Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리

요약

류신이 풍부한 반복 키나아제 2 유전자(LRRK2)의 돌연변이는 유전성 파킨슨병을 일으킨다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에서 Rab10의 LRRK2 대조 인산화를 평가하기위한 쉽고 강력한 방법을 개발했습니다. 이 증가 LRRK2 키 나 제 통로 활동을 가진 개인을 식별 하는 데 도움이 수 있습니다.

초록

류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)는 유전성 파킨슨병(PD)에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며 모든 병원성 LRRK2 돌연변이는 키나아제 기능의 과활성화를 초래한다. 여기서, 우리는 그것의 생리적 기질 중 하나인 Rab10을 트레오닌 73에서 LRRK2 대조 포스포릴화를 측정함으로써 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 키나아제 통로 활성을 정량화하는 쉽고 강력한 분석방법을 기술한다. 기재된 면역블로팅 분석은 MJFF-pRab10 토끼 모노클로날 항체와 같은 LRRK2에 의해 인산화된 Rab10 Thr73 에피토프를 인식하는 완전 선택적 및 인광특이적 항체를 필요로 한다. 말초 혈액은 쉽게 접근 할 수 있고 호중구는 풍부하고 균일 한 구성 요소이기 때문에 인간의 말초 혈액 호중구를 사용합니다. 중요한 것은, 호중구는 LRRK2와 Rab10 둘 다의 상대적으로 높은 수준을 표현합니다. 호중구의 잠재적인 단점은 그들의 높은 본질적인 세린 프로테아제 활성, 유기 인스포러스 신경 독소 디이소프로필플루오로프포스산염 (DIFP)와 같은 매우 강력한 프로테아제 억제제의 사용을 필요로 하는 리시저 완충제의 일부입니다. 그럼에도 불구하고, 호중구는 생체 내에서 LRRK2 키나아제 통로 활성에 대한 연구를 위한 귀중한 자원이며 PD 생체 저장소 컬렉션에 포함시키는 것으로 고려되어야 한다.

서문

파킨슨 병 (PD)을 늦추거나 멈추려는 시도는 지금까지 실패했습니다. 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)에서 의한 과다 활성화 돌연변이의 발견은 PD에 대한 위험을 증가시키고 있거나 증가시키는 LRRK2 키나아제 억제제^1,,2,,3의발달로 이어졌다. 이들은 지금 임상 시험^4를입력했습니다. LRRK2의 정확한 기능은 불분명하지만, 주요 발전은 LRRK2 키나제^,5,6,7의첫 번째 보나 피라제 생리기로서 Rab10을 포함하는 랍 GTPase 단백질의 서브세트의 식별이었다.⁷ 질병 변형 치료제의 시대에 주요 과제는 LRRK2 키나아제 활성화 상태의 생화학적 마커및 LRRK2 키나제 억제제의 표적 결합이다.

지금까지, 생체 내 LRRK2 억제제의 주요 약동학 마커는 LRRK2의 구성적으로 인산화된 세린 잔기의 클러스터였으며, 특히 세린 935는 다양한 LRRK2^{억제제8,,9에}반응하여 탈인성화된다. 그러나, 세린 935 인산화는 LRRK2에 의해 직접적으로 인산화되지 않고 여전히 키나제 비활성^{LRRK2(10)에서}인산화되지 않기 때문에 본질적인 세포 LRRK2 키나아제 활성과 상관관계가 없다. LRRK2 키나아제 활성은 세린(1292)의 오토포스포릴레이션과 잘 상관되지만, 본^부위에,대한 신뢰할 수 있고 인특이적인 항체의 현재 부족으로 인해 전체 세포 추출물의 면역블롯 분석에 의한 내인성 LRRK2 키나아제 활성에 대한 적절한 판독은 실질적으로^아니다.

우리는 스레오닌 73^11에서LRRK2 대조 단백질 Rab10의 생리적 표적 인산화를 측정하는 인간 말초 혈액 세포에서 LRRK2 키나아제 경로 활성을 정량화하는 강력하고 쉬운 분석방법을 개발했습니다. 말초 혈액은 최소한의 불편을 일으키는 원인이 되는 낮은 리스크 그리고 빠른 절차인 베니섹션에 의해 쉽게 접근할 수 있습니다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에 초점을 맞추기 때문에 그들은 풍부 (모든 백혈구의 37-80%)와 LRRK2와 Rab10¹¹둘 다의 상대적으로 높은 수준을 발현하는 균질한 세포 인구. 더욱이, 말초 혈액 호중구는 면역자기 음성 접근법을 채택하여 신속하고 효율적으로 단리될 수 있다. 후속 관찰된 Rab10 인산화가 LRRK2에 의해 매개되도록 하기 위해, 호중구의 각 배치는 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제의 유무에 관계없이 배양된다(MLi-2를 사용하고 권장한다)^2,,12. 이어서 프로테아제 억제제 디이소프로필 플루오로포스페이트(DIFP)를 함유하는 완충제에서 세포 용해가 이어서^{호중구(13)에서}높은 것으로 알려진 본질적인 세린 프로테아제 활성을 억제하는 데 필요하다. 정량적 면역블로팅에 의한 최종 분석을 위해, Rab10 Thr73-phoepitope를 특이적으로 검출하고 다른 인산화 된 랍 단백질^(14)과교차 반응하지 않는 MJFF-pRab10 토끼 단클론 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 항체의 선택성 및 특이성은 상이한 랍 단백질 및 A549 Rab10 녹아웃^{세포주(14)의}과발현 모델에서 검증되었다. 따라서, 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제^2를이치에 없이 처리된 호중구 매립제에서 Rab10 인산화의 차이를 측정한다. 양자택일로, 견본은 또한 정량 질량 분석과 같은 그밖 방법에 의해 분석될 수 있었습니다.

결론적으로, LRRK2 대조군 Rab10 인산화는 세린 935및 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 인산화에 LRRK2 키나아제 활성의 우수한 마커이며, 인간 말초 혈액 호중구는 LRRK2에 대한 PD 연구에 귀중한 자원이다. 당사의 프로토콜은 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 경로 활성을 심문하는 강력하고 쉬운 분석을 제공하고 증가된 LRRK2 키나아제 활성^15를가진 개인의 생화학적 계층화를 허용한다. 중요하게는, 그러한 개인은 향후 LRRK2 키나아제 억제제 치료로부터 혜택을 받을 수 있다.

프로토콜

현지 영국 규정에 따르면 인간의 혈액의 모든 조작과 파이펫팅은 카테고리 2 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 모든 절차는 지역 윤리 검토 위원회에 따라 수행되었으며 모든 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 준비

1. 인산완식염수(PBS)에 100 mM EDTA를 함유한 EDTA 스톡 솔루션 1의 0.1 mL을 준비합니다.
2. PBS에서 1 mM EDTA를 포함하는 EDTA 스톡 솔루션 2의 60 mL을 준비하십시오.
3. 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5), 1 % (v / v) 트리톤 X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO_4,50 mM NaF를 포함하는 용해 버퍼를 준비, 10 mMM β-글리세로포스페이트, 5 mMM 파이로포스페이트, 0.27 M 수크로오스, 0.1% (v/v) β-메르카프토에탄올, 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 1 μg/mL 마이크로시스틴-LR, 및 0.5 mM 디이소프로필 플루포포스페이트(DP).
   참고 : 저자는 정기적으로 EDTA가없는 제품을 사용하지만 EDTA 함유 프로테아제 억제제 칵테일도 작동해야합니다. 용해 완충액은 β-메르카포에탄올, 프로테아제 억제제, 마이크로시스틴-LR 및 DIFP없이 사전에 이루어질 수 있으며, 사용 될 때까지 4°C에서 보관할 수 있다. β-메르카포에탄올, 프로테아제 억제제, 마이크로시스틴-LR 및 DIFP가 사용 직전에만 첨가되었는지 확인하십시오.
   주의: DIFP는 독성이 있으며 지역 보건 및 안전 위험 평가 후 연기 후드에서 주의해서 처리해야 합니다. DIFP는 용해 버퍼에 추가하고 즉시 사용할 수 있습니다. 대안적으로, DIFP를 포함한 모든 다른 성분을 포함하는 완전한 용해 완충제는 적어도 4주 동안 후속 사용을 위해 -80°C에서 aliquoted 및 저장될 수 있다.

2. 전혈에서 호중구 격리

1. 혈액 수집 튜브에 혈액 10 mL을 수집합니다. 튜브를 7-8x 반전하여 부드럽게 섞으세요.
2. 50 mL 원엽 튜브에 혈액 의 10 mL를 전송합니다.
3. EDTA 스톡 솔루션 100 μL을 혈액에 추가합니다. 부드럽게 섞으세요.
4. 호중구 절연키트(재료 표)에서500 μL의 분리 칵테일(50 μL/mL)을 전혈 샘플에 추가합니다.
5. 매우 미세한 자기 비드를 재중단시키기 위해 사용하기 전에 30s에 대한 호중구 격리 키트로부터 의 자기 비드를 소용돌이.
6. 혈액 샘플에 자기 비드 500 μL을 추가하고 튜브를 여러 번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
7. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
8. EDTA 스톡 솔루션 2로 튜브를 50 mL로 채웁니다. 위아래로 2-3x를 부드럽게 파이펫팅하여 섞으세요.
9. 튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 제거하여 튜브의 후속 교반을 피하십시오.
10. RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
11. 호중구를 포함하는 농축 된 세포 현탁액을 새로운 50 mL 원엽 튜브로 조심스럽게 피펫합니다.
    참고 : 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 말고 튜브 바닥에있는 적혈구의 수집 및 교란을 피하십시오. 적혈구 현탁액의 대략 10 mL를 관의 바닥에 뒤에 둡니다.
12. 사용 전에 30s의 자기 비드를 소용돌이시키고 농축 된 호중구를 함유하는 튜브에 자기 비드0.5 mL를 추가합니다. 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞으세요.
13. RT에서 5분 동안 배양합니다.
14. 튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 제거하여 후속 교반을 피하십시오.
15. RT에서 5분 동안 배양합니다.
16. 호중구를 포함하는 농축 된 세포 현탁액을 새로운 50 mL 원엽 튜브로 조심스럽게 피펫합니다.
    참고: 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 마십시오. 튜브 바닥에 현탁액의 약 5 mL를 둡니다.
17. 세포 혼합물에서 자기 비드를 완전히 제거하려면 농축 된 세포가 들어있는 튜브를 자석에 넣습니다.
18. RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
19. 순수 호중구를 함유하고 있는 농축 된 세포 현탁액을 새로운 50 mL 원엽 튜브에 조심스럽게 피펫합니다.
    참고: 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 마십시오. 튜브 바닥에 현탁액의 약 5 mL를 둡니다.
20. 단리된 세포를 1 mM EDTA 스톡 솔루션 2와 약 41 mL의 최종 부피와 혼합합니다. 파이펫을 위아래로 섞어 드시면 됩니다.
21. 각 튜브에서 약 20 mL로 용액을 두 개의 튜브로 균등하게 나눕니다.
22. 335 x g에서 5 분 동안 두 튜브를 원심 분리합니다.
23. 이 원심분리 동안 MLi-2 억제제 스톡(200 μM/1,000x 농도)을 -80°C 냉동고에서 꺼내서 후속 사용을 위해 RT에 둡니다.
24. 원심 분리 단계 직후와 튜브의 교반없이 호중구 펠릿을 방해하지 않고 상월체를 부어 냅니다. 각 세포 펠릿을 10 mL의 세포 배양배지(재료 표)에서RT에서 세포를 4배 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 중단합니다.

3. 순수 호중구의 LRRK2 키나아제 억제제 치료

1. 한 튜브 "DMSO"와 다른 튜브 "MLi-2"에 라벨을 붙입니다.
2. "DMSO" 라벨이 부착된 튜브에 10 μL의 DMSO를 추가하고 10mL 파이펫으로 2x 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다. "MLi-2" 라벨이 부착된 튜브에 200 μM MLi-2 스톡 솔루션(최종 농도 200 nM)의 10 μL을 추가하고 10mL 파이펫으로 2x 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
3. RT에서 30 분 동안 샘플을 배양하십시오.
4. 잠복기 동안, -80°C 냉동고에서 0.5M DIFP 스톡을 제거하고 얼음 위에 연기 후드에 놓습니다. -80°C 냉동고에서 1 mg/mL 마이크로시스틴-LR 스톡 용액을 제거하고 RT에 그대로 두어 해동합니다. 냉동고에서 용해 완충액의 aliquot (0.25 mL)를 가져 와서 RT에서 해동 한 다음 다음 다음 사용을 위해 얼음에 놓습니다.
5. DMSO의 1 μL을 포함하는 세포 배양 배지의 1 mL을 준비하고 이 DMSO 재서스펜션 버퍼를 호출한다. 200 μM MLi-2의 1 μL을 포함하는 RPMI 매체의 1 mL를 준비하고 이 MLi-2 재서스펜션 버퍼를 호출합니다.
6. 30 분 잠복기 후, 5 분 동안 335 x g에서 두 튜브를 원심 분리.
7. 호중구 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브의 상급자를 조심스럽게 버리십시오.
8. DMSO 표지 시료의 경우 DMSO 재서스펜션 버퍼의 1mL에서 펠릿을 부드럽게 재중단하고 MLi-2 라벨링 된 튜브의 경우 MLi-2 재서스펜션 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
9. 재중단된 세포 펠릿을 "DMSO" 및 "MLi-2" 라고 표시된 해당 원심분리 관으로 옮기고 두 튜브를 335 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
10. 원심분리 단계 동안 용해 완충기를 준비합니다. 연기 후드에서 0.25 mM DIFP 용액의 0.25 μL뿐만 아니라 0.25 mL 의 마이크로 시스틴-LR0.25 mL 용해 버퍼를 신중하게 추가합니다. 섞어서 사용할 때까지 얼음위에 두십시오.
    참고: DIFP는 수성 용액에서 상대적으로 불안정하기 때문에 셀 용해 15분 이내에 용해 버퍼에 DIFP를 추가합니다.
11. 원심 분리 직후 호중구 펠렛을 방해하지 않고 피펫으로 모든 상급자를 조심스럽게 완전히 제거하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
12. 즉시 각 튜브에 DIFP 및 마이크로시스틴-LR을 함유한 용해 완충액 100 μL을 추가합니다. 100-200 μL 파이펫을 사용하여 약 5-10x를 위아래로 파이펫팅하여 셀 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
13. 10 분 동안 얼음에 세포를 용해.
14. 세포 파편을 제거하기 위해 4 °C에서 15 분 동안 20,000 x g의 원심 분리튜브.
15. 호중구를 함유하는 "DMSO" 및 "MLi-2" 상피제를 새로운 원심분리관으로 옮긴다. 파편 펠릿을 버리십시오.
    참고: 호중구 용해염은 이제 사용할 준비가 되거나 액체 질소로 냉동되어 향후 분석을 위해 -80°C에 보관할 수 있습니다.

결과

우리의 분석법은 LRRK2 의존적 Rab10 인산화를 판독으로 인간 말초 혈액 호중구에서 PD 관련 LRRK2 키나아제의 활성화를 심문할 수 있게 한다. 호중구는 LRRK2 및 Rab10 단백질 둘 다의 상부를 발현하는 균질하고 풍부한 말초 백혈구 집단이다(그림1). 두 단백질의 높은 사본 수를 가진 나머지 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 중 유일한 그밖 세포 인구는 단핵구입니다, 그러나 이들은 백혈구?...

토론

강력한 임상, 유전 및 생화학적 증거는 LRRK2및 특히 파킨슨 병에서 의 키나아제 기능에 대한 중요한 역할을^지적7. LRRK2 키나아제 억제제가 개발되어 임상 시험^2,,4,,12에진입하고 있다. 이와 같이 LRRK2를 환자 계층화뿐만 아니라 표적 참여에 대한 바이오마커로 활용할 필요성이 있다. 당사의 프로토콜은 인간 말?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	MJFF-total Rab10 mouse antibody