidado en una campana de humos después de la evaluación local del riesgo de salud y seguridad. DIFP se puede agregar al búfer de lisis y utilizarse inmediatamente. Alternativamente, el tampón de lisis completo que contiene todos los demás componentes, incluyendo DIFP, se puede alicite y se almacene a -80 oC para su uso posterior durante al menos 4 semanas.

2. Aislamiento de neutrófilos de sangre entera

1. Recoger 10 ml de sangre en un tubo de recolección de sangre. Mezcle suavemente invirtiendo tubos de 7 x 8x.
2. Transfiera 10 ml de sangre a un tubo cónico de 50 ml.
3. Añadir 100 l de EDTA Stock Solution 1 a la sangre. Mezclar suavemente.
4. Añadir 500 l del cóctel de aislamiento (50 l/ml) desde el kit de aislamiento de neutrófilos(Tabla de materiales)a toda la muestra de sangre.
5. Vortex las perlas magnéticas del kit de aislamiento de neutrófilos durante 30 s antes de su uso con el fin de resuspender las cuentas magnéticas muy finas.
6. Añadir 500 s de las perlas magnéticas a la muestra de sangre y mezclar suavemente invirtiendo el tubo varias veces.
7. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
8. Llene el tubo a 50 ml con EDTA Stock Solution 2. Mezclar pipeteando muy suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3x.
9. Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar la agitación posterior del tubo.
10. Incubar durante 10 min a RT.
11. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que contiene los neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán y evite la recolección y perturbación de los glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. Deje aproximadamente 10 ml de la suspensión de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo.
12. Vortex las perlas magnéticas durante 30 s antes de su uso y añadir 0,5 ml de las cuentas magnéticas al tubo que contiene los neutrófilos enriquecidos. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo.
13. Incubar a RT durante 5 min.
14. Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar agitación posterior.
15. Incubar a RT durante 5 min.
16. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que contiene los neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán. Dejar aproximadamente 5 ml de la suspensión en la parte inferior del tubo.
17. Para asegurar la eliminación completa de las perlas magnéticas de la mezcla celular, coloque el tubo que contiene las células enriquecidas en el imán.
18. Incubar durante 10 min a RT.
19. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que ahora contiene neutrófilos puros en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán. Dejar aproximadamente 5 ml de la suspensión en la parte inferior del tubo.
20. Mezcle las células aisladas con 1 mM EDTA Stock Solution 2 a un volumen final de aproximadamente 41 ml. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
21. Divida la solución por igual en dos tubos con aproximadamente 20 ml en cada tubo.
22. Centrifugar ambos tubos a 335 x g durante 5 min.
23. Durante esta centrifugación, salte el congelador de -80 oC y deje en RT para su uso posterior.
24. Inmediatamente después del paso de centrifugación y sin agitación de los tubos, vierta el sobrenadante sin molestar los pellets de neutrófilos. Resuspenda cada pellet celular en 10 ml de medios de cultivo celular(Tabla de materiales)en RT pipeteando suavemente las células arriba y abajo 4veces.

3. Tratamiento del inhibidor de la quinasa LRRK2 de neutrófilos puros

1. Etiqueta un tubo "DMSO" y el otro tubo "MLi-2".
2. En el tubo etiquetado "DMSO", agregue 10 ml de DMSO y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una pipeta de 10 ml. En el tubo etiquetado "MLi-2", añadir 10 ml de solución de material MLi-2 de 200 MM (concentración final 200 nM) y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una pipeta de 10 ml.
3. Incubar las muestras durante 30 minutos a RT. Mezclar suavemente mediante la inversión cada 10 minutos durante la incubación.
4. Durante el período de incubación, retire el material DE 0,5 M de DIFP del congelador de -80 oC y colóquelo en una campana de humos sobre hielo. Retire la solución de material de microcistina-LR de 1 mg/ml del congelador de -80 oC y déjela en RT para descongelar. Saque una alícuota (0,25 ml) del tampón de lisis fuera del congelador, permita que se descongele en RT y, a continuación, colóquela en hielo para su uso posterior.
5. Prepare 1 ml de medio de cultivo celular que contenga 1 l de DMSO y llame a este búfer de resuspensión DMSO. Prepare 1 ml de medios RPMI que contengan 1 l de 200 MLi-2 y llame a este búfer de resuspensión MLi-2.
6. Después del período de incubación de 30 minutos, centrifugar ambos tubos a 335 x g durante 5 min.
7. Deseche cuidadosamente el sobrenadante en cada tubo sin alterar el pellet de neutrófilos.
8. Para la muestra etiquetada DMSO resuspende suavemente el pellet en 1 ml del tampón de reparación DMSO y para el tubo etiquetado MLi-2, resuspende el pellet en 1 ml del tampón de resuspensión MLi-2.
9. Transfiera los gránulos de células resuspendidos a los correspondientes tubos de centrifugación etiquetados como "DMSO" y "MLi-2" y centrifugar ambos tubos a 335 x g durante 3 min.
10. Durante el paso de centrifugación, prepare el tampón de lisis. En la campana de humos agregue cuidadosamente 0,25 ml de solución de DIFP de 0,5 M, así como 0,25 ml de microcistina-LR de 1 mg/ml al búfer de lisis de 0,25 ml. Mezclar y dejar sobre hielo hasta su uso.
    NOTA: Agregue DIFP al búfer de lisis dentro de los 15 minutos de lisis celular, porque DIFP es relativamente inestable en una solución acuosa.
11. Inmediatamente después de la centrifugación, retire cuidadosamente y completamente todo el sobrenadante con una pipeta sin molestar el pellet de neutrófilos y coloque los tubos sobre hielo.
12. Añadir inmediatamente 100 l de tampón de lisis que contenga DIFP y microcistina-LR a cada tubo. Usando una pipeta de 100–200 l, resuspende los gránulos celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo alrededor de 5-10x.
13. Lisia las células sobre hielo durante 10 min.
14. Tubos centrífugos a 20.000 x g durante 15 min a 4oC para eliminar los restos celulares.
15. Transfiera los sobrenadores "DMSO" y "MLi-2" que contienen los lisados de neutrófilos a nuevos tubos centrífugos. Deseche el pellet de escombros.
    NOTA: Los lisados de neutrófilos ya están listos para su uso o se pueden congelar a presión en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 oC para su análisis futuro.

Resultados

Nuestro ensayo permite interrogar la activación de la quinasa LRRK2 asociada a la PD en neutrófilos de sangre periférica humana con la fosforilación Rab10 dependiente de LRRK2 como una lectura. Los neutrófilos son una población homogénea y abundante de glóbulos blancos periféricos que expresa altos niveles de proteínas LRRK2 y Rab10(Figura 1). La única otra población celular entre las células mononucleares de sangre periférica restantes (PPBCD) con un alto número de copias de ...

Discusión

La evidencia clínica, genética y bioquímica convincente apunta hacia un papel importante para LRRK2 y, en particular, su función quinasa en la enfermedad de Parkinson⁷. Se han desarrollado inhibidores de la quinasa LRRK2 que están entrando en ensayos clínicos^2,4,12. Como tal, es necesario explotar LRRK2 como biomarcador para la participación objetivo, así como la estratificación del paciente. Nue...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	used at 1 μg/ml final concentration