Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

Zusammenfassung

Mutationen im Leucin-reichen Repeatkinase-2-Gen (LRRK2) verursachen eine erbliche Parkinson-Krankheit. Wir haben eine einfache und robuste Methode zur Beurteilung der LRRK2-kontrollierten Phosphorylierung von Rab10 bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen entwickelt. Dies kann helfen, Personen mit erhöhter LRRK2-Kinase-Signalweg-Aktivität zu identifizieren.

Zusammenfassung

Die leucinreiche Wiederholungskinase 2 (LRRK2) ist das am häufigsten mutierte Gen bei der erblichen Parkinson-Krankheit (PD) und alle pathogenen LRRK2-Mutationen führen zu einer Hyperaktivierung seiner Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir einen einfachen und robusten Test zur Quantifizierung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen, indem wir die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung eines seiner physiologischen Substrate, Rab10 bei Threonin 73, messen. Die beschriebene Immunoblotting-Analyse erfordert einen vollständig selektiven und phosphospezifischen Antikörper, der das von LRRK2 phosphorylierte Rab10 Thr73-Epitop erkennt, wie z. B. den monoklonalen Antikörper MJFF-pRab10 Kaninchen. Es verwendet menschliche periphere Blutneutrophilen, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist und Neutrophile ein reichlicher und homogener Bestandteil sind. Wichtig ist, dass Neutrophile relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 und Rab10 ausdrücken. Ein potenzieller Nachteil von Neutrophilen ist ihre hohe intrinsische Serinproteaseaktivität, die die Verwendung sehr potenter Proteasehemmer wie dem Organophosphor-Neurotoxin Diisopropylfluorphosphat (DIFP) als Teil des Lysepuffers erfordert. Dennoch sind Neutrophile eine wertvolle Ressource für die Erforschung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität in vivo und sollten für die Aufnahme in PD-Biorepository-Sammlungen in Betracht gezogen werden.

Einleitung

Versuche, die Parkinson-Krankheit (PD) zu verlangsamen oder zu stoppen, sind bisher gescheitert. Die Entdeckung hyperaktivierender Mutationen in der leucinreichen Repeatkinase 2 (LRRK2), die das Risiko für PD verursachen und/oder erhöhen, hat zur Entwicklung von LRRK2-Kinase-Inhibitoren^1,2,3geführt. Diese sind nun in klinische Studien aufgenommen⁴. Die genaue Funktion von LRRK2 ist unklar, aber ein großer Fortschritt war die Identifizierung einer Teilmenge von Rab GTPase Proteinen, einschließlich Rab10, als die ersten gutgläubigen physiologischen Substrate der LRRK2 Kinase^5,6,7. Die wichtigsten Herausforderungen im Zeiten der krankheitsmodifizierenden Therapeutika sind biochemische Marker des LRRK2-Kinase-Aktivierungsstatus und das gezielte Engagement von LRRK2-Kinase-Inhibitoren.

Bisher war der wichtigste pharmakokinetische Marker für LRRK2-Inhibitoren in vivo ein Cluster konstitutiv phosphorylierter Serinrückstände von LRRK2, insbesondere Serin 935, die als Reaktion auf verschiedene LRRK2-Inhibitoren^8,9dephosphoryliert werden. Die serinfarbene 935-Phosphorylierung korreliert jedoch nicht mit der intrinsischen zellulären LRRK2-Kinase-Aktivität, da sie nicht direkt von LRRK2 phosphoryliert wird und immer noch in Kinase-inaktivem LRRK2¹⁰phosphoryliert wird. Die LRRK2-Kinase-Aktivität korreliert gut mit der Autophosphorylierung des Serins 1292, ist aber praktisch keine geeignete Auslesung für die endogene LRRK2-Kinase-Aktivität durch Immunoblot-Analyse ganzer Zellextrakte aufgrund des aktuellen Mangels an zuverlässigen und phosphospezifischen Antikörpern für diese Stelle^10,11.

Wir haben einen robusten und einfachen Test entwickelt, um die Aktivität des LRRK2-Kinase-Signalwegs in menschlichen peripheren Blutzellen zu quantifizieren, der die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung seines physiologischen Zielproteins Rab10 an Threonin 73¹¹misst. Peripheres Blut ist leicht zugänglich durch Venesection, Das ist ein geringes Risiko und schnelle Verfahren, das minimale Beschwerden verursacht. Wir konzentrieren uns auf menschliche periphere Blutneutrophile, weil sie eine reichliche (37-80% aller weißen Blutkörperchen) und homogene Zellpopulation, die relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 und^Rab11ausdrückt. Darüber hinaus können periphere Blutneutrophile schnell und effizient isoliert werden, indem ein immunmagnetischer negativer Ansatz verwendet wird. Um sicherzustellen, dass die anschließende beobachtete Rab10-Phosphorylierung durch LRRK2 vermittelt wird, wird jede Charge Neutrophilen mit oder ohne potenten und selektiven LRRK2-Kinase-Inhibitor inkubiert (wir verwenden und empfehlen MLi-2)^2,12. Es folgt eine Zelllyse in einem Puffer, der den Protease-Inhibitor Diisopropylfluorphosphat (DIFP) enthält, der zur Unterdrückung der intrinsischen Serinproteaseaktivität notwendig ist, die bei Neutrophilen bekannt ist¹³. Für die abschließende Analyse durch quantitative Immunoblotting empfehlen wir die Verwendung des monoklonalen Antikörpers MJFF-pRab10 Kaninchen, der das Rab10 Thr73-Phosphoepitop spezifisch detektiert und nicht mit anderen phosphorylierten Rab-Proteinen¹⁴kreuzreagiert. Selektivität und Spezifität dieses Antikörpers wurden in Überexpressionsmodellen verschiedener Rab-Proteine und einer A549 Rab10-Knock-out-Zelllinie¹⁴validiert. So messen wir den Unterschied in der Rab10-Phosphorylierung in neutrophilen Lysaten, die mit und ohne einen potenten und selektiven LRRK2-Kinase-Inhibitor²behandelt wurden. Alternativ könnten Proben auch mit anderen Methoden, wie z. B. der quantitativen Massenspektrometrie, analysiert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die LRRK2-gesteuerte Rab10-Phosphorylierung ein überlegener Marker der LRRK2-Kinase-Aktivität zur LRRK2-Phosphorylierung bei Serin 935 und humanen peripheren Blutneutrophilen ist eine wertvolle Ressource für die PD-Forschung zu LRRK2. Unser Protokoll bietet einen robusten und einfachen Test zur Abhörung der LRRK2-Signalwegaktivität bei peripheren Blutneutrophilen und ermöglicht eine biochemische Schichtung von Personen mit erhöhter LRRK2-Kinaseaktivität¹⁵. Wichtig ist, dass solche Personen von der zukünftigen Behandlung von LRRK2-Kinase-Hemmern profitieren können.

Protokoll

Gemäß der lokalen britischen Verordnung werden alle Manipulationen und Pipettierungen von menschlichem Blut in einem biologischen Sicherheitsschrank der Kategorie 2 durchgeführt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem lokalen Ethik-Überprüfungsausschuss durchgeführt und alle Teilnehmer haben in Kenntnis der Sachlage ihre Zustimmung erteilt.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie 0,1 ml EDTA-Lagerlösung 1 mit 100 mM EDTA in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor.
2. Bereiten Sie 60 ml EDTA-Lagerlösung 2 mit 1 mM EDTA in PBS vor.
3. Vorbereiten von Lysepuffermitenthalten mit 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 mM -Glyzerophosphat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,27 M Saccharose, 0,1% (v/v) -Mercaptoethanol, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail, 1 g/ml Mikrocystin-LR und 0,5 mM Diisopropylfluorphosphat (DIFP).
   HINWEIS: Die Autoren verwenden routinemäßig ein EDTA-freies Produkt, aber ein EDTA-haltiger Protease-Hemmer-Cocktail sollte auch funktionieren. Der Lysepuffer kann im Voraus ohne die Mercaptoethanol-, Proteasehemmer, Microcystin-LR und DIFP hergestellt und bis zur Anwendung bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass das Mercaptoethanol, die Proteasehemmer, Microcystin-LR und DIFP erst unmittelbar vor der Anwendung zugesetzt werden.
   VORSICHT: DIFP ist toxisch und sollte nach der lokalen Bewertung des Gesundheits- und Sicherheitsrisikos mit Vorsicht in einer Dunstabzugshaube behandelt werden. DIFP kann dem Lysepuffer hinzugefügt und sofort verwendet werden. Alternativ kann der komplette Lysepuffer, der alle anderen Komponenten, einschließlich DIFP, enthält, für die spätere Verwendung mindestens 4 Wochen lang aliquoted und bei -80 °C gelagert werden.

2. Neutrophile Isolation aus Vollblut

1. Sammeln Sie 10 ml Blut in ein Blutentnahmeröhrchen. Mischen Sie sanft, indem Sie Rohre 7 x 8x invertieren.
2. 10 ml Blut in ein 50 ml konisches Rohr geben.
3. Fügen Sie 100 L EDTA-Lagerlösung 1 ins Blut. Mischen Sie sanft.
4. Fügen Sie der Blutprobe 500 l des Isolationscocktails (50 l/ml) aus dem Neutrophilen-Isolationskit (Materialtabelle)hinzu.
5. Wirbeln Sie die magnetischen Perlen aus dem Neutrophilen-Isolationskit für 30 s vor dem Gebrauch, um die sehr feinen magnetischen Perlen wieder auszusetzen.
6. Fügen Sie der Blutprobe 500 l der magnetischen Perlen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Röhre mehrmals invertieren.
7. Bei Raumtemperatur (RT) für 5 min inkubieren.
8. Füllen Sie das Rohr auf 50 ml mit EDTA Stock Solution 2. Mischen Sie durch sehr sanfte Pipettierung nach oben und unten 2-3x.
9. Legen Sie das Rohr in den Magneten und entfernen Sie den Deckel, um eine nachträgliche Rührung des Rohres zu vermeiden.
10. 10 min bei RT inkubieren.
11. Die angereicherte Zellsuspension, die die Neutrophilen enthält, sorgfältig in ein neues 50 ml konisches Rohr zu zerlegen.
    HINWEIS: Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt, und vermeiden Sie die Entnahme und Störung der roten Blutkörperchen an der Unterseite des Rohres. Lassen Sie ca. 10 ml der roten Blutkörperchen Suspension am Boden der Röhre.
12. Wirbeln Sie die magnetischen Perlen für 30 s vor Gebrauch und fügen Sie 0,5 ml der magnetischen Perlen in die Röhre mit den angereicherten Neutrophilen. Mischen Sie sanft, indem Sie das Rohr invertieren.
13. Inkubieren Bei RT für 5 min.
14. Legen Sie das Rohr in den Magneten und entfernen Sie den Deckel, um nachfolgende Rührung zu vermeiden.
15. Inkubieren Bei RT für 5 min.
16. Die angereicherte Zellsuspension, die die Neutrophilen enthält, sorgfältig in ein neues 50 ml konisches Rohr zu zerlegen.
    HINWEIS: Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt. Lassen Sie ca. 5 ml der Suspension an der Unterseite des Rohres.
17. Um die vollständige Entfernung von Magnetperlen aus dem Zellgemisch zu gewährleisten, legen Sie das Rohr mit den angereicherten Zellen in den Magneten.
18. 10 min bei RT inkubieren.
19. Die angereicherte Zellsuspension, die nun reine Neutrophilen enthält, in einem neuen 50 ml konischen Rohr sorgfältig pipette.
    HINWEIS: Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt. Lassen Sie ca. 5 ml der Suspension an der Unterseite des Rohres.
20. Mischen Sie die isolierten Zellen mit 1 mM EDTA Stock Solution 2 auf ein Endvolumen von ca. 41 ml. Pipette nach oben und unten zu mischen.
21. Teilen Sie die Lösung gleichmäßig in zwei Rohre mit ca. 20 ml in jedem Rohr.
22. Zentrifugieren Sie beide Rohre bei 335 x g für 5 min.
23. Während dieser Zentrifugation nehmen Sie den MLi-2-Inhibitorbestand (200 M/1.000x Konzentration) aus dem -80 °C Gefrierschrank und lassen Sie bei RT zur späteren Verwendung.
24. Unmittelbar nach dem Zentrifugationsschritt und ohne Rühren der Schläuche den Überstand abgießen, ohne die neutrophilen Pellets zu stören. Setzen Sie jedes Zellpellet in 10 ml Zellkulturmedien (Tabelle der Materialien) bei RT wieder auf, indem Sie Zellen 4x sanft nach oben und unten pipetieren.

3. LRRK2 Kinase-Inhibitor Behandlung von reinen Neutrophilen

1. Beschriften Sie eine Röhre "DMSO" und die andere Röhre "MLi-2".
2. Zum "DMSO" beschrifteten Rohr, fügen Sie 10 L DMSO hinzu und mischen Sie sanft, indem Sie 2x mit einer 10 ml Pipette auf und ab pfeifen. Zum beschrifteten Rohr "MLi-2" 10 L mit 200 M MM MLi-2-Lagerlösung (Endkonzentration 200 nM) hinzufügen und vorsichtig mischen, indem Sie 2x mit einer 10 ml Pipette auf und ab pfeifen.
3. Inkubieren Sie die Proben für 30 min bei RT. Mischen Sie sanft durch Inversion alle 10 min während der Inkubation.
4. Während der Inkubationszeit 0,5 M DIFP-Lager aus dem Gefrierschrank von -80 °C entfernen und in einer Dunstabzugshaube auf Eis stellen. 1 mg/ml Mikrocystin-LR-Stammlösung aus dem Gefrierschrank -80 °C entfernen und bei RT auftauen lassen. Nehmen Sie ein Aliquot (0,25 ml) des Lysepuffers aus dem Gefrierschrank, lassen Sie es bei RT auftauen und legen Sie es dann zur späteren Verwendung auf Eis.
5. Bereiten Sie 1 ml Zellkulturmedium vor, das 1 L DMSO enthält, und rufen Sie diesen DMSO-Resuspensionspuffer auf. Bereiten Sie 1 ml RPMI-Medien vor, die 1 L von 200 M MLi-2 enthalten, und rufen Sie diesen MLi-2-Resuspensionspuffer auf.
6. Nach der 30 min Inkubationszeit zentrieren beide Rohre bei 335 x g für 5 min.
7. Entsorgen Sie den Überstand in jedem Rohr vorsichtig, ohne das neutrophile Pellet zu stören.
8. Für die DMSO-markierte Probe das Pellet vorsichtig in 1 ml des DMSO-Resuspendiertpuffers und für das MLi-2-markierte Rohr wieder aufsetzen, setzen Sie das Pellet in 1 ml des MLi-2-Resuspensionspuffers wieder auf.
9. Übertragen Sie die resuspendierten Zellpellets in entsprechende Zentrifugationsröhrchen mit der Bezeichnung "DMSO" und "MLi-2" und Zentrifugen beider Rohre bei 335 x g für 3 min.
10. Bereiten Sie während des Zentrifugationsschritts den Lysepuffer vor. In der Dunstabzugshaube geben Sie dem 0,25 ml DiFP-Puffer vorsichtig 0,25 l 0,5 M DIFP-Lösung sowie 0,25 l 1 mg/ml Mikrocystin-LR hinzu. Mischen und auf Eis lassen, bis zum Gebrauch.
    HINWEIS: Fügen Sie DIFP dem Lysepuffer innerhalb von 15 min Zelllyse hinzu, da DIFP in einer wässrigen Lösung relativ instabil ist.
11. Unmittelbar nach der Zentrifugation den restaanten Überstand mit einer Pipette vorsichtig und vollständig entfernen, ohne das neutrophile Pellet zu stören, und die Schläuche auf Eis legen.
12. Fügen Sie sofort 100 l Lysepuffer mit DIFP und Mikrocystin-LR in jedes Rohr. Mit einer 100–200-L-Pipette können Sie die Zellpellets wieder aufhängen, indem Sie etwa 5–10x nach oben und unten pfeifen.
13. Lyse die Zellen auf Eis für 10 min.
14. Zentrifugenrohre bei 20.000 x g für 15 min bei 4 °C, um Zellablagerungen zu entfernen.
15. Übertragen Sie die Übertreibungen "DMSO" und "MLi-2", die die Neutrophilenlysate enthalten, in neue Zentrifugationsröhrchen. Entsorgen Sie das Trümmerpellet.
    HINWEIS: Die neutrophilen Lysate sind nun einsatzbereit oder können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C für zukünftige Analysen gelagert werden.

Ergebnisse

Unser Assay ermöglicht die Abhörung der PD-assoziierten LRRK2-Kinase bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen mit LRRK2-abhängiger Rab10-Phosphorylierung als Auslese. Neutrophile sind eine homogene und reichlich periphere weiße Blutkörperchenpopulation, die hohe Konzentrationen der LRRK2- und Rab10-Proteine ausdrückt (Abbildung 1). Die einzige andere Zellpopulation unter den verbleibenden peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit hoher Kopierzahl beider Proteine sind Monozyt...

Diskussion

Überzeugende klinische, genetische und biochemische Beweise deuten auf eine wichtige Rolle für LRRK2 und insbesondere seine Kinase-Funktion bei der Parkinson-Krankheit^{hin 7}. LRRK2-Kinase-Inhibitoren wurden entwickelt und gehen in klinische Studien^2,4,12. Daher ist es notwendig, LRRK2 als Biomarker für das Zielengagement sowie die Patientenschichtung zu nutzen. Unser Protokoll beschreibt einen robusten ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	MJFF-total Rab10 mouse antibody