דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

Summary

מוטציות ב לאוצין העשיר חזרה לחזור 2 גנים (LRRK2) לגרום למחלת פרקינסון תורשתית. פיתחנו שיטה קלה ואיתנה להערכת זרחון LRRK2 נשלט של Rab10 בדם היקפי הדם נויטרופילים. הדבר עשוי לסייע בזיהוי אנשים עם פעילות מסלול מוגברת של LRRK2 קינאז.

Abstract

הלוצין העשיר חוזר קינאז 2 (LRRK2) הוא הגן השכיח ביותר במחלת פרקינסון תורשתית (PD) וכל מוטציות LRRK2 פתוגניים התוצאה היפרהפעלה של הפונקציה קינאז שלה. כאן, אנו מתארים שיטת קל ויציב לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול היקפי דם היקפיים על ידי מדידת LRRK2 זרחון מבוקר של אחד מצעים פיזיולוגיים שלה, Rab10 ב טראונין 73. הניתוח החיסוני המתואר מחייב מאוד בררני ופוספנטי הנוגדן כי מזהה את Rab10 Thr73 אפירופה זרחזיום על ידי LRRK2, כגון נוגדן MJFF-pRab10 הארנב מונובטיים. הוא משתמש דם היקפית אנושי נויטרופילים, כי דם היקפי נגיש בקלות נויטרופילים הם מרכיב שופע הומוגנית. חשוב מכך, נויטרופילים לבטא רמות גבוהות יחסית של LRRK2 ו Rab10. חיסרון פוטנציאלי של נויטרופילים הוא הפעילות הפנימית הגבוהה סרין פרוטאז שלהם, אשר מחייבת את השימוש של מעכבי פרוטאז חזק מאוד כגון diisopropylfluorophosphate הרעלן העצבי זרחן (DIFP) כחלק מאגר לפירוק. עם זאת, נויטרופילים הם משאב רב ערך עבור מחקר לתוך פעילות מסלול LRRK2 קינאז ב vivo וצריך להיחשב עבור הכללה לתוך משטרת ביוריאטורי אוספים.

Introduction

נסיונות להאט או להפסיק את מחלת פרקינסון (PD) נכשלו עד כה. הגילוי של מוטציות היפראותיים ב-לאוצין לחזור על קינאז 2 (LRRK2) הגורמות ו/או הגברת הסיכון למשטרה הובילה לפיתוח מעכבי LRRK2 קינאז^1,2,3. אלה נכנסו עכשיו ניסויים קליניים⁴. הפונקציה המדויקת של LRRK2 אינו ברור, אבל התקדמות מרכזית כבר זיהוי של מערכת החלבונים של רב gtpase, כולל Rab10, כמו מצעים פיסיולוגיים בתום הראשון של הLRRK2 קינאז^5,6,7. אתגרים מרכזיים בעידן של מחלות-שינוי therapeutics הם סמנים ביוכימיים של מצב הפעלה LRRK2 קינאז והתחייבות היעד של מעכבי LRRK2 קינאז.

עד כה, הסמן העיקרי של פרמקוטיק לLRRK2 מעכבי ב vivo הייתה מקבץ של שאריות סרין בצורה מצטברת של LRRK2, בפרט סרין 935, אשר הפכו להיות בתגובה למעכבי LRRK2 שונים^8,9. עם זאת, סרין 935 זרחון אינו מתאם עם פעילות פנימית LRRK2 קינאז הפנימי משום שהוא אינו זרחי במישרין על-ידי LRRK2 והוא עדיין זרחבקינאז-לא פעיל LRRK2¹⁰. LRRK2 קינאז פעילות מתאימה היטב עם הוספולציה של סרין 1292, אבל זה במונחים מעשיים לא מתאים לפעילות אנדודוגני LRRK2 קינאז על-ידי ניתוח חיסוני כתמי של תמציות תאים שלמות בשל היעדר הנוכחי של נוגדנים אמינים ופוספוסקיים עבור אתר זה^10,11.

פיתחנו שיטת חזק וקל לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול בתאי הדם היקפיים האדם המודד LRRK2 זרחון מבוקר של חלבון היעד הפיזיולוגי שלה Rab10 ב טראונין 73¹¹. דם היקפי נגיש בקלות על ידי ונציה, שהוא סיכון נמוך והליך מהיר הגורם אי-נוחות מינימלית. אנו מתמקדים בגוף היקפי דם נויטרופילים כי הם מהווים שופע (37-80% של כל כדוריות הדם הלבנות) ואת האוכלוסייה תאים הומוגנית המבטא רמות גבוהות יחסית של שני LRRK2 ו Rab10¹¹. יתר על כן, דם היקפי נויטרופילים יכול להיות מבודד במהירות וביעילות על ידי שימוש בגישה שלילית אימונוגנטית. כדי להבטיח כי הנצפים לאחר מכן Rab10 זילציה מתווכת על ידי LRRK2, כל אצווה של נויטרופילים הוא מודבטים עם או בלי חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכבי (אנו משתמשים וממליצים mli-2)^2,12. זה ואחריו לאחר מכן הפירוק התא במאגר המכיל את מעכב פרוטאז diisopropyl fluorophosphate (difp), אשר הכרחי לדיכוי פעילות סרין פרוטאז מהותי כי ידוע להיות גבוה נויטרופילים¹³. לניתוח הסופי של האנליזה הכמותית, אנו ממליצים על שימוש בנוגדן MJFF-pRab10 הארנב שמזהה במפורש את Rab10 Thr73-פוספופאפיפ ואינו מגיב באמצעות חלבונים אחרים זרחתיים מסוג¹⁴. סלקטיביות וספציפיות של נוגדן זה אומת במודלים overexpression של חלבונים שונים של ראב ו A549 Rab10 לנקוש קו תא¹⁴. כך, אנו למדוד את ההבדל Rab10 זרחון ב נויטרופילים lysates כי כבר טופלו עם וללא חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכב². לחילופין, ניתן לנתח דגימות גם בשיטות אחרות, כגון ספקטרומטר מסה כמותי.

לסיכום, LRRK2 שבשליטת Rab10 זרחון הוא סמן מעולה של פעילות LRRK2 קינאז LRRK2 זרחון ב סרין 935 ו-היקפי הדם נויטרופילים היקפיים הם משאב רב ערך עבור מחקר PD לתוך LRRK2. הפרוטוקול שלנו מספק מעשה יציב וקל לחקור פעילות מסלול LRRK2 דם היקפיים נויטרופילים ומאפשר ריבוד ביוכימיים של אנשים עם פעילות מוגברת LRRK2 קינאז¹⁵. חשוב מכך, אנשים כאלה עשויים להפיק תועלת מטיפול מעכב LRRK2 קינאז עתידיים.

Protocol

על פי רגולציה בבריטניה המקומית כל המניפולציות וליטוף של דם אנושי נעשים בארון בטיחות בקטגוריה 2. כל ההליכים בוצעו בהתאם לועדת האתיקה המקומית וכל המשתתפים סיפקו הסכמה מושכלת.

1. הכנה

1. הכינו 0.1 mL של מניות EDTA פתרון 1 המכיל 100 mM EDTA ב-פוספט באגירה מלוחים (PBS).
2. הכינו 60 mL של פתרון מניות EDTA 2 המכיל 1 מ"מ EDTA ב-PBS.
3. הכנת מאגר לפירוק המכיל 50 mM טריס-HCl (pH = 7.5), 1% (v/v) טריטון X-100, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ Na₃VO₄, 50 mm naf, 10 מ"מ β-Glycerophosphate, 5 מילימטר נתרן פירופוספט, 0.27 M סוכות, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1 X מעכב פרוטאז קוקטייל, אחד μg/mL MICROCYSTIN-LR, ו 0.5 מילימטר diisopropyl fluorophosphate (difp).
   הערה: המחברים משתמשים באופן שגרתי במוצר EDTA-free, אך קוקטייל מעכב פרוטאז המכיל EDTA צריך גם לעבוד. מאגר הליזה ניתן לעשות מראש ללא β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז, microcystin-LR, ו DIFP, ומאוחסן 4 ° צ' עד השימוש. ודא כי β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז, microcystin-LR, ו DIFP הוא הוסיף רק מיד לפני השימוש.
   התראה: DIFP הוא רעיל ויש לטפל בזהירות בתוך מכסה המנוע בעקבות בריאות מקומית והערכת סיכונים בטיחות. ניתן להוסיף DIFP למאגר הליזה ולהשתמש בו באופן מיידי. לחילופין, מאגר הפירוק המלא המכיל את כל הרכיבים האחרים, כולל DIFP, ניתן לצוטט ולאחסן ב-80 ° c לשימוש הבאים במשך 4 שבועות לפחות.

2. בידוד נויטרופילים מכל דם

1. לאסוף 10 מ ל של דם לתוך צינור איסוף דם. מערבבים בעדינות על ידי היפוך צינורות 7-8x.
2. העברה 10 מ ל של דם לתוך צינורית חרוט 50 mL.
3. הוסף 100 μL של פתרון מלאי EDTA 1 לדם. מערבבים בעדינות.
4. הוסף 500 μL של קוקטייל הבידוד (50 μL/mL) מערכת הבידוד נויטרופילים (טבלת חומרים) לדגימת הדם כולה.
5. מערבולת את החרוזים מגנטי של ערכת הבידוד נויטרופילים עבור 30 s לפני השימוש כדי להשהות מחדש את החרוזים מגנטי עדין מאוד.
6. הוסף 500 μL של החרוזים המגנטיים לדגימת הדם וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינורית מספר פעמים.
7. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.
8. מלאו את הצינור ל 50 mL עם פתרון מניות EDTA 2. מערבבים על ידי בעדינות מאוד ללטף למעלה ולמטה 2 – 3x.
9. מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה כדי למנוע עצבנות הבאים של הצינור.
10. דגירה עבור 10 דקות ב RT.
11. פיפטה בזהירות ההשעיה התא מועשר המכיל את נויטרופילים לתוך צינור 50 mL החדש.
    הערה: אין לגעת בצד של הצינורית הנמצאת במגע עם המגנט ולהימנע מאיסוף והפרטורציה של תאי הדם האדומים בתחתית הצינורית. השאירו כ 10 מ ל של ההשעיה של תא דם אדום מאחורי בתחתית הצינור.
12. מערבולת החרוזים מגנטי עבור 30 s לפני השימוש ולהוסיף 0.5 mL של חרוזים מגנטיים הצינור המכיל נויטרופילים מועשר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך השפופרת.
13. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
14. מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה כדי למנוע עצבנות הבאים.
15. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
16. פיפטה בזהירות ההשעיה התא מועשר המכיל את נויטרופילים לתוך צינור 50 mL החדש.
    הערה: אל תגעו בצד של הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כ-5 מ ל של ההשעיה בתחתית השפופרת.
17. כדי להבטיח את ההסרה המלאה של חרוזים מגנטיים מן התערובת התא, למקם את הצינור המכיל את התאים מועשר לתוך המגנט.
18. דגירה עבור 10 דקות ב RT.
19. פיפטה בזהירות את ההשעיה התא מועשר כי כעת מכילה נויטרופילים טהור לתוך צינור 50 mL החדש.
    הערה: אל תגעו בצד של הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כ-5 מ ל של ההשעיה בתחתית השפופרת.
20. לערבב את התאים מבודדים עם 1 מ"מ מניות EDTA פתרון 2 לכרך הסופי של כ 41 mL. . פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב
21. לחלק את הפתרון באופן שווה לשתי שפופרות עם כ 20 מ ל בכל צינור.
22. צנטריפוגה את שני הצינורות ב 335 x g עבור 5 דקות.
23. במהלך צנטריפוגה זה לקחת מלאי מעכב MLi-2 (200 μM/1, 000x ריכוז) מתוך-80 ° c מקפיא ולעזוב ב RT לשימוש הבאים.
24. מיד לאחר הצעד הצנטריפוגה וללא עצבנות של צינורות, לשפוך את supernatant בלי להפריע את כדורי נויטרופילים. השהה מחדש כל גלולה ב-10 מ ל של מדיית תרבות התא (טבלת חומרים) ב-RT על-ידי ליטוף בעדינות של תאים למעלה ולמטה 4x.

3. LRRK2 קינאז טיפול מעכבי של נויטרופילים טהור

1. תווית צינור אחד "DMSO" ואת הצינור השני "MLi-2".
2. כדי "DMSO" התווית צינור, להוסיף 10 μL של DMSO ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2x עם צינור 10 מ"ל. כדי "MLi-2" שכותרתו הצינור, להוסיף 10 μL של 200 μM MLi-2 מניות פתרון (ריכוז סופי 200 nM) ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2x עם צינור 10 מ"ל.
3. מודקון את הדגימות עבור 30 דקות ב RT. לערבב בעדינות על ידי היפוך כל 10 דקות במהלך הדגירה.
4. במהלך תקופת הדגירה, להסיר 0.5 מניות M DIFP מ-80 ° c מקפיא ומקום בתוך המקפיא על הקרח. הסרת 1 מ"ג/mL מיקרו-LR פתרון מניות מ-80 ° c מקפיא ולעזוב ב RT כדי להפשיר. לקחת סדרת מחלקים (0.25 mL) של מאגר הליזה מתוך המקפיא, לאפשר לו להפשיר ב RT, ולאחר מכן למקם אותו על הקרח לשימוש הבאים.
5. הכן 1 mL של התרבות התא בינונית המכילה 1 μL של DMSO ולקרוא זה מאגר מחדש DMSO ההשעיה. הכן 1 mL של מדיה RPMI המכיל 1 μL של 200 μM MLi-2 ולקרוא זה מאגר מחדש MLi-2 ההשעיה.
6. אחרי 30 דקות דגירה התקופה, צנטריפוגה הן צינורות ב 335 x g עבור 5 דקות.
7. בזהירות להשליך את supernatant בכל צינור מבלי להפריע את הגלולה נויטרופילים.
8. עבור המדגם DMSO התווית בעדינות להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר הבולם החוזר DMSO ו עבור MLi-2 שכותרתו הצינור, להשעות את הגלולה ב 1 mL של מאגר מחדש MLi-2 ההשעיה.
9. להעביר את כדורי תא מושעה מחדש לצינורות צנטריפוגה מסומנים המסומנים "DMSO" ו "MLi-2" ו צנטריפוגה שתי הצינורות ב 335 x g עבור 3 דקות.
10. במהלך השלב הצנטריפוגה, הכן את מאגר הליזה. בתוך מכסה המנוע בזהירות להוסיף 0.25 μL של 0.5 M פתרון DIFP, כמו גם 0.25 μL של 1 מ"ג/מ"ל microcystin-LR למאגר הליזה 0.25 mL. לערבב ולהשאיר על הקרח עד השימוש.
    הערה: הוסף DIFP למאגר הליזה בתוך 15 דקות של פירוק התא, כי DIFP הוא לא יציב יחסית בתמיסה מימית.
11. מיד לאחר צנטריפוגה, בזהירות לחלוטין להסיר את כל supernatant עם פיפטה מבלי להפריע את הגלולה נויטרופילים ולמקם את הצינורות על הקרח.
12. מיד להוסיף 100 μL של מאגר הליזה המכיל DIFP ו-microcystine-LR לכל צינור. שימוש 100-200 μL הפיפטה, להשעות מחדש את כדורי התא על ידי ליטוף למעלה ולמטה על 5 – 10x.
13. ליאוס את התאים בקרח במשך 10 דקות.
14. צינורות צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' כדי להסיר פסולת תא.
15. העבר את "DMSO" ו "MLi-2" סופרנטנים המכילים את נויטרופילים לייטים לתוך צינורות צנטריפוגה חדשים. . התעלם מגלולה הפסולת
    הערה: נויטרופילים lysates מוכנים כעת לשימוש או יכול להיות מוקפא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב-80 ° c לניתוח עתידי.

תוצאות

הבדיקה שלנו מאפשרת לחקור את ההפעלה של LRRK2 קינאז PD-הקשורים המשטרה הקשורה בדם היקפי דם נויטרופילים עם LRRK2 תלוי Rab10 זרחון כמו בדיקה. נויטרופילים הם היקפיים ושופע היקפי דם לבנים האוכלוסייה המבטא רמות גבוהות של LRRK2 ו Rab10 חלבונים (איור 1). אוכלוסיית התאים היחידה היחידה בקרב תאי הדם ?...

Discussion

הוכחה משכנעת קלינית, גנטית, וביוכימית מצביע על תפקיד חשוב עבור LRRK2 ובמיוחד הפונקציה קינאז שלה במחלת פרקינסון⁷. מעכבי LRRK2 קינאז פותחו והם נכנסים ניסויים קליניים^2,4,12. ככזה יש צורך לנצל LRRK2 כסמן עבור מעורבות היעד, כמו גם המטופל ריב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	MJFF-total Rab10 mouse antibody