Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Methode, die wir angewendet haben, um hochmotile dendritische Filopodia in einer Live-Vorbereitung des Drosophila-Larvenhirns abzubilden, und das Protokoll, das wir entwickelt haben, um Zeitraffer-3D-Bildgebungsdatensätze für quantitative Bewertungen von Dendriten zu quantifizieren. Dynamik bei der Entwicklung von Neuronen.

Zusammenfassung

Hochmotile dendritische Filopodien sind in Neuronen in frühen Entwicklungsstadien weit verbreitet. Diese explorativen dynamischen Zweige proben die Umgebung und initiieren Kontakte mit potenziellen synaptischen Partnern. Obwohl der Zusammenhang zwischen dendritischer Verzweigungsdynamik und Synaptogenese gut etabliert ist, ist nicht gut verstanden, wie entwicklungs- und aktivitätsabhängige Prozesse die dendritische Zweigdynamik regulieren. Dies ist zum Teil auf die technischen Schwierigkeiten zurückzuführen, die mit der Live-Bildgebung und quantitativen Analysen dieser feinen Strukturen mit Hilfe eines In-vivo-Systems verbunden sind. Wir haben eine Methode zur Untersuchung der Dendritendynamik mit Drosophila larval ventrallateralen Neuronen (LNvs) etabliert, die mit genetischen Ansätzen individuell gekennzeichnet werden können und für Live-Bildgebung zugänglich sind. Unter Ausnutzung dieses Systems entwickelten wir Protokolle, um die Zweigdynamik der gesamten dendritischen Laube einer einzigen markierten LNv durch Zeitraffer-Live-Bildgebung zu erfassen. Anschließend führten wir eine Nachbearbeitung durch, um die Bildqualität durch Driftkorrektur und Dekonvolution zu verbessern, gefolgt von der Analyse der Verzweigungsdynamik auf Ein-Zweig-Ebene durch Kommentieren der räumlichen Positionen aller Zweigklemmen. Schließlich haben wir R-Skripte (Supplementary File) und spezifische Parameter entwickelt, um die Verzweigungsdynamik mithilfe der von der Terminalablaufverfolgung generierten Koordinateninformationen zu quantifizieren. Zusammen genommen ermöglicht uns dieses Protokoll eine detaillierte quantitative Beschreibung der Zweigdynamik der neuronalen dendritischen Laube mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Die von uns entwickelten Methoden sind allgemein auf dünn markierte Neuronen sowohl in vitro als auch in vivo anwendbar.

Einleitung

Dendriten sind spezialisierte neuronale Kompartimente, die sensorische und synaptische Eingaben empfangen und verarbeiten. Die komplexe und stereotype Struktur der dendritischen Lauben wird seit ihrer Entdeckung intensiv untersucht. Eine Reihe von Modellsystemen, einschließlich Xenopus-Optik-Tektal-Neuronen, Kichern-Retinal-Ganglienzellen und dendritischer Arborisierung (da) Neuronen im Drosophila-System, wurden eingerichtet, um die Entwicklung, Umgestaltung und Plastizität von neuronale Dendriten^1,2,3,4. Drosophila ventrale Lateralneuronen (LNvs) sind eine Gruppe von visuellen Projektionneuronen, die ursprünglich für ihre wichtigen Funktionen bei der zirkadianen Regulation von Fliegenverhalten identifiziert wurden⁵. Studien zeigten auch die Rolle der Larven LNvs als das direkte postsynaptische Ziel der Larven photorezeptoren (PRs)^6,7. Wichtig ist, dass die Kultivierung von Larven in verschiedenen Lichtregimen stark die Größe der dendritischen Lauben von LNvs beeinflusst und die Eignung von LNvs als neues Modell zur Untersuchung der dendritischen Plastizität demonstriert⁷. Jüngste Arbeiten unserer Gruppe deuten ferner darauf hin, dass sowohl die Größe des LNv-Dendriten als auch das dynamische Verhalten der dendritischen Zweige erfahrungsabhängige Plastizität^8,9aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit entwickelten wir ein neues Live-Bildgebungs- und Quantifizierungsprotokoll, um die Dendritendynamik von LNvs aus^2. oder^3. Instar-Larven zu analysieren.

Die transparente Natur des Drosophila Larvenhirns macht es ideal für Live-Bildgebung. Die dendritischen Lauben von LNvs befinden sich jedoch im dicht besiedelten Larvenoptik-Neuropil (LON) in der Mitte des Larvenhirnlappens⁶. Um Bilder von feinen Dendritenzweigen und Filopodia im intakten Hirngewebe zu erfassen, verwenden wir eine Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die Tiefe der Lichtdurchdringung erhöht und die Phototoxizität bei Live-Bildgebungsexperimenten¹⁰reduziert. Mit diesem Setup führten wir erfolgreich Live-Bildgebungsexperimente auf LNvs über 30 min durch, ohne eine offensichtliche morphologische Verschlechterung des Neurons zu beobachten. Darüber hinaus ermöglichten uns genetische Manipulationen mit der Flip-out-Technik die Kennzeichnung der einzelnen LNvs mit einer Membran mit gfP-Kennzeichnung, die auch für die Überwachung der Bewegungen einzelner Zweige entscheidend ist^11,12,13 .

Um das dynamische Verhalten aller Zweige auf der Dendritischen Laube LNv mit optimaler optischer Auflösung zu erfassen, führten wir Zeitraffer-3D-Bildgebung an frisch sezierten Larvenhirn-Explants mit einer hohen räumlichen Auflösung bei 1 min pro Frame für 10 bis 30 min durch. Dendriten sind hochdynamisch, wobei ein großer Prozentsatz der Zweige beobachtbare Änderungen innerhalb des 10-min-Fensters anzeigt. Dies führt zu einer der wichtigsten technischen Herausforderungen bei der Untersuchung der Dendritendynamik, der Quantifizierung des Zweigverhaltens auf Basis der 4D-Bilddatensätze. Zuvor etablierte Methoden haben verschiedene Einschränkungen, einschließlich mangelnder Genauigkeit und übermäßiger Zeitanforderung. Daher haben wir eine halbautomatische Methode entwickelt, die die Bildnachbearbeitung, die manuelle Markierung der Verzweigungsklemmen und die automatische 4D-Spotverfolgung mit einer Bildanmerkungssoftware kombiniert. Wir berechnen die Bewegungen von Zweigklemmen zu verschiedenen Zeitpunkten basierend auf den 3D-Koordinaten der Spots. Die Daten werden dann exportiert und analysiert, um quantitative Messungen der Branchendynamik zu erstellen. Diese Methode bewertet genau die Dauer und das Ausmaß der Verlängerungs- und Rückzugsereignisse bestehender Zweige sowie die Bildung neuer Zweige, so dass wir die Dendritendynamik in einer großen Anzahl von Neuronen überwachen können.

Protokoll

ACHTUNG: Dieses Protokoll beinhaltet den Einsatz von Lasern der Klasse IV und erfordert die Begenutzung der richtigen Schulungs- und Sicherheitsrichtlinien. Vermeiden Sie augen- oder hauteinwirkungsmitteliges Laserlicht.
HINWEIS: Das Protokoll umfasst sechs Schritte. Der Workflow ist in Abbildung 1Adargestellt.

1. Beschriften einzelner Neuronen mit der Ausklapptechnik

HINWEIS: Die einzelne Beschriftung von LNvs wird durch die Exzierung von mCD8::GFP in einzelnen LNvs mit flippase-vermittelter stochastischer Beschriftung erreicht. Der Genotyp der Fluglinie ist: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP^11,12,13. Die Häufigkeit der Beschaffung eines einzelnen mit LNv beschrifteten LNv beträgt etwa 10%. Die Flugbestände werden in zirkadianen und feuchtigkeitskontrollierten 25 °C-Inkubatoren im Standardmedium gehalten.

1. Sammeln Sie 100-200 Eier innerhalb eines 2 h Fenster nach der Befruchtung auf einem Traubensaftteller mit Hefe-Ergänzung. Die Embryonen bei 25 °C für 24 h bebrüten und neu geschlüpfte erste Instarlarven für den nächsten Schritt sammeln.
2. Hitze schockt die frisch geschlüpfte erste Instar-Larven bei 37,5 °C für 40 min zweimal, mit einer 40 min Erholungsphase dazwischen.
3. Die Larven bei 25 °C mit zirkadianen und Feuchtigkeitskontrollen auf die gewünschte Entwicklungsstufe(n) ansleben.

2. Sezieren und Montieren larval Brain Explants

1. Sezieren Larvengehirne in der physiologischen externen Salzlösung (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glucose, 10 mM Saccharose, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mM Ca²⁺, PH 7.2) unter einem Seziermikroskop (4.5x Vergrößerung Kraft) mit zwei Paaren #5 Standard-Spitzensezieren (11 cm). Verwenden Sie ein Paar Zangen, um den Larvenkörper an Ort und Stelle zu halten und das andere, um das Gehirn sorgfältig zu sezieren. Bewahren Sie die Augenscheiben, Gehirnlappen und die ventrale Nervenschnur. Entfernen Sie die angeschlossenen Muskeln, um Probenbewegungen während der Bildgebung zu minimieren.
2. Bereiten Sie einen Glasschlitten (25 x 75 x 1,0 mm³) vor und zeichnen Sie mit einer Spritze eine quadratische Kammer mit Vakuumfett.
3. Fügen Sie der quadratischen Kammer mit Fettbarrieren 20 L externe Lösung saline hinzu.
4. Übertragen Sie sezierte Larvengehirne mit Zangen in die Kammer auf der Glasrutsche. Passen Sie die Position der Gehirne unter dem Sezierbereich an, um sicherzustellen, dass die dorsale Seite nach oben zeigt.
5. Bedecken Sie die Kammer mit einem Glasdeckel (22 x 22 x 0,15 mm³). Das Larvenhirn ist nun auf der Rutsche in einer Kammer montiert, die mit der externen Kochkammerlösung gefüllt ist (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Das sanfte Drücken des Coverslips schränkt das Gehirn ein und reduziert das Abdriften der Proben in der anschließenden Bildgebungssitzung.

3. Zeitraffer Live Imaging

HINWEIS: Wir führen Zeitraffer-Bildgebungsexperimente mit einem konfokalen Mikroskop durch, das mit einem Multiphotonenlaser ausgestattet ist. Die Erfassungsparameter müssen für andere Imaging-Setups angepasst werden.

1. Identifizieren Sie Hirnexplantationen, die einzeln markierte Neuronen enthalten, mit einem 40-fachen Wasser-Immersionsobjektiv (NA 1.3) und einer epifluoreszierenden Lichtquelle. Verwenden Sie für die Bildsammlung einen Zwei-Photonen-Laser mit 920 nm und einen nicht gescannten (NDD) Detektor.
2. Sammeln Sie Bilder mit 512 x 512 Pixeln pro Frame und 1 min pro Z-Stack für 10 min. Passen Sie den optischen und digitalen Zoom an, um eine ausreichende X-y-z-Auflösung zu erzielen und gleichzeitig die Abdeckung der gesamten dendritischen Laube innerhalb von 1 min sicherzustellen (Abbildung 2, Ergänzendes Video 1). Die Einstellungen erzeugen Bilder mit einer typischen x-y-z Auflösung von 0,11 x 0,11 x 0,25 x³.
3. Sammeln Sie die Zeitraffer-Bildserie innerhalb von 30 min der Hirnsektion. Daten mit übermäßiger Drift oder offensichtlicher morphologischer Verschlechterung sollten von der Nachbearbeitung und Quantifizierung ausgeschlossen werden.

4. Drift-Korrektur und Dekonvolution

HINWEIS: Je nach Bildqualität sind beide Schritte optional, werden jedoch dringend empfohlen.

1. Öffnen Sie eine erworbene Bilddatei mit einer Driftkorrektur-Software. Bearbeiten Sie mikroskopische Parameter, um sie mit den für das Experiment verwendeten Parametern zu entsprechen. Für die Software (siehe Tabelle der Materialien), klicken Sie auf Bearbeiten | Bearbeiten Sie mikroskopische Parameter. Stellen Sie den Mikroskoptyp als Weitfeld für Zwei-Photonen-Bilder ein, wenn es keine Zwei-Photon-Option gibt, und folgen Sie dem von der Software definierten Workflow. Öffnen Sie z. B. die Registerkarte Deconvolution | Objektstabilisator, und wählen Sie Zeitrahmen stabilisieren.
2. Öffnen Sie das driftkorrigierte Bild in der Dekonvolution-Software und folgen Sie demen Workflow. Wählen Sie für die Software (siehe Tabelle der Materialien) das stabilisierte Bild aus und klicken Sie dann auf Deconvolution | Deconvolution Express. Um ein besseres Ergebnis zu erzielen, optimieren Sie die Parameter mit dem Deconvolution Wizard.
3. Speichern Sie das dekonvolvedbildte Bild in einem Dateityp, der von der nachfolgenden Bildanmerkungssoftware unterstützt wird, die 4D-Daten analysieren und die räumlichen Koordinaten definierter Flecken im Bild melden kann (siehe Tabelle der Materialien).

5. Bildanmerkung

1. Öffnen Sie das dekonvolved Bild in der Bildanmerkungssoftware. Untersuchen und markieren Sie Zweigspitzen zu allen Zeitpunkten in 3D. Die Bildanmerkungssoftware meldet und speichert die räumlichen und zeitlichen Koordinaten der markierten Verzweigungsspitzen. Exportieren Sie die Koordinateninformationen als CSV-Datei für nachfolgende Berechnungen.
   HINWEIS: Die folgenden beiden Schritte sind spezifisch für die von uns verwendete Anmerkungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). Der Workflow kann für andere Software unterschiedlich sein.
2. Klicken Sie im Spots-Modul auf "Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten" und aktivieren Sie das untere Kontrollkästchen"Automatische Verbindung mit dem ausgewählten Spot" ( Abbildung3A). Gehen Sie über die Frames in der Zeitreihe, und wählen Sie einen Zweig für Die Anmerkungen aus. Halten Sie die Umschalttaste gedrückt und klicken Sie auf die Zweigklemmenspitze, um einen Punkt hinzuzufügen. Klicken Sie sich durch alle Zeitpunkte.
   HINWEIS: Die Bildanmerkungssoftware verbindet die Spots zwischen Frames und generiert automatisch eine Flugbahn. Die räumlichen und zeitlichen Informationen der Zweigspitzen sind nun mit markierten Punkten verknüpft. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Verzweigungstipps mit Anmerkungen benotet sind (Abbildung 3B).
3. Klicken Sie im Spots-Modul auf die Registerkarte Statistik, wählen Sie Detailliert aus und wählen Sie Spezifische Werte | Position. Die aufgezeichneten räumlichen und zeitlichen Koordinateninformationen werden angezeigt. Klicken Sie auf den unteren Teil speichern, um diese Informationen als CSV-Datei zu exportieren (Abbildung 3C).

6. Berechnung der dendritischen Zweigdynamik

HINWEIS: Anhand der Koordinateninformationen kann die Verschiebung der Verzweigungsspitzen in 3D einfach berechnet werden. In unserer Studie werden alle dendritischen Zweigbewegungen als Erweiterung oder Rückzugkategorisiert. In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie die CSV-Dateien mithilfe von benutzerdefinierten R-Skripten (Ergänzende Datei) verarbeitet und die Richtungsinformationen durch manuelle Bearbeitung hinzugefügt werden.

1. Öffnen Sie die .csv-Datei als Kalkulationstabelle. Wählen Sie die Spalte Spur-ID aus, klicken Sie auf die Option Kleinstes Nach Größtesortieren, und akzeptieren Sie die Auswahl erweitern. Nach dem Sortieren identifiziert Track ID jeden eindeutigen dendritischen Zweig, und Spots aus derselben Verzweigung verwenden dieselbe Spur-ID. In der Spalte Zeit werden die Informationen verschiedener Zeitrahmen gespeichert.
2. Fügen Sie in der Kalkulationstabelle eine Spalte Entfernung hinzu. Berechnen Sie den Abstand von zwei zeitlich benachbarten Punkten anhand ihrer Koordinaten und setzen Sie die Werte in die Spalte Entfernung (Abbildung 4A).
3. Kleinere Bewegungen auf der einzelnen Voxel-Ebene. Basierend auf den Bildeinstellungen sind 0,3 m in der Regel Artefakte aus unkorrigiertem Driften oder unvollkommener Bildanmerkung. Filtern Sie diese Bewegungen heraus, indem Sie alle Abstandswerte kleiner als 0,3 m bis 0 zurücksetzen. Verarbeiten Sie mehrere .csv-Dateien manuell oder verwenden Sie unsere R-Skriptbatchspaltenfilterung. R (Zusatzdatei).
4. Generieren Sie manuell eine neue Spalte mit dem Namen Verschiebung in der Kalkulationstabelle. Kopieren Sie die Werte aus der Spalte Entfernung in die Spalte Verschiebung. Weisen Sie die Erweiterungs- und Rückzugsereignisse manuell für jede Zweigspitze zu. Wenn es sich um eine Erweiterung handelt, lassen Sie den Wert "Verschiebung" unverändert, was ein positiver Wert ist. Wenn es sich um einen Rückzug handelt, ändern Sie den entsprechenden Verschiebungswert in einen negativen Wert (z. B. 0,35 bis -0,35) (Abbildung 4B).
5. Generieren Sie eine neue Spalte mit dem Namen Event. Summieren Sie in dieser Spalte manuell die Verschiebungswerte für einzelne Erweiterungs- und Rückzugsereignisse (Abbildung 4B).
6. Verarbeiten Sie die geänderte Kalkulationstabelle, und quantifizieren Sie die Erweiterungs- und Rückzugsereignisse basierend auf ihren Verschiebungswerten mithilfe der Summe der R-Skriptbatchspalten. R (Zusatzdatei). Die Ausgabeparameter umfassen Anzahl der Erweiterungsereignisse, Anzahl der Zurückgezogenenereignisse, Kumulative Länge erweitert, Kumulative Länge zurückgezogen, Netzlänge geändert, und Gesamtlänge zurückgelegt .

Ergebnisse

Mit dem oben beschriebenen Live-Imaging-Protokoll erfassen wir hochauflösende Bildstapel für die nachfolgenden Analysen und Quantifizierungen. Ergänzendes Video 1 zeigt die maximale projizierte (MIP) Bildserie, die von einem repräsentativen, individuell beschrifteten LNv gesammelt wurde. Abbildung 2B zeigt die entsprechende Montage von acht Bildern der Bildreihe. In beiden Bereichen markieren Pfeilspitzen Rückzugsereigni...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das wir entwickelt haben, um das dynamische Verhalten dendritischer Zweige in individuell gekennzeichneten Neuronen in Drosophila Larvengehirnen aufzuzeichnen und zu quantifizieren. Insbesondere enthält unser Live-Imaging-Protokoll spezifische Parameter, die es uns ermöglichen, die gesamte dendritische Arbor eines Larven-LNv zu erfassen und einen globalen Überblick über den dynamischen Zustand seiner Dendritenzweige zu geben. Da unsere Quantifizierungsmethoden jedoch stark...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
High vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES