Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Resumen

Aquí, describimos el método que empleamos para crear imágenes de filopodia dendrítica altamente móviles en una preparación en vivo del cerebro larvario Drosophila, y el protocolo que desarrollamos para cuantificar conjuntos de datos de imágenes 3D de lapso de tiempo para evaluaciones cuantitativas de la dendrita dinámica en el desarrollo de neuronas.

Resumen

Filopodia dendrítica altamente móvil están ampliamente presentes en las neuronas en las primeras etapas del desarrollo. Estas ramas dinámicas exploratorias muestrean el entorno circundante e inician contactos con posibles socios sinápticos. Aunque la conexión entre la dinámica de las ramas dendríticas y la sinaptogénesis está bien establecida, no se entiende bien cómo los procesos de desarrollo y dependientes de la actividad regulan la dinámica de las ramas dendríticas. Esto se debe en parte a las dificultades técnicas asociadas con las imágenes en vivo y los análisis cuantitativos de estas estructuras finas utilizando un sistema in vivo. Establecimos un método para estudiar la dinámica de la dendrita utilizando las neuronas laterales ventrales larvales de Drosophila (LNvs), que pueden ser etiquetados individualmente utilizando enfoques genéticos y son accesibles para imágenes en vivo. Aprovechando este sistema, desarrollamos protocolos para capturar la dinámica de ramas de todo el árbol dendrítico de un solo LNv etiquetado a través de imágenes en vivo de lapso de tiempo. A continuación, realizamos el postprocesamiento para mejorar la calidad de la imagen a través de la corrección de deriva y la desconvolución, seguido de analizar la dinámica de las ramas a nivel de una sola rama mediante la annotación de las posiciones espaciales de todos los terminales de rama. Por último, hemos desarrollado scripts R(Archivo complementario)y parámetros específicos para cuantificar la dinámica de las ramas utilizando la información de coordenadas generada por el seguimiento del terminal. Colectivamente, este protocolo nos permite lograr una descripción cuantitativa detallada de la dinámica de las ramas del árbol dendrítico neuronal con alta resolución temporal y espacial. Los métodos que desarrollamos son generalmente aplicables a las neuronas escasamente etiquetadas en condiciones in vitro e in vivo.

Introducción

Las dendritas son compartimentos neuronales especializados que reciben y procesan la entrada sensorial y sináptica. La compleja y estereotipada estructura de los árboles dendríticos ha estado bajo intensa investigación desde su descubrimiento. Se han establecido varios sistemas modelo, incluidas las neuronas tectales ópticas Xenopus, las células ganglionares de la retina de los polluelos y la arborización dendrítica (da) en el sistema Drosophila, para estudiar el desarrollo, la remodelación y la plasticidad de Dendritas neuronales^1,2,3,4. Las neuronas laterales ventrales drosofilia (LNvs) son un grupo de neuronas de proyección visual identificadas inicialmente por sus importantes funciones en la regulación circadiana de los comportamientos de la mosca⁵. Los estudios también revelaron el papel de los LNv larvarios como el objetivo postsináptico directo de los fotorreceptores larvarios (PR)^6,7. Es importante destacar que el cultivo de larvas en desarrollo en diferentes regímenes de luz afecta fuertemente al tamaño de los árboles dendríticos de LNvs, demostrando la idoneidad de los NL como un nuevo modelo para estudiar la plasticidad dendrítica⁷. El trabajo reciente de nuestro grupo indica además que tanto el tamaño de la dendrita LNv como el comportamiento dinámico de las ramas dendríticas muestran una plasticidad dependiente de la experiencia^8,9. Como parte de este trabajo, desarrollamos un nuevo protocolo de imagen y cuantificación en vivo para realizar análisis sobre la dinámica de dendrita de LNvs a partir de larvas^2nd o^3rd instar.

La naturaleza transparente del cerebro larvario Drosophila lo hace ideal para imágenes en vivo. Sin embargo, los árboles dendríticos de LNvs están situados en el neuropil óptico larvario (LON) densamente inervado en el centro del lóbulo cerebral larvario⁶. Para capturar imágenes de ramas finas de ndrita y filopodia en el tejido cerebral intacto, utilizamos microscopía de dos fotones, que aumenta la profundidad de penetración de la luz y reduce la fototoxicidad durante los experimentos de imágenes en vivo¹⁰. Usando esta configuración, realizamos con éxito experimentos de imágenes en vivo en LNvs durante más de 30 minutos sin observar el deterioro morfológico obvio de la neurona. Además, las manipulaciones genéticas utilizando la técnica Flip-out nos permitieron etiquetar los LNvs individuales con una membrana etiquetada GFP, que también es fundamental para monitorear los movimientos de las ramas individuales^11,12,13 .

Para capturar el comportamiento dinámico de todas las ramas en el eje dendrítico LNv con una resolución óptica óptima, realizamos imágenes 3D de lapso de tiempo en explantes cerebrales larvales recién diseccionados con una alta resolución espacial a 1 min por fotograma durante 10 a 30 min. Desarrollo de LNv las dendritas son muy dinámicas, con un gran porcentaje de las ramas que muestran cambios observables dentro de la ventana de 10 minutos. Esto conduce a uno de los principales desafíos técnicos en el estudio de la dinámica de dendrita, cuantificando el comportamiento de las ramas en función de los conjuntos de datos de imagen 4D. Los métodos previamente establecidos tienen varias limitaciones, incluyendo la falta de precisión y el requisito de tiempo excesivo. Por lo tanto, desarrollamos un método semiautomático que combina el postprocesamiento de imágenes, el marcado manual de los terminales de rama y el trazado automático de puntos 4D mediante un software de anotación de imagen. Calculamos los movimientos de los terminales de rama en diferentes puntos de tiempo en función de las coordenadas 3D de los puntos. A continuación, los datos se exportan y analizan para producir mediciones cuantitativas de la dinámica de las ramas. Este método evalúa con precisión la duración y el alcance de los eventos de extensión y retracción de las ramas existentes, así como la formación de nuevas ramas, lo que nos permite monitorear la dinámica de la dendrita en un gran número de neuronas.

Protocolo

PRECAUCION: Este protocolo implica el uso de láseres de clase IV y requerirá que se sigan las pautas adecuadas de capacitación y seguridad. Evite la exposición de los ojos o la piel a la luz láser directa o dispersa.
NOTA: El protocolo incluye seis pasos. El flujo de trabajo se muestra en la Figura 1A.

1. Etiquetado de neuronas individuales mediante la técnica flip-out

NOTA: El etiquetado único de LNvs se logra expresando mCD8::GFP en LNvs individual usando etiquetado estocástico mediado por flippasa. El genotipo de la línea de mosca es: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP^11,12,13. La frecuencia de obtención de un solo LNv etiquetado es de alrededor del 10%. Las existencias de mosca se mantienen en medio estándar en incubadoras de 25 oC controladas por circadia y humedad.

1. Recoger 100-200 huevos dentro de una ventana de 2 h después de la fertilización en un plato de jugo de uva con suplemento de levadura. Incubar los embriones a 25oC durante 24 h y recoger las larvas de primera instar recién nacidas para el siguiente paso.
2. Choque por calor de las primeras larvas instar recién eclosionadas a 37,5 oC durante 40 min dos veces, con un período de recuperación de 40 minutos en el medio.
3. Cultivo de las larvas a 25oC con controles circadianos y de humedad a la(s) etapa(s) de desarrollo deseada(s).

2. Disecting y montaje de explantes cerebrales larvales

1. Diseccionar cerebros larvales en la solución salina externa fisiológica (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glucosa, 10 mM Sacarosa, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mM Ca²⁺, PH 7.2) bajo un microscopio de disección (4.5x potencia) con dos pares de #5 fórceps de disección de punta estándar (11 cm). Usa un par de fórceps para mantener el cuerpo larvario en su lugar y el otro para diseccionar cuidadosamente el cerebro. Conservar los discos oculares, los lóbulos cerebrales y el cordón nervioso ventral. Retire los músculos conectados para minimizar los movimientos de la muestra durante la toma de imágenes.
2. Prepare un portaobjetos de vidrio (25 x 75 x 1,0 mm³⁾y utilice una jeringa para extraer una cámara cuadrada con grasa al vacío.
3. Añadir 20 ml de solución salina externa a la cámara cuadrada con barreras de grasa.
4. Transfiera cerebros larvales diseccionados a la cámara en el tobogán de vidrio usando fórceps. Ajuste la posición de los cerebros bajo el alcance de la disección para asegurar que el lado dorsal esté hacia arriba.
5. Cubra la cámara con un resbalón de la cubierta de vidrio (22 x 22 x 0,15 mm^3). El cerebro larvario ahora está montado en el portaobjetos dentro de una cámara llena de la solución salina externa(Figura 1B).
   NOTA: Presionar suavemente el cubreobjetos confina el cerebro y reduce la deriva de la muestra en la sesión de imágenes posterior.

3. Imágenes en vivo de lapso de tiempo

NOTA: Realizamos experimentos de imágenes de lapso de tiempo utilizando un microscopio confocal equipado con un láser multifotón. Los parámetros de adquisición deben ajustarse para otras configuraciones de imágenes.

1. Identificar explantes cerebrales que contienen neuronas etiquetadas individualmente utilizando un objetivo de inmersión en agua 40X (NA 1.3) y una fuente de luz epifluorescente. Para la recopilación de imágenes, utilice un láser de dos fotones sintonizado a 920 nm y un detector no desescaneado (NDD).
2. Recoger imágenes a 512 x 512 píxeles por fotograma y 1 min por pila Z durante 10 min. Ajuste el zoom óptico y digital para lograr una resolución x-y-z suficiente mientras asegura la cobertura de todo el eje dendrítico en 1 min(Figura 2, Vídeo suplementario 1). Los ajustes generan imágenes con una resolución típica de x-y-z de 0,11 x 0,11 x 0,25 ám³.
3. Recoger la serie de imágenes de lapso de tiempo dentro de 30 minutos de la disección cerebral. Los datos con una deriva excesiva o un deterioro morfológico evidente deben excluirse del post-procesamiento y la cuantificación.

4. Corrección de deriva y desconvolución

NOTA: Dependiendo de la calidad de la imagen, ambos pasos son opcionales, pero se recomienda encarecidamente.

1. Abra un archivo de imagen adquirido con un software de corrección de deriva. Edite los parámetros microscópicos para que coincidan con los utilizados para el experimento. Para el software (consulte Tabla de materiales), haga clic en Editar . Editar parámetros microscópicos. Establezca el tipo de microscopio como campo ancho para imágenes de dos fotones si no hay una opción de dos fotones y siga el flujo de trabajo definido por el software. Por ejemplo, abra la pestaña Desconvolución de la tecla desconvolución de la pestaña Object Stabilizery elija Estabilizar marcosde tiempo .
2. Abra la imagen corregida a la deriva en el software de desconvolución y siga su flujo de trabajo. Para el software (consulte Tabla de materiales), seleccione la imagen estabilizada y, a continuación, haga clic en Desconvolución ( Deconvolución) Deconvolución Express. Para obtener un mejor resultado, ajuste los parámetros mediante el Asistente para desconvolución.
3. Guarde la imagen desconvolved en un tipo de archivo compatible con el software de anotación de imagen posterior capaz de analizar datos 4D e informar de las coordenadas espaciales de los puntos definidos en la imagen (consulte Tabla de materiales).

5. Anotación de imagen

1. Abra la imagen desconvoluda en el software de anotación de imagen. Examine y marque las sugerencias de bifurcación en todos los puntos de tiempo en 3D. El software de anotación de imagen informa y almacena las coordenadas espaciales y temporales de las sugerencias de bifurcación marcadas. Exporte la información de coordenadas como un archivo .csv para cálculos posteriores.
   NOTA: Los dos pasos siguientes son específicos del software de anotación que utilizamos (consulte Tabla de materiales). El flujo de trabajo puede ser diferente para otro software.
2. Dentro del módulo Puntos, haga clic en"Omitir creación automática, edite manualmente" y marque la casilla de verificación inferior "Conexión automática al punto seleccionado" ( Figura3A). Repase los fotogramas de la serie temporal y seleccione una rama para la anotación. Mantenga pulsada la tecla Mayús y haga clic en la sugerencia del terminal de bifurcación para agregar un punto. Haga clic en todos los puntos de tiempo.
   NOTA: El software de anotación de imagen conecta los puntos entre fotogramas y genera una trayectoria automáticamente. La información espacial y temporal de las sugerencias de bifurcación ahora está asociada con puntos marcados. Repita estos pasos hasta que se anoten todas las sugerencias de bifurcación(Figura 3B).
3. En el módulo Puntos, haga clic en la pestaña Estadísticas, elija Detallado y seleccione Valores específicos . Posición. La información de coordenadas espaciales y temporales registrada estará en exhibición. Haga clic en la parte inferior Guardar para exportar esa información como un archivo .csv(figura 3C).

6. Cálculo de la dinámica de la rama dendrítica

NOTA: Utilizando la información de coordenadas, el desplazamiento de las puntas de bifurcación en 3D se puede calcular fácilmente. En nuestro estudio, todos los movimientos de ramas dendríticas se clasifican como Extensión o Retracción. Los pasos siguientes describen cómo procesar los archivos .csv mediante scripts R escritos a medida(Archivo complementario)y agregando la información direccional a través de la edición manual.

1. Abra el archivo .csv como una hoja de cálculo. Seleccione la columna Track ID, haga clic en la opción Sort Demenormás a Mayor y acepte Expandir la selección. Después de ordenar, Track ID identifica cada rama dendrítica única y los puntos de la misma rama comparten el mismo ID de pista. La columna Tiempo almacena la información de diferentes marcos de tiempo.
2. En la hoja de cálculo, agregue una columna Distancia. Calcule la distancia de cada dos puntos adyacentes temporalmente utilizando sus coordenadas y coloque los valores en la columna Distancia (Figura 4A).
3. Movimientos menores a nivel de voxel único. En función de la configuración de la imagen, los artefactos de 0,3 m suelen ser artefactos procedentes de una deriva no corregida o de una anotación de imagen imperfecta. Filtre estos movimientos restableciendo todos los valores de Distancia menores que 0,3 m a 0. Procese varios archivos .csv manualmente o utilice nuestro filtrado de columnas por lotes de script de R. R (Archivo suplementario).
4. Genere manualmente una nueva columna denominada Desplazamiento en la hoja de cálculo. Copie los valores de la columna Distancia a la columna Desplazamiento. Asigne manualmente los eventos de extensión y retracción para cada sugerencia de rama. Si es una extensión, deje el valor Displacement sin cambios, que es un valor positivo. Si se trata de una retractación, cambie el valor de Desplazamiento correspondiente a un valor negativo (por ejemplo, 0,35 a -0,35)(Figura 4B).
5. Generar una nueva columna denominada Evento. En esta columna, sume manualmente los valores de desplazamiento para eventos de extensión y retracción individuales(figura 4B).
6. Procese la hoja de cálculo modificada y cuantifique los eventos de extensión y retracción en función de sus valores de desplazamiento mediante la suma de columnas de lote de script de R. R (Archivo suplementario). Los parámetros de salida incluyen Número de eventos de extensión,Número de eventos de retracción, Longitud acumulada extendida, Longitud acumulada retraída, Longitud neta cambiaday Longitud total recorrida .

Resultados

Utilizando el protocolo de imágenes en vivo descrito anteriormente, capturamos pilas de imágenes de alta resolución para los análisis y cuantificación posteriores. El vídeo suplementario 1 muestra la serie de imágenes proyectadas de intensidad máxima (MIP) recopiladas de un representante etiquetado individualmente LNv. La Figura 2B muestra el montaje correspondiente de ocho fotogramas de la serie de imágenes. En ambo...

Discusión

Aquí, describimos un protocolo que desarrollamos para registrar y cuantificar el comportamiento dinámico de las ramas dendríticas en neuronas etiquetadas individualmente en cerebros larvarios Drosophila. En particular, nuestro protocolo de imágenes en vivo contiene parámetros específicos que nos permiten capturar todo el árbol dendrítico de un LNv larvario y proporcionar una visión global del estado dinámico de sus ramas dendrita. Sin embargo, debido a que nuestros métodos de cuantificación dependen ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
High vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES