초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

요약

여기에서는 Drosophila 애벌레 뇌의 실시간 준비에서 매우 운동성 수지상 필로포디아를 이미지화하기 위해 사용한 방법과 수상돌기의 정량적 평가를 위해 시간 경과 3D 이미징 데이터 세트를 정량화하기 위해 개발한 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 개발에 역학.

초록

고도의 운동성 수지상 필로포디아는 초기 발달 단계에서 뉴런에 널리 존재합니다. 이러한 탐색 동적 분기 주변 환경을 샘플링 하 고 잠재적인 시 냅 스 파트너와 접촉을 시작. 수지상 분지 역학과 시냅토 발생 사이의 연결이 잘 확립되어 있지만, 개발 및 활동 의존적 인 프로세스가 수지상 분기 역학을 조절하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 이것은 부분적으로 생체 내 시스템을 사용하여 이러한 미세 구조의 라이브 이미징 및 정량적 분석과 관련된 기술적 어려움에 기인한다. 우리는 개별적으로 유전 접근을 사용하여 표지될 수 있고 살아있는 화상 진찰을 위해 접근할 수 있는 Drosophila 애벌레 복부 측삭 신경세포 (LNvs)를 사용하여 수상돌기 역학을 공부하는 방법을 설치했습니다. 이 시스템을 활용하여 타임랩스 라이브 이미징을 통해 단일 라벨이 부착된 LNv의 전체 수지상 아버의 분기 역학을 포착하는 프로토콜을 개발했습니다. 그런 다음 드리프트 보정 및 디톤볼루션을 통해 이미지 품질을 개선하기 위해 후처리를 수행한 다음 모든 분기 단말의 공간 위치에 별칭을 하여 단일 분기 수준에서 분기 역학을 분석했습니다. 마지막으로 터미널 추적에 의해 생성된 좌표 정보를 사용하여 분기 역학을 정량화하기 위해 R스크립트(보충 파일)및 특정 매개 변수를 개발했습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 우리가 높은 시간및 공간 적 분해능을 가진 신경 수지상 아버의 가지 역학의 상세한 정량적 설명을 달성할 수 있게 한다. 우리가 개발 한 방법은 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 조건 모두에서 드물게 표지 된 뉴런에 적용 할 수 있습니다.

서문

수상돌기는 감각및 시냅스 입력을 수신하고 처리하는 특수 신경 구획입니다. 수지상 아버의 복잡하고 고정 된 구조는 발견 이후 강도 높은 조사를 받고 있습니다. 제노푸스 광학 지각 신경세포, 병아리 망막 신경절 세포, 초파리 시스템의 수지상 수공(da) 뉴런을 포함한 다수의 모델 시스템이 개발, 리모델링 및 가소성을 연구하기 위해 설립되었습니다. 신경 모수석^1,2,3,4. Drosophila 복부 측측 뉴런 (LNvs)은 비행 행동의 circadian 규칙에 있는 그들의 중요한 기능을 위해 처음에 확인된 시각적 투영 뉴런의 단^5. 연구는 또한 애벌레 광수용체 (P)^6,7의직접적인 후발성 표적으로 애벌레 LNvs의 역할을 밝혔다. 중요한 것은, 다른 빛 정권에서 개발 애벌레를 배양하는 것은 강하게 수지상 가소성 연구를위한 새로운 모델로 LNvs의 적합성을 입증, LNvs의 크기에 영향을 미친다^7. 우리 그룹의 최근 연구는 더 LNv 덴드 라이트의 크기와 수지상 가지의 동적 동작 모두 경험 의존가소성^표시8,9를나타냅니다. 이 작업의 일환으로, 우리는 2^nd 또는 3^rd instar 애벌레에서 LNvs의 수상 돌기 역학에 대한 분석을 수행하기 위해 새로운 라이브 이미징 및 정량화 프로토콜을 개발했습니다.

Drosophila 애벌레 두뇌의 투명한 본질은 살아있는 화상 진찰을 위해 이상적입니다. 그러나, LNvs의 수지상 아버는 애벌레 뇌 엽^6의중심에 조밀하게 내심이 있는 애벌레 시신경제(LON)에 위치한다. 손상되지 않은 뇌 조직에서 미세 한 모수석 가지와 필로포디아의 이미지를 캡처하기 위해 2 광자 현미경을 사용하여 빛 침투깊이를 높이고 라이브 이미징 실험¹⁰동안 광독성을 감소시킵니다. 이 설정을 사용하여, 우리는 성공적으로 뉴런의 명백한 형태 학적 악화를 관찰하지 않고 30 분 이상 LNvs에 라이브 이미징 실험을 수행했다. 또한, 플립 아웃 기술을 사용하여 유전자 조작은 우리가 또한 개별 지점의 움직임을 모니터링하기위한 중요한 멤브레인 태그 GFP로 개별 LNvs를 라벨 수^{있도록 11,12, 13} .

최적의 광학 해상도로 LNv 수지상 아버의 모든 가지의 동적 거동을 포착하기 위해 프레임당 1분에서 10~30분 동안 높은 공간 해상도로 새로 해부된 애벌레 뇌 이식에 대한 타임랩스 3D 이미징을 수행했습니다. 수상돌기는 매우 동적이며, 분기의 큰 비율은 10 분 창 내에서 관찰 가능한 변화를 표시합니다. 이것은 4D 이미지 데이터 세트를 기반으로 분기 동작을 정량화, 수상 돌기 역학을 공부의 주요 기술적 과제 중 하나에 이르게. 이전에 설정된 메서드에는 정확도 부족 및 과도한 시간 요구 사항을 비롯한 다양한 제한 사항이 있습니다. 따라서 이미지 후처리, 지점 단자의 수동 마킹 및 이미지 주석 소프트웨어를 사용하여 자동 4D 스팟 추적을 결합한 반자동 방법을 개발했습니다. 점점의 3D 좌표를 기준으로 서로 다른 시점에서 분기 터미널의 움직임을 계산합니다. 그런 다음 데이터를 내보내고 분석하여 분기 역학의 정량적 측정을 생성합니다. 이 방법은 기존 가지의 확장 및 철회 이벤트의 지속 기간 및 범위뿐만 아니라 새로운 가지의 형성을 정확하게 평가하여 많은 수의 뉴런에서 수상 돌기 역학을 모니터링 할 수 있게합니다.

프로토콜

주의 사항: 이 프로토콜은 클래스 IV 레이저의 사용을 포함하고 적절한 교육 및 안전 지침을 따라야합니다. 직접 또는 산란된 레이저 광에 눈이나 피부에 노출되지 않도록 하십시오.
참고: 프로토콜에는 6단계가 포함되어 있습니다. 워크플로는 그림 1A에표시됩니다.

1. 플립 아웃 기술을 사용하여 개별 뉴런에 라벨링

참고: LNvs의 단일 라벨링은 플리타제-매개 형루 라벨링을 사용하여 단일 LNvs에서 mCD8::GFP를 표현함으로써 달성됩니다. 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같은 것입니다. PDF-갈4; UAS-FRT-CD2-스톱-FRT-mCD8::GFP^11,12,13. 단일 라벨이 부착된 LNv를 얻는 빈도는 약 10%입니다. 플라이 스톡은 일주기 및 습도 제어 25°C 인큐베이터에서 표준 매체로 유지됩니다.

1. 효모 보충과 포도 주스 접시에 2 시간 창 후 수정 내에서 100-200 계란을 수집합니다. 배아를 24시간 동안 25°C에서 배양하고 다음 단계를 위해 새로 부화한 첫 번째 무스타 애벌레를 수집합니다.
2. 열 충격은 37.5°C에서 37.5°C에서 새로 부화된 유충을 40분 동안 두 번, 그 사이에 40분 의 회복 기간을 갖는다.
3. 유충을 25°C에서 배양하고, 원하는 발달 단계에 대한 습도 조절을 한다.

2. 애벌레 뇌 이식을 해부하고 장착

1. 생리적 외부 식염수 용액에서 애벌레 뇌를 해부 (120 mM NaCl, 4 mM MgCl_2,3 mM KCl, 10 mM NaHCO_3,10 mM GM 포도당, 10 mM 수크로오스, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mM^{Ca2 +}, PH 7.2) 디스현미경 (4 mm. 두 쌍의 #5 표준 팁 해부 집게(11cm)를 두 쌍으로 처리합니다. 애벌레의 몸을 제자리에 고정하기 위해 한 쌍의 집게를 사용하고 다른 하나는 조심스럽게 뇌를 해부하십시오. 눈 디스크, 뇌 엽 및 복부 신경 코드를 보존합니다. 이미징 중에 샘플 움직임을 최소화하기 위해 부착된 근육을 제거합니다.
2. 유리 슬라이드 (25 x 75 x 1.0 mm^3)를준비하고 주사기를 사용하여 진공 그리스로 사각형 챔버를 그립니다.
3. 그리스 장벽이 있는 사각형 챔버에 외부 식염수 20μL을 추가합니다.
4. 포인을 사용하여 유리 슬라이드의 챔버로 해부 된 애벌레 뇌를 전송합니다. 등쪽이 위를 향하도록 해부 범위 아래의 뇌의 위치를 조정합니다.
5. 유리 커버 슬립으로 챔버를 덮습니다 (22 x 22 x 0.15mm^3). 애벌레 뇌는 이제 외부 식염수로 채워진 챔버 내의 슬라이드에 장착됩니다(그림 1B).
   참고: 커버슬립을 부드럽게 누르면 뇌가 제한되고 후속 이미징 세션에서 샘플 표류가 줄어듭니다.

3. 타임랩스 라이브 이미징

참고: 우리는 다광자 레이저가 장착 된 공초점 현미경을 사용하여 시간 경과 이미징 실험을 수행합니다. 다른 이미징 설정에 대해 수집 매개변수를 조정해야 합니다.

1. 40X 수지 목표(NA 1.3)와 에피인젝션 광원을 사용하여 개별적으로 표지된 뉴런을 포함하는 뇌 이식체를 식별합니다. 이미지 수집의 경우 920nm로 튜닝된 2광자 레이저와 비데스칸(NDD) 검출기를 사용합니다.
2. 프레임당 512 x 512 픽셀, Z 스택당 1분 동안 10분 동안 이미지를 수집합니다. 1).설정은 0.11 x 0.11 x 0.25 μm^3의일반적인 x-y-z 해상도로 이미지를 생성합니다.
3. 뇌 해부 30 분 이내에 타임 랩스 이미지 시리즈를 수집합니다. 과도한 드리프트 또는 명백한 형태학적 열화가 있는 데이터는 사후 처리 및 정량화에서 제외되어야 합니다.

4. 드리프트 보정 및 데선볼루션

참고: 이미지 품질에 따라 두 단계 모두 선택 사항이지만 권장됩니다.

1. 드리프트 보정 소프트웨어로 획득한 이미지 파일을 엽니다. 실험에 사용된 매개 변수와 일치하도록 미세한 매개 변수를 편집합니다. 소프트웨어(재질 표 참조)의경우 | 편집을 클릭합니다. 현미경 매개 변수를 편집합니다. 2광자 옵션이 없는 경우 현미경 유형을 2광자 이미지의 와이드필드로 설정하고 소프트웨어에서 정의한 워크플로우를 따릅니다. 예를 들어, 탭 을 엽니 다 Deconvolution | 개체 안정기및 시간 프레임 안정화를 선택합니다.
2. 데톤볼루션 소프트웨어에서 드리프트 보정 이미지를 열고 워크플로우를 따릅니다. 소프트웨어(재료 표 참조)의경우 안정화된 이미지를 선택한 다음 Deconvolution | 데시온볼루션 익스프레스. 더 나은 결과를 얻으려면 Deconvolution 마법사를사용하여 매개 변수를 미세 조정합니다.
3. 4D 데이터를 분석하고 이미지에 정의된 점의 공간 좌표를 보고할 수 있는 후속 이미지 부수 소프트웨어에 의해 지원되는 파일 형식에 디톤브이드 이미지를 저장합니다(재료 표참조).

5. 이미지 어노미

1. 이미지 어노미그 소프트웨어에서 데톤브이드 이미지를 엽니다. 3D로 모든 시점에서 분기 팁을 검사하고 표시합니다. 이미지 추가 소프트웨어는 표시된 분기 팁의 공간 및 시간 좌표를 보고하고 저장합니다. 좌표 정보를 후속 계산을 위해 .csv 파일로 내보냅니다.
   참고: 다음 두 단계는 사용한 부어구이 소프트웨어와 관련이 있습니다(재료 표참조). 워크플로는 다른 소프트웨어에 따라 다를 수 있습니다.
2. 스팟 모듈 내에서"자동 생성 건너뛰기, 수동으로 편집"및 하단을 확인합니다" 선택한 스팟 " 확인란에자동 연결(그림3A). 타임계의 프레임을 넘어가서 부침을 위한 분기를 선택합니다. Shift 키를 길게 누를 때 분기 터미널 팁을 클릭하여 스팟을 추가합니다. 모든 시간 포인트를 클릭합니다.
   참고: 이미지 부고 소프트웨어는 프레임 사이의 스팟을 연결하고 자동으로 궤적을 생성합니다. 이제 분기 팁의 공간 및 시간 적 정보가 표시된 지점과 연결됩니다. 모든 분기 팁에 추가될 때까지 이 단계를 반복합니다(그림3B).
3. 스팟 모듈 에서 통계 탭을 클릭하고 상세값을 선택하고 특정 값을 선택 | 위치. 기록된 공간 및 시간 좌표 정보가 표시됩니다. 아래쪽 저장을 클릭하여 해당 정보를 .csv 파일로 내보냅니다(그림3C).

6. 수지상 분기 역학 계산

참고: 좌표 정보를 사용하여 3D로 분기 팁의 변위를 쉽게 계산할 수 있습니다. 우리의 연구에서, 모든 수지상 분기 운동은 확장 또는 철회로분류됩니다. 아래 단계는 사용자 지정 작성된 R스크립트(보충 파일)를사용하고 수동 편집을 통해 방향 정보를 추가하여 .csv 파일을 처리하는 방법을 설명합니다.

1. .csv 파일을 스프레드시트로 엽니다. 트랙 ID 열을 선택하고 가장 작은 항목에서 가장 큰 크기로 정렬 옵션을 클릭하고 선택 확장을수락합니다. 정렬 후 Track ID는 각 고유 수지상 분기를 식별하고 동일한 분기의 스팟은 동일한 트랙 ID를 공유합니다. 시간 열은 서로 다른 시간 프레임의 정보를 저장합니다.
2. 스프레드시트에 거리 열을 추가합니다. 좌표를 사용하여 일시적으로 인접한 두 점의 거리를 계산하고 거리 열에 값을 넣습니다(그림4A).
3. 단일 복셀 레벨에서 의 사소한 움직임. 이미징 설정에 따라 0.3 μm은 일반적으로 수정되지 않은 표류 또는 불완전한 이미지 어노팅의 아티팩트입니다. 0.3 μm에서 0으로 작은 모든 거리 값을 재설정하여 이러한 움직임을 필터링합니다. 여러 .csv 파일을 수동으로 처리하거나 R 스크립트 배치 열 필터링을 사용합니다. R (보조 파일).
4. 스프레드시트에서 변위라는 새 열을 수동으로 생성합니다. 거리 열에서 변위 열로 값을 복사합니다. 각 분기 팁에 대해 확장 및 철회 이벤트를 수동으로 할당합니다. 확장인 경우 변위 값을 변경하지 않고 유지합니다. 후퇴인 경우 해당 변위 값을 음수 값(예: 0.35 ~ -0.35)(그림4B)으로변경합니다.
5. Event라는 새 열을 생성 합니다. 이 열에서 개별 확장 및 철회 이벤트에 대한 변위 값을 수동으로 합산합니다(그림4B).
6. R 스크립트 일괄 처리 열 합계를 사용하여 수정된 스프레드시트를 처리하고 변위 값을 기반으로 확장 및 철회 이벤트를 정량화합니다. R (보조 파일). 출력 매개 변수에는 확장 이벤트 수, 철회 이벤트 수, 누적길이 연장, 누적 길이 철회, 순 길이 변경및 총 이동 길이가 포함됩니다. .

결과

위에서 설명한 라이브 이미징 프로토콜을 사용하여 후속 분석 및 정량화를 위해 고해상도 이미지 스택을 캡처합니다. 보조 비디오 1은 LNv. 도 2B가 개별적으로 라벨이 붙은 대표적인 로부터 수집된 최대 강도 투영(MIP) 이미지 시리즈를 도시하며, 이미지 시리즈의 8프레임에 상응하는 몽타주를 나타낸다. 두 패널에서 화살촉은...

토론

여기에서, 우리는 우리가 기록하고 Drosophila 애벌레 두뇌에 있는 개별적으로 표지된 뉴런에 있는 수지상 가지의 동적 행동을 정량화하기 위하여 개발한 프로토콜을 기술합니다. 특히, 우리의 라이브 이미징 프로토콜은 우리가 애벌레 LNv의 전체 수지상 아버를 캡처하고 그 수상 돌기 지점의 동적 상태의 글로벌 뷰를 제공 할 수 있도록 특정 매개 변수를 포함하고 있습니다. 그러나, 우리의 정...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
High vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES