Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

Özet

Lösin bakımından zengin tekrarlayan kiaz 2 genindeki (LRRK2) mutasyonlar kalıtsal Parkinson hastalığına neden olur. İnsan periferik kan nötrofillerinde Rab10'un LRRK2 kontrollü fosforilasyonunun değerlendirilmesi için kolay ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu artmış LRRK2 kinaz yolu aktivitesi olan bireylerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Özet

Lösin zengini tekrarlayan kiziaz 2 (LRRK2) kalıtsal Parkinson hastalığında (PH) en sık mutasyona uğrayan gendir ve tüm patojenik LRRK2 mutasyonları kizaz fonksiyonunun hiperaktivasyonuile sonuçlanır. Burada, fizyolojik substratlarından biri olan Rab10'un threonine 73'teki LRRK2 kontrollü fosforilasyonunu ölçerek insan periferik kan nötrofillerindeki LRRK2 kiyazı yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir tahkikat tanımlıyoruz. Açıklanan immünolot analizi, MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor gibi LRRK2 tarafından fosforile rab10 Thr73 epitopunu tanıyan tam seçici ve fosfospesifik antikor gerektirir. Periferik kan kolayca erişilebilir ve nötrofiller bol ve homojen bir bileşen dir, çünkü insan periferik kan nötrofilkullanır. Daha da önemlisi, nötrofiller hem LRRK2 hem de Rab10'un nispeten yüksek düzeylerini ifade eder. Nötrofillerin potansiyel bir dezavantajı yüksek içsel serin proteaz aktivitesidir, bu da lisis tamponunun bir parçası olarak organofosfor nörotoksin diisopropilorofosfat (DIFP) gibi çok güçlü proteaz inhibitörlerinin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo LRRK2 kiyazı yolu aktivitesi araştırma için değerli bir kaynak ve PD biyorepozitory koleksiyonlarına dahil edilmesi için düşünülmelidir.

Giriş

Parkinson hastalığını (PH) yavaşlatmaya veya durdurma girişimleri şimdiye kadar başarısız oldu. Lösin zengin tekrar kilaz 2 hiperaktivasyon mutasyonlarının keşfi (LRRK2) neden ve / veya PH riskini artırmak LRRK2 kiyaz inhibitörleri^gelişimineyol açmıştır^{1 ,2,3}. Bunlar artık klinik^{çalışmalara}girdik 4 . LRRK2 tam işlevi belirsizdir, ama büyük bir ilerleme Rab GTPase proteinlerin bir alt kümesinin belirlenmesi olmuştur, Rab10 dahil, LRRK2 kisenin ilk iyi niyetli fizyolojik substratları olarak^5,6,7. Hastalık değiştirici terapötikler çağında kisa ların temel zorlukları LRRK2 kizaz aktivasyon durumunun biyokimyasal belirteçleri ve LRRK2 kiyaz inhibitörlerinin hedef katılımıdır.

Şimdiye kadar, vivo LRRK2 inhibitörleri için temel farmakokinetik belirteç lrrk2 kurucu fosforile serin kalıntıları bir küme olmuştur, özellikle serine 935, çeşitli LRRK2 inhibitörleri yanıt olarak fosforilted hale^8,9. Ancak, serine 935 fosforilasyon doğrudan LRRK2 tarafından fosforile değildir ve hala kilaz-inaktif LRRK2¹⁰fosforile çünkü içsel hücresel LRRK2 kiziz aktivitesi ile ilişkili değildir. LRRK2 kinasaktivitesi serin1292 otofosforilasyon ile iyi ilişkilidir, ama pratik açısından bu site için güvenilir ve fosfospesifik antikorların mevcut eksikliği nedeniyle tüm hücre özleri immünoblot analizi ile endojen LRRK2 kinaz aktivitesi için uygun bir okuma değil^10,11.

Biz threonine 73¹¹de fizyolojik hedef protein Rab10 LRRK2 kontrollü fosforilasyon ölçer insan periferik kan hücrelerinde LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için sağlam ve kolay bir taht geliştirdik. Periferik kana, düşük riskli ve en az rahatsızlığa neden olan hızlı bir işlem olan venekesit ile kolayca ulaşılabilir. Onlar bol (tüm beyaz kan hücrelerinin% 37-80) ve hem LRRK2 ve Rab10¹¹nispeten yüksek düzeyde ifade homojen hücre popülasyonu oluşturmak çünkü biz insan periferik kan nötrofiller odaklanmak. Ayrıca, periferik kan nötrofilleri immünomanyetik negatif yaklaşım la hızlı ve verimli bir şekilde izole edilebilir. Sonraki gözlenen Rab10 fosforilasyon LRRK2 aracılık olduğundan emin olmak için, nötrofil her toplu veya güçlü ve seçici LRRK2 kiyaz inhibitörü olmadan kuluçka (biz kullanmak ve MLi-2 tavsiye)^2,12. Bu daha sonra proteaz inhibitörü diisopropil florofosfat içeren bir tampon hücre lisis i takip (DIFP), nötrofiller yüksek olduğu bilinen içsel serin prote proteaz aktivitesini bastırmak için gerekli olan¹³. Kantitatif immünoblotting tarafından son analiz için, özellikle Rab10 Thr73-fosfoepitop algılar ve diğer fosforile Rab proteinleri ile çapraz tepki vermez MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor kullanmanızı öneririz¹⁴. Bu antikor seçiciliği ve özgüllüğü farklı Rab proteinleri ve A549 Rab10 knock-out hücre hattı¹⁴aşırı ekspresyon modellerinde doğrulanmıştır. Böylece, güçlü ve seçici LRRK2 kinaz inhibitörü²ile tedavi edilmiş nötrofil lysates Rab10 fosforilasyon farkı ölçmek . Alternatif olarak, örnekler nicel kütle spektrometresi gibi diğer yöntemlerle de analiz edilebilir.

Sonuç olarak, LRRK2 kontrollü Rab10 fosforilasyon serin 935 de LRRK2 fosforilasyon LRRK2 kiziaz aktivitesinin üstün bir belirteç ve insan periferik kan nötrofiller LRRK2 içine PD araştırma için değerli bir kaynaktır. Protokolümüz periferik kan nötrofillerinde LRRK2 yol aktivitesini sorgulamak için sağlam ve kolay bir tahkikat sağlar ve artmış LRRK2 kinaz aktivitesi¹⁵olan bireylerin biyokimyasal tabakalaşmasını sağlar. Daha da önemlisi, bu tür bireyler gelecekteki LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisinden yararlanabilirler.

Protokol

Yerel İngiltere mevzuatına göre insan kanının tüm manipülasyonları ve borulama bir kategori 2 biyolojik güvenlik kabinesinde üstlenilir. Tüm prosedürler yerel etik inceleme kuruluna uygun olarak gerçekleştirildi ve tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onay verdi.

1. Hazırlık

1. Fosfat tamponlu salinde (PBS) 100 mM EDTA içeren 0,1 mL EDTA Stok Çözeltisi 1 hazırlayın.
2. PBS'de 1 mM EDTA içeren 60 mL EDTA Stok Çözeltisi 2 hazırlayın.
3. 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), %1 (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF içeren lysis tamponunu hazırlayın, 10 mM β-gliserinosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.27 M sakaroz, %0.1 (v/v) β-mercaptoetanol, 1x proteaz inhibitör kokteyli, 1 μg/mL microcystin-LR ve 0.5 mM diisoylprop florosfat (DIFP).
   NOT: Yazarlar rutin bir EDTA içermeyen ürün kullanmak, ancak edta içeren proteaz inhibitörü kokteyl de çalışması gerekir. Lysis tamponu β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP olmadan önceden yapılabilir ve kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir. Β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP'nin kullanımdan hemen önce eklenmediğinden emin olun.
   DİkKAT: DIFP toksiktir ve yerel sağlık ve güvenlik risk değerlendirmesi sonrasında bir duman başlık içinde özenle ele alınmalıdır. DIFP lysis tamponekleyebilir ve hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, DIFP dahil diğer tüm bileşenleri içeren tam lisis tampon, aliquoted ve en az 4 hafta boyunca sonraki kullanım için -80 °C'de saklanabilir.

2. Tam kandan nötrofil izolasyonu

1. Bir kan toplama tüpü içine 10 mL kan toplayın. Tüpleri 7−8x ters çevirerek hafifçe karıştırın.
2. 10 mL'lik kanın 50 mL konik tüpe aktarılması.
3. Kana 100 μL EDTA Stok Çözeltisi 1 ekleyin. Yavaşça karıştırın.
4. Nötrofil izolasyon kitinden(Malzeme Tablosu)tüm kan örneğine 500 μL izolasyon kokteyli (50 μL/mL) ekleyin.
5. Çok ince manyetik boncukları yeniden askıya almak için kullanılmadan önce nötrofil izolasyon kitinden gelen manyetik boncukları 30 s'lik bir giriş için girdap.
6. Kan örneğine manyetik boncukların 500 μL'sini ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
7. 5 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübat.
8. TÜPÜ EDTA Stok Çözümü 2 ile 50 mL'ye doldurun. Çok yavaşça yukarı ve aşağı 2-3x pipetting tarafından karıştırın.
9. Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve tüp sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.
10. RT'de 10 dakika kuluçka.
11. Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet.
    NOT: Mıknatısla temas halindeolan tüpün yan tarafına dokunmayın ve tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerinin toplanmasından ve tedirgin edilmesinden kaçının. Tüpün alt kısmında kırmızı kan hücresi süspansiyonyaklaşık 10 mL bırakın.
12. Kullanmadan önce 30 s için manyetik boncukvor ve zenginleştirilmiş nötrofiller içeren tüp için manyetik boncuk0.5 mL ekleyin. Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın.
13. 5 dakika RT'de kuluçka.
14. Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.
15. 5 dakika RT'de kuluçka.
16. Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet.
    NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın.
17. Hücre karışımından manyetik boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için, zenginleştirilmiş hücreleri içeren tüpü mıknatısın içine yerleştirin.
18. RT'de 10 dakika kuluçka.
19. Şimdi yeni bir 50 mL konik tüp içine saf nötrofiller içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon dikkatle pipet.
    NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın.
20. İzole hücreleri 1 mM EDTA Stok Çözeltisi 2 ile yaklaşık 41 mL'lik son hacmi karıştırın. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.
21. Çözeltiyi her tüpte yaklaşık 20 mL olan iki tüpe eşit olarak bölün.
22. Santrifüj her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk.
23. Bu santrifüj sırasında MLi-2 inhibitör stokunu (200 μM/1000x konsantrasyon) -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve daha sonra kullanılmak üzere RT'de bırakın.
24. Santrifüj adımından hemen sonra ve tüplerin ajitasyonu olmadan, nötrofil peletrahatsız olmadan supernatant dökün. Rt'de hücre kültürü ortamının 10 mL'lik(Malzeme Tablosu)her hücre peletini, hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı 4 kat borulayarak yeniden askıya alın.

3. Saf nötrofillerin LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisi

1. Etiket bir tüp "DMSO" ve diğer tüp "MLi-2".
2. "DMSO" etiketli tüpe 10 μL DMSO ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın. "MLi-2" etiketli boruya 10 μL 200 μM MLi-2 stok çözeltisi (son konsantrasyon 200 nM) ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın.
3. Rt. Kuluçka sırasında her 10 dakikada bir inversiyon ile hafifçe karıştırın.
4. Kuluçka döneminde 0,5 M DIFP stoğunu -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde bir duman kaputuna yerleştirin. -80 °C'lik dondurucudan 1 mg/mL mikrosistin-LR stok çözeltisini çıkarın ve erimeye RT'de bırakın. Dondurucudan bir aliquot (0.25 mL) alın, RT'de çözülmesine izin verin ve daha sonra kullanmak üzere buzüzerine yerleştirin.
5. 1 μL DMSO içeren hücre kültürü ortamının 1 mL'sini hazırlayın ve bu DMSO resuspension arabelleği çağırın. 1 μL 200 m MM MLi-2 içeren 1 mL RPMI ortam hazırlayın ve bu MLi-2 resuspension tamponu deyin.
6. 30 dk kuluçka süresinden sonra her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk santrifüj edin.
7. Dikkatle nötrofil pelet rahatsız etmeden her tüp içinde supernatant atın.
8. DMSO etiketli numune için pelet, DMSO resuspension tamponunun 1 mL'inde ve MLi-2 etiketli tüp için, MLi-2 resuspension tamponunun 1 mL'inde peleti hafifçe askıya alın.
9. Resuspended hücre peletlerini "DMSO" ve "MLi-2" etiketli ilgili santrifüj tüplerine aktarın ve her iki tüpü de 3 3 dk boyunca 335 x g'da santrifüj edin.
10. Santrifüj adımında, lysis tamponunu hazırlayın. Duman kaputuna 0,25 μL 0,5 M DIFP çözeltisi ve 0,25 μL 1 mg/mL mikrosisin-LR 0,25 mL likörü tamponuna dikkatlice ekleyin. Karıştırın ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.
    NOT: DIFP sulu bir çözeltide nispeten kararsız olduğundan, hücre lisisinin 15 dakika içindeki lysis arabelleğine DIFP ekleyin.
11. Santrifüjden hemen sonra, nötrofil peletini rahatsız etmeden tüm supernatant'ı bir pipetle dikkatlice ve tamamen çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin.
12. Her tüpe hemen DIFP ve mikrosistin-LR içeren 100 μL likis tamponekleyin. 100-200 μL pipet kullanarak hücre peletlerini yaklaşık 5-10 x yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.
13. Hücreleri 10 dakika boyunca buzüzerinde lyse.
14. Hücre enkazLarını temizlemek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 20.000 x g'lık santrifüj tüpleri.
15. Nötrofil lisatlarını içeren "DMSO" ve "MLi-2" süpernatantlarını yeni santrifüj tüplerine aktarın. Enkaz peletini atın.
    NOT: Nötrofil lysates kullanıma hazır dır veya sıvı nitrojende dondurulmuş ve ileride analiz için -80 °C'de saklanabilir.

Sonuçlar

Bizim taht bir okuma olarak LRRK2 bağımlı Rab10 fosforilasyon ile insan periferik kan nötrofillerinde PD ilişkili LRRK2 kizaz aktivasyonu sorgulama sağlar. Nötrofiller, hem LRRK2 hem de Rab10 proteinlerinin yüksek düzeylerini ifade eden homojen ve bol periferik beyaz kan hücresi popülasyonudur(Şekil 1). Kalan periferik kan mononükleer hücreleri arasında kalan tek hücre popülasyonu (PBMCs) her iki proteinin yüksek kopya numaraları monositler, ancak bu beyaz kan hücrelerini...

Tartışmalar

Zorlayıcı klinik, genetik ve biyokimyasal kanıtlar LRRK2 için önemli bir rol doğru işaret ve özellikle Parkinson hastalığında kizaz fonksiyonu⁷. LRRK2 kiyaz inhibitörleri geliştirilmiştir ve klinik çalışmalara giriyorsunuz^2,4,12. Bu nedenle, lrrk2'nin hedef katılımı ve hasta tabakalaşması için bir biyomarker olarak sömürülmesine ihtiyaç vardır. Protokolümüz, insan periferik k...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	MJFF-total Rab10 mouse antibody