Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

Резюме

Мутации в леуцине богатые повторить киназы 2 гена (LRRK2) вызывают наследственное заболевание Паркинсона. Мы разработали простой и надежный метод оценки lRRK2 контролируемого фосфорилирования Rab10 в нейтрофилов периферической крови человека. Это может помочь определить людей с повышенной активностью пути киназы LRRK2.

Аннотация

Лейцин богатый повторить киназу 2 (LRRK2) является наиболее часто мутировавшим геном в наследственной болезни Паркинсона (PD) и все патогенные мутации LRRK2 привести к гиперактивации его функции киназы. Здесь мы описываем простой и надежный анализ для количественной оценки lRRK2 киназы пути деятельности в нейтрофилов периферической крови человека путем измерения LRRK2 контролируемых фосфорилирования одного из своих физиологических субстратов, Rab10 на threonine 73. Описанный анализ иммуноблоттинга требует полностью селективного и фосфоспецифического антитела, которое распознает эпитопные фосфоры Rab10, такие как моноклональные антитела кролича MJFF-pRab10. Он использует нейтрофилы периферической крови человека, потому что периферическая кровь легко доступна и нейтрофилы являются обильным и однородным компонентом. Важно отметить, что нейтрофилы выражают относительно высокий уровень как LRRK2, так и Rab10. Потенциальным недостатком нейтрофилов является их высокая внутренняя активность протеазы серин, что требует использования очень мощных ингибиторов протеазы, таких как органофосфор нейротоксин diisopropylfluophosphate (DIFP) как часть буфера лизиса. Тем не менее, нейтрофилы являются ценным ресурсом для исследования активности пути киназы LRRK2 в vivo и должны быть рассмотрены для включения в коллекции PD биопозиторий.

Введение

Попытки замедлить или остановить болезнь Паркинсона (PD) до сих пор не увенчались успехом. Открытие гиперактивации мутаций в лейцине богатых повторить киназу 2 (LRRK2), которые вызывают и / или увеличить риск для PD привело к развитию ингибиторов киназы LRRK2^1,2,3. Они уже вступили клинических испытаний⁴. Точная функция LRRK2 неясна, но основным прогрессом стало выявление подмножества белков Rab GTPase, включая Rab10, как первые добросовестные физиологические субстраты киназы LRRK2^5,6,7. Ключевыми проблемами в эпоху болезнеязычной терапии являются биохимические маркеры статуса активации активации LRRK2 и целевое участие ингибиторов киназы LRRK2.

До сих пор основным фармакокинетическим маркером для ингибиторов LRRK2 in vivo был кластер составно фосфорилированных остатков серина LRRK2, в частности, serine 935, которые становятся дефосфорилированными в ответ на различные ингибиторы LRRK2^8,9. Тем не менее, серин 935 фосфорилирования не коррелирует с внутренней клеточной активности киназы LRRK2, потому что это непосредственно не фосфорилируется LRRK2 и до сих пор фосфорилируется в киназе неактивных LRRK2¹⁰. Активность киназы LRRK2 хорошо коррелирует с аутофосфорилированием серина 1292, но в практическом плане это не подходит для эндогенной активности киназы LRRK2 путем иммуноблотного анализа экстрактов цельных клеток из-за отсутствия надежных и фосфоспецифических антител для этого сайта^10,11.

Мы разработали надежный и простой анализ для количественной оценки LRRK2 киназы пути деятельности в человеческих периферических клеток крови, что меры LRRK2 контролируемых фосфорилирования своего физиологического целевого белка Rab10 на threonine 73¹¹. Периферическая кровь легко доступна с помощью шпинесекции, которая является низким риском и быстрой процедурой, которая вызывает минимальный дискомфорт. Мы фокусируемся на нейтрофилах периферической крови человека, потому что они составляют обильные (37-80% всех белых кровяных клеток) и однородную популяцию клеток, которая выражает относительно высокий уровень lRRK2 и Rab10^11. Кроме того, периферийные нейтрофилы крови могут быть изолированы быстро и эффективно, используя иммуномагнитный негативный подход. Для обеспечения того, чтобы последующее наблюдаемое фосфорилирование Rab10 опосредовано LRRK2, каждая партия нейтрофилов инкубируется с или без мощного и селективного ингибитора киназы LRRK2 (мы используем и рекомендуем MLi-2)^2,12. Затем следует клеточный лизис в буфере, содержащем ингибитор протеазы diisopropyl фторфосфат (DIFP), который необходим для подавления внутренней активности протеазы серина, которая, как известно, с высоким содержанием нейтрофилов¹³. Для окончательного анализа по количественному иммуноблоттингу, мы рекомендуем использовать моноклональное антитело кролика MJFF-pRab10, которое специально обнаруживает Rab10 Thr73-фосфоэпитоп и не перекрестно реагирует с другими фосфорилированными белками Rab^14. Избирательность и специфика этого антитела была подтверждена в моделях переэкспрессии различных белков Rab и A549 Rab10 нокаут омичи клеточной линии¹⁴. Таким образом, мы измеряем разницу в фосфорилировании Rab10 в нейтрофильных лизатах, которые лечились с мощным и селективным ингибитором киназы LRRK2^2. Кроме того, образцы могут быть проанализированы с помощью других методов, таких как количественная масс-спектрометрия.

В заключение, LRRK2 контролируемых Rab10 фосфорилирования является превосходным маркером LRRK2 киназы деятельности LRRK2 фосфорилирования на serine 935 и человека периферической крови нейтрофилов являются ценным ресурсом для ИССЛЕДОВАНИЯ PD в LRRK2. Наш протокол обеспечивает надежный и простой анализ для допроса LRRK2 пути деятельности в периферической крови нейтрофилов и позволяет биохимического стратификации лиц с повышенной активностью LRRK2 киназы¹⁵. Важно отметить, что такие люди могут извлечь выгоду из будущего лечения ингибитора киназы LRRK2.

протокол

Согласно местному регулированию Великобритании, все манипуляции и пайпетирование человеческой крови проводятся в кабинете биологической безопасности категории 2. Все процедуры проводились в соответствии с местным советом по рассмотрению этики, и все участники дали информированное согласие.

1. Подготовка

1. Подготовьте 0,1 мл edTA Stock Solution 1, содержащего 100 мМ EDTA в фосфатно-буферном сольне (PBS).
2. Подготовьте 60 мл EDTA Stock Solution 2, содержащего 1 мМ EDTA в PBS.
3. Подготовка лисис буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1% (v/v) Тритон X-100, 1 мМ EGTA, 1 мМ Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 мМ -глицерофосфат, 5 мМ пирофосфат натрия, 0,27 М сахароза, 0,1% (v/v) - меркаптоэтанол, 1x ингибитор ный диптестовый коктейль, 1 мкг/мЛ микроцизтин-LR и 0,5 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы обычно используют продукт без ЭДТА, но ЭДТА-содержащий препарат ингибитор протеазы также должен работать. Буфер лизиса можно сделать заранее без q-mercaptoethanol, ингибиторы протеазы, microcystin-LR, и DIFP, и храниться при 4 градусах Цельсия до использования. Убедитесь, что ингибиторы протеазы, микроцистин-LR и DIFP добавляются только непосредственно перед использованием.
   ВНИМАНИЕ: DIFP является токсичным и должны быть обработаны с осторожностью в дым капот после местной оценки риска для здоровья и безопасности. DIFP можно добавить в буфер лисиса и использовать немедленно. Кроме того, полный буфер лисиса, содержащий все другие компоненты, включая DIFP, может быть алицитирован и храниться при -80 градусов по Цельсию для последующего использования в течение не менее 4 недель.

2. Нейтрофил изоляция от цельной крови

1. Соберите 10 мл крови в трубку для сбора крови. Аккуратно перемешайте, перевернув трубки 7'8x.
2. Перенесите 10 мл крови в коническую трубку 50 мл.
3. Добавьте в кровь 100 л EDTA Stock Solution 1. Смешайте осторожно.
4. Добавьте 500 кЛ изоляционных коктейлей (50 л/мл) из комплекта изоляции нейтрофилов(Таблица материалов)к всему образцу крови.
5. Vortex магнитные бусы из нейтрофилов изоляции комплект для 30 s перед использованием для того, чтобы resuspend очень тонкие магнитные бусы.
6. Добавьте 500 л магнитных бусинок в образец крови и аккуратно перемешайте, несколько раз инвертируя трубку.
7. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
8. Заполните трубку до 50 мл с EDTA Stock Solution 2. Смешайте очень мягко pipetting вверх и вниз 2-3x.
9. Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения трубки.
10. Инкубировать в течение 10 минут на RT.
11. Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая содержит нейтрофилов в новую 50 мл конической трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом и избежать сбора и возмущения красных кровяных телец в нижней части трубки. Оставьте примерно 10 мл суспензии красных кровяных телец позади в нижней части трубки.
12. Vortex магнитные бусы для 30 s перед использованием и добавить 0,5 мл магнитных бусин в трубку, содержащую обогащенных нейтрофилов. Смешайте осторожно, инвертируя трубку.
13. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
14. Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения.
15. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
16. Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая содержит нейтрофилов в новую 50 мл конической трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом. Оставьте около 5 мл подвески в нижней части трубки.
17. Для обеспечения полного удаления магнитных бусин из клеточной смеси поместите трубку, содержащую обогащенные клетки, в магнит.
18. Инкубировать в течение 10 минут на RT.
19. Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая в настоящее время содержит чистые нейтрофилы в новую 50 мл конической трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом. Оставьте около 5 мл подвески в нижней части трубки.
20. Смешайте изолированные ячейки с 1 мМ EDTA Stock Solution 2 до конечного объема около 41 мл. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
21. Разделите раствор поровну на две трубки примерно по 20 мл в каждой трубке.
22. Центрифуга обе трубы на 335 х г в течение 5 мин.
23. Во время этой центрифугации вынимайте запас ингибитора МЛИ-2 (концентрация 200 мкм/1000х) из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и оставляйте на РТ для последующего использования.
24. Сразу после шага центрифугации и без агитации труб, слить супернатант, не нарушая нейтрофил гранулы. Resuspend каждой клетки гранулы в 10 мл клеточной культуры средств массовой информации (Таблица материалов) на RT, мягко pipetting клеток вверх и вниз 4x.

3. Ингибитор ингибитора киназы LRRK2 для лечения чистых нейтрофилов

1. Этикетка одна трубка "DMSO" и другая трубка "MLi-2".
2. К "DMSO" помечены трубки, добавить 10 зл ИЛ DMSO и аккуратно перемешать, пайпеттинг вверх и вниз 2x с 10 мл пипетки. К "MLi-2" помечены трубки, добавить 10 зл и л из 200 ММ МЛи-2 бульонный раствор (окончательная концентрация 200 нм) и аккуратно перемешать, трубавверхи вверх и вниз 2x с 10 мл пипетки.
3. Инкубировать образцы в течение 30 минут на RT. Смешайте осторожно инверсии каждые 10 минут во время инкубации.
4. В инкубационный период удалите 0,5 M DIFP из морозильной камеры -80 градусов и поместите в капот дыма на льду. Удалить 1 мг/мЛ микроцизтин-LR бульонраствора из морозильной камеры -80 градусов и оставить на РТ оттаивать. Возьмите аликот (0,25 мл) из буфера лисиса из морозильной камеры, дайте ему разморозить на RT, а затем поместите его на лед для последующего использования.
5. Подготовьте 1 мл среды клеточной культуры, содержащей 1 зл ИДСО, и назовите этот буфер повторной блокировки DMSO. Подготовьте 1 мл медиа-носителя RPMI, содержащего 1 кЛ из 200 ММ МЛи-2, и назовите этот буфер повторной подвески MLi-2.
6. После 30 мин инкубационного периода, центрифуга обе трубы на 335 х г в течение 5 минут.
7. Тщательно отбросьте супернатант в каждой трубке, не нарушая нейтрофил гранулы.
8. Для DMSO помечены образца осторожно resuspend гранулы в 1 мл буфера перезагрузки DMSO и для MLi-2 помечены трубки, resuspend гранулы в 1 мл буфера resuspension MLi-2.
9. Перенесите перекрываемые клеточные гранулы на соответствующие центрифугировые трубки с пометками "DMSO" и "MLi-2" и центрифугу обе трубы на 335 х г в течение 3 мин.
10. Во время шага центрифугации подготовьте буфер лиза. В дымовый капот тщательно добавляйте 0,25 л раствора DIFP 0,5 М, а также 0,25 л 1 мг/мл микроцистина-LR в буфер излизы 0,25 мл. Смешайте и оставьте на льду до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте DIFP в буфер лисиса в пределах 15 минут клеточного лиза, потому что DIFP относительно нестабилен в водной растворе.
11. Сразу после центрифугации тщательно и полностью удалите весь супернатант пипеткой, не нарушая нейтрофильные гранулы, и помещайте трубки на лед.
12. Немедленно добавьте 100 юаней буфера lysis содержа DIFP и microcystine-LR к каждой пробке. Используя пипетку 100-200 л, resuspend клеточные гранулы труба вверх и вниз около 5-10x.
13. Вылеждь клетки на льду в течение 10 минут.
14. Центрифуги трубки на 20000 х г в течение 15 минут при 4 кв КС, чтобы удалить мусор клеток.
15. Перенесите супернационты «ДМСО» и «МЛи-2», содержащие нейтрофильные лизаты, в новые центрифугиваемые трубки. Отбросьте гранулы мусора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: лизаты нейтрофилов теперь готовы к использованию или могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 градусов по Цельсию для будущего анализа.

Результаты

Наш анализ позволяет проводить допрос активации PD-ассоциированной киназы LRRK2 в нейтрофилах периферической крови человека с фосфорилированием LRRK2 в качестве считывания. Нейтрофилы являются однородной и обильной периферической популяции белых кровяных клеток, которая выражает высоки?...

Обсуждение

Принудительные клинические, генетические и биохимические данные указывают на важную роль для LRRK2 и, в частности, его функции киназы при болезни Паркинсона⁷. LRRK2 ингибиторы киназы были разработаны и вступают клинических испытаний^2,,4,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	MJFF-total Rab10 mouse antibody