Isolement humain de neutrophile de sang périphérique pour interroger la voie de kinase LRRK2 associée de Parkinson en évaluant la phosphorylation de Rab10

Résumé

Les mutations dans le gène riche de leucine de répétition de kinase 2 (LRRK2) causent la maladie héréditaire de Parkinson. Nous avons développé une méthode facile et robuste pour évaluer la phosphorylation LRRK2-contrôlée de Rab10 dans les neutrophiles périphériques humains de sang. Ceci peut aider à identifier des individus avec l’activité accrue de voie de kinase de LRRK2.

Résumé

La kinase répétée riche en leucine 2 (LRRK2) est le gène le plus souvent muté dans la maladie héréditaire de Parkinson (PD) et toutes les mutations pathogènes de LRRK2 ont comme conséquence l’hyperactivation de sa fonction de kinase. Ici, nous décrivons un essai facile et robuste pour quantifier l’activité de voie de kinase de LRRK2 dans les neutrophiles périphériques humains de sang en mesurant la phosphorylation LRRK2-contrôlée de l’un de ses substrats physiologiques, Rab10 à la thréonine 73. L’analyse de l’immunoblotting décrite nécessite un anticorps entièrement sélectif et phosphospécifique qui reconnaît le phosphore épitopique Rab10 Thr73 par LRRK2, comme l’anticorps monocnel MJFF-pRab10 lapin. Il utilise des neutrophiles sanguins périphériques humains, parce que le sang périphérique est facilement accessible et les neutrophiles sont un constituant abondant et homogène. Fait important, les neutrophiles expriment des niveaux relativement élevés de LRRK2 et Rab10. Un inconvénient potentiel des neutrophiles est leur activité intrinsèque élevée de protéase de sérine, qui nécessite l’utilisation des inhibiteurs très puissants de protéase tels que la neurotoxine d’organophosphorus diisopropylfluorophosphate (DIFP) dans le cadre du tampon de lyse. Néanmoins, les neutrophiles sont une ressource précieuse pour la recherche sur l’activité de la voie kinase LRRK2 in vivo et devraient être considérés pour l’inclusion dans les collections de biorepository.

Introduction

Les tentatives visant à ralentir ou à stopper la maladie de Parkinson (MP) ont jusqu’à présent échoué. La découverte de mutations hyperactivantes dans la kinase répétitive riche en leucine 2 (LRRK2) qui causent et/ou augmentent le risque de a conduit au développement des inhibiteurs de la kinase LRRK2^1,2,3. Ceux-ci sont maintenant entrés dans les essais cliniques⁴. La fonction exacte de LRRK2 n’est pas claire, mais un progrès majeur a été l’identification d’un sous-ensemble de protéines Rab GTPase, y compris Rab10, comme les premiers substrats physiologiques de bonne foi de la kinase LRRK2^5,6,7. Les principaux défis à l’ère des thérapies modificateurs de la maladie sont les marqueurs biochimiques de l’état d’activation de kinase LRRK2 et l’engagement cible des inhibiteurs de la kinase LRRK2.

Jusqu’à présent, le principal marqueur pharmacocinétique pour les inhibiteurs LRRK2 in vivo a été un groupe de résidus de sérines constitutivement phosphorylated de LRRK2, en particulier la sérine 935, qui deviennent déphosphorylated en réponse à divers inhibiteurs LRRK2^8,9. Cependant, la phosphorylation de la sérine 935 ne est pas corrélée avec l’activité intrinsèque de kinase cellulaire LRRK2 parce qu’elle n’est pas directement phosphorée par LRRK2 et est encore phosphorylée dans LRRK2^10,inactive à la kinase. LRRK2 activité kinase se corrèle bien avec l’autophosphorylation de la sérine 1292, mais il n’est en termes pratiques pas une lecture appropriée pour l’activité endogène LRRK2 kinase par l’analyse immunoblot des extraits de cellules entières en raison de l’absence actuelle d’anticorps fiables et phosphospecific pour ce site^10,11.

Nous avons développé un essai robuste et facile pour quantifier l’activité de la voie de la kinase LRRK2 dans les cellules sanguines périphériques humaines qui mesure la phosphorylation LRRK2 de sa protéine cible physiologique Rab10 à la thréonine 73¹¹. Le sang périphérique est facilement accessible par venesection, qui est un faible risque et une procédure rapide qui provoque un inconfort minimal. Nous nous concentrons sur les neutrophiles sanguins périphériques humains parce qu’ils constituent une population abondante (37-80% de tous les globules blancs) et les cellules homogènes qui exprime des niveaux relativement élevés de LRRK2 et Rab10¹¹. En outre, les neutrophiles sanguins périphériques peuvent être isolés rapidement et efficacement en employant une approche négative immunomagnétique. Pour s’assurer que la phosphorylation Rab10 observée ultérieure est médiée par LRRK2, chaque lot de neutrophiles est incubé avec ou sans un inhibiteur puissant et sélectif de la kinase LRRK2 (nous utilisons et recommandons MLi-2)^2,12. Ceci est ensuite suivi par la lyse cellulaire dans un tampon contenant l’inhibiteur de la protéase diisopropyl fluorophosphate (DIFP), qui est nécessaire pour supprimer l’activité intrinsèque de protéase de sérine qui est connue pour être élevée dans les neutrophiles¹³. Pour l’analyse finale par immunoblotting quantitatif, nous recommandons d’utiliser l’anticorps monoclonal de lapin MJFF-pRab10 qui détecte spécifiquement le Rab10 Thr73-phosphoepitope et ne réagit pas contre-réagit avec d’autres protéines Rab phosphorylated¹⁴. La sélectivité et la spécificité de cet anticorps ont été validées dans des modèles de surexpression de différentes protéines Rab et une ligne cellulaire A549 Rab10 knock-out¹⁴. Ainsi, nous mesurons la différence dans la phosphorylation Rab10 dans les lysates neutrophiles qui ont été traités avec et sans un inhibiteur puissant et sélectif de la kinase LRRK2². Alternativement, les échantillons pourraient également être analysés par d’autres méthodes, telles que la spectrométrie quantitative de masse.

En conclusion, la phosphorylation Rab10 contrôlée par LRRK2 est un marqueur supérieur de l’activité de kinase LRRK2 à la phosphorylation LRRK2 à la serine 935 et les neutrophiles du sang périphérique humain sont une ressource précieuse pour la recherche de dans LRRK2. Notre protocole fournit un essai robuste et facile pour interroger l’activité de voie LRRK2 dans les neutrophiles périphériques de sang et permet la stratification biochimique des individus avec l’activité accrue de kinase de LRRK2¹⁵. Fait important, ces personnes peuvent bénéficier du futur traitement inhibiteur de la kinase LRRK2.

Protocole

Selon la réglementation locale du Royaume-Uni, toutes les manipulations et les canalisations de sang humain sont entreprises dans un cabinet de sécurité biologique de catégorie 2. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au comité local d’examen de l’éthique et tous les participants ont donné leur consentement éclairé.

1. Préparation

1. Préparer 0,1 mL de solution de stock EDTA 1 contenant 100 mM EDTA en saline tamponnée par phosphate (PBS).
2. Préparer 60 ml de solution EDTA Stock 2 contenant 1 mM EDTA dans PBS.
3. Préparer le tampon de lyse contenant 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 m NaF, 10 mM -glycerophosphate, 5 mM de sodium pyrophosphate, 0,27 M saccharose, 0,1% (v/v) ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
   REMARQUE : Les auteurs utilisent régulièrement un produit sans EDTA, mais un cocktail d’inhibiteur de la protéase contenant de l’EDTA devrait également fonctionner. Le tampon de lyse peut être fait à l’avance sans le mercaptoethanol, les inhibiteurs de la protéase, la microcystine-LR et le DIFP, et stocké à 4 oC jusqu’à l’utilisation. Assurez-vous que le mercaptoethanol, les inhibiteurs de la protéase, la microcystine-LR et le DIFP ne sont ajoutés que immédiatement avant utilisation.
   CAUTION : Le DIFP est toxique et doit être manipulé avec soin dans une hotte de fumée après l’évaluation locale des risques pour la santé et la sécurité. DiFP peut être ajouté au tampon de lyse et utilisé immédiatement. Alternativement, le tampon complet de lyse contenant tous les autres composants, y compris le DIFP, peut être aliquoted et stocké à -80 oC pour une utilisation ultérieure pendant au moins 4 semaines.

2. L’isolement de Neutrophil du sang entier

1. Recueillir 10 ml de sang dans un tube de collecte de sang. Mélanger délicatement en inversant les tubes 7 à 8x.
2. Transférer 10 ml de sang dans un tube conique de 50 ml.
3. Ajouter 100 L de la solution de stock EDTA 1 au sang. Mélanger délicatement.
4. Ajoutez 500 L du cocktail d’isolement (50 l/ml/mL) du kit d’isolement du neutrophile(Tableau des matériaux)à l’échantillon de sang entier.
5. Vortex les perles magnétiques du kit d’isolement neutrophile pour 30 s avant utilisation afin de réanimer les perles magnétiques très fines.
6. Ajouter 500 l de perles magnétiques à l’échantillon de sang et mélanger doucement en inversant le tube plusieurs fois.
7. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
8. Remplir le tube à 50 ml avec EDTA Stock Solution 2. Mélanger en faisant très doucement rouler de haut en bas de 2 à 3x.
9. Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter l’agitation subséquente du tube.
10. Incubate pendant 10 min à RT.
11. Soigneusement pipette la suspension cellulaire enrichie qui contient les neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 mL.
    REMARQUE : Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant et évitez la collecte et la perturbation des globules rouges au fond du tube. Laisser environ 10 ml de la suspension des globules rouges au fond du tube.
12. Vortex les perles magnétiques pour 30 s avant utilisation et ajouter 0,5 mL des perles magnétiques au tube contenant les neutrophiles enrichis. Mélanger délicatement en inversant le tube.
13. Incubate à RT pour 5 min.
14. Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter l’agitation ultérieure.
15. Incubate à RT pour 5 min.
16. Soigneusement pipette la suspension cellulaire enrichie qui contient les neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 mL.
    REMARQUE : Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant. Laisser environ 5 ml de suspension au fond du tube.
17. Pour assurer l’élimination complète des perles magnétiques du mélange cellulaire, placez le tube contenant les cellules enrichies dans l’aimant.
18. Incubate pendant 10 min à RT.
19. Soigneusement pipette la suspension cellulaire enrichie qui contient maintenant des neutrophiles purs dans un nouveau tube conique de 50 mL.
    REMARQUE : Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant. Laisser environ 5 ml de suspension au fond du tube.
20. Mélanger les cellules isolées avec 1 mM EDTA Stock Solution 2 à un volume final d’environ 41 ml. Pipette de haut en bas pour mélanger.
21. Divisez la solution également en deux tubes d’environ 20 ml dans chaque tube.
22. Centrifugeuse les deux tubes à 335 x g pendant 5 min.
23. Au cours de cette centrifugation, retirer le stock d’inhibiteurs MLi-2 (200 M/1 000x de concentration) du congélateur de -80 oC et laisser à RT pour une utilisation ultérieure.
24. Immédiatement après l’étape de centrifugation et sans agitation des tubes, versez le supernatant sans déranger les granulés de neutrophile. Réutilisez chaque granule cellulaire dans 10 ml de support de culture cellulaire(Tableau des matériaux) à RT en canalisation doucement des cellules de haut en bas 4x.

3. Traitement inhibiteur de la kinase LRRK2 des neutrophiles purs

1. Étiquetez un tube "DMSO" et l’autre tube "MLi-2".
2. Au tube étiqueté « DMSO », ajoutez 10 L de DMSO et mélangez doucement en faisant monter et descendre 2x avec une pipette de 10 ml. Au tube étiqueté « MLi-2 », ajoutez 10 L de la solution de stock MLi-2 (concentration finale 200 nM) et mélangez doucement en roulant de haut en bas de 2x avec une pipette de 10 ml.
3. Incuber les échantillons pendant 30 min à RT. Mélanger doucement par inversion tous les 10 minutes pendant l’incubation.
4. Pendant la période d’incubation, retirer le stock diFP de 0,5 M du congélateur à -80 oC et placer dans un capot de fumée sur la glace. Retirer la solution de bouillon de microcystine-LR de 1 mg/mL du congélateur à -80 oC et laisser décongeler à RT. Prenez un aliquot (0,25 ml) du tampon de lyse hors du congélateur, laissez-le décongeler à RT, puis placez-le sur la glace pour une utilisation ultérieure.
5. Préparer 1 ml de milieu de culture cellulaire contenant 1 L de DMSO et appeler ce tampon de réanimation DMSO. Préparer 1 mL de support RPMI contenant 1 L de 200 M M M M-2 et appeler ce tampon de réanimation MLi-2.
6. Après la période d’incubation de 30 min, centrifuger les deux tubes à 335 x g pendant 5 min.
7. Jetez soigneusement le supernatant dans chaque tube sans déranger la boulette de neutrophile.
8. Pour l’échantillon étiqueté DMSO résumant doucement la granule dans 1 ml de tampon de réanimation DMSO et pour le tube étiqueté MLi-2, réutilisez la granule dans 1 ml de tampon de réanimation MLi-2.
9. Transférer les granulés de cellules résuspendés sur les tubes de centrifugation correspondants étiquetés "DMSO" et "MLi-2" et la centrifugeuse les deux tubes à 335 x g pendant 3 min.
10. Pendant l’étape de centrifugation, préparer le tampon de lyse. Dans le capot de fumée ajouter délicatement 0,25 l 'L de 0.5 M solution DIFP ainsi que 0.25 'L de 1 mg/mL microcystin-LR au tampon de lyse de 0,25 mL. Mélanger et laisser sur la glace jusqu’à l’utilisation.
    REMARQUE : Ajouter le DIFP au tampon de lyse dans un rayon de 15 min de lyse cellulaire, parce que le DIFP est relativement instable dans une solution aqueuse.
11. Immédiatement après la centrifugation, retirez soigneusement et complètement tous les supernatants avec une pipette sans déranger la boulette de neutrophile et placez les tubes sur la glace.
12. Ajoutez immédiatement 100 L de tampon de lyse contenant du DIFP et de la microcystine-LR à chaque tube. À l’aide d’une pipette de 100 à 200 l,l, réutilisez les granulés de cellules en faisant monter et descendre environ 5 à 10x.
13. Lyse les cellules sur la glace pendant 10 min.
14. Tubes de centrifugeuse à 20 000 x g pendant 15 min à 4 oC pour enlever les débris cellulaires.
15. Transférer les supernatants "DMSO" et "MLi-2" contenant les neutrophiles dans de nouveaux tubes de centrifugation. Jetez la boulette de débris.
    REMARQUE : Les lysates neutrophiles sont maintenant prêts à l’emploi ou peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 oC pour une analyse future.

Résultats

Notre essai permet d’interroger l’activation de la kinase LRRK2 associée au chez les neutrophiles du sang périphérique humain avec la phosphorylation Rab10 dépendante de LRRK2 comme lecture. Les neutrophiles sont une population de globules blancs périphériques homogènes et abondantes qui exprime des niveaux élevés des protéines LRRK2 et Rab10(figure 1). La seule autre population cellulaire parmi les cellules mononucléaires périphériques restantes (PBMC) avec un nombre élev?...

Discussion

Des preuves cliniques, génétiques et biochimiques convaincantes indiquent un rôle important pour LRRK2 et en particulier sa fonction de kinase dans la maladie de Parkinson⁷. LRRK2 inhibiteurs de kinase ont été développés et entrent essais cliniques^2,4,12. En tant que tel, il est nécessaire d’exploiter LRRK2 comme biomarqueur pour l’engagement cible ainsi que la stratification des patients. Not...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	used at 1 μg/ml final concentration