Time-lapse Live Imaging e quantificazione delle dinamiche del ramo dendritico veloce nello sviluppo di neuroni della Drosophila

Riepilogo

Qui, descriviamo il metodo che abbiamo impiegato per immaginare la filopodia dendritica altamente motile in una preparazione dal vivo del cervello larvale della Drosophila, e il protocollo che abbiamo sviluppato per quantificare i set di dati di imaging 3D time-lapse per le valutazioni quantitative dei dendriti dinamica nello sviluppo dei neuroni.

Abstract

La filopodia dendritica altamente motile è ampiamente presente nei neuroni nelle fasi iniziali dello sviluppo. Questi rami dinamici esplorativi campionano l'ambiente circostante e avviano contatti con potenziali partner sinaptici. Anche se la connessione tra la dinamica del ramo dendritico e la sinaptogenesi è ben consolidata, il modo in cui i processi dipendenti dallo sviluppo e dall'attività regolano le dinamiche del ramo dendritico non è ben compreso. Ciò è in parte dovuto alle difficoltà tecniche associate all'imaging dal vivo e alle analisi quantitative di queste strutture fini utilizzando un sistema in vivo. Abbiamo stabilito un metodo per studiare le dinamiche dei dendriti usando i neuroni laterali ventrali larghi della Drosophila (LNvs), che possono essere etichettati individualmente utilizzando approcci genetici e sono accessibili per l'imaging dal vivo. Approfittando di questo sistema, abbiamo sviluppato protocolli per catturare le dinamiche di ramo dell'intero pergolato dendritico di un singolo LNv etichettato attraverso l'imaging live time-lapse. Abbiamo quindi eseguito la post-elaborazione per migliorare la qualità dell'immagine attraverso la correzione della deriva e la deconvoluzione, seguita dall'analisi delle dinamiche dei rami a livello di singolo ramo annotando le posizioni spaziali di tutti i terminali di diramazione. Infine, abbiamo sviluppato script R (File supplementare) e parametri specifici per quantificare le dinamiche delle filiali utilizzando le informazioni sulle coordinate generate dall'analisi del terminale. Collettivamente, questo protocollo ci permette di ottenere una descrizione quantitativa dettagliata delle dinamiche di rami del pergolato dendritico neuronale con alta risoluzione temporale e spaziale. I metodi che abbiamo sviluppato sono generalmente applicabili ai neuroni scarsamente etichettati sia in vitro che in vivo.

Introduzione

I dendriti sono compartimenti neuronali specializzati che ricevono ed elaborano input sensoriali e sinaptici. La struttura complessa e stereotipata dei pergolato dendritici è stata oggetto di intense indagini sin dalla loro scoperta. Un certo numero di sistemi modello, tra cui i neuroni tectali ottici Xenopus, le cellule di ganglio retinica del pulcino e i neuroni dell'arborizzazione dendritica (da) nel sistema della Drosophila, sono stati istituiti per studiare lo sviluppo, il rimodellamento e la plasticità dendriti neuronali^1,2,3,4. I neuroni laterali ventrali della Drosophila (LNvs) sono un gruppo di neuroni di proiezione visiva inizialmente identificati per le loro importanti funzioni nella regolazione circadiana dei comportamenti della mosca⁵. Gli studi hanno anche rivelato il ruolo dei LNv larvali come bersaglio post-sinaptico diretto dei fotorecettori larvali (PL)^6,7. È importante sottolineare che la coltura delle larve in via di sviluppo in diversi regimi di luce influisce fortemente sulle dimensioni degli arbori dendritici di LNvs, dimostrando l'idoneità dei LNv come nuovo modello per studiare la plasticità dendritica⁷. Recenti lavori del nostro gruppo indicano inoltre che sia la dimensione del dendrite LNv che il comportamento dinamico dei rami dendritici mostrano plasticità dipendente dall'esperienza^8,9. Come parte di questo lavoro, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo di imaging e quantificazione dal vivo per eseguire analisi sulla dinamica dendrite degli LNvs da larve instar 2^nd o 3^rd.

La natura trasparente del cervello larvale della Drosophila lo rende ideale per l'imaging dal vivo. Tuttavia, gli arbori dendritici dei LNv sono situati nel neuropil ottico larvale densamente innervato (LON) al centro del lobo cerebrale larvale⁶. Per catturare immagini di rami dendriti fini e filopodi nel tessuto cerebrale intatto, utilizziamo la microscopia a due fotoni, che aumenta la profondità di penetrazione della luce e riduce la fototossicità durante gli esperimenti di imaging dal vivo¹⁰. Utilizzando questa configurazione, abbiamo eseguito con successo esperimenti di imaging dal vivo su LNvs per oltre 30 min senza osservare l'evidente deterioramento morfologico del neurone. Inoltre, le manipolazioni genetiche utilizzando la tecnica Flip-out ci hanno permesso di etichettare i singoli LNvs con una membrana contrassegnata GFP, che è anche fondamentale per monitorare i movimenti dei singoli rami^11,12,13 .

Per catturare il comportamento dinamico di tutti i rami sul pergolato dendritico LNv con una risoluzione ottica ottimale, abbiamo eseguito immagini 3D time-lapse su espefarsi di cervello larvale appena sezionati con un'alta risoluzione spaziale a 1 min per fotogramma per 10-30 min. i dendriti sono altamente dinamici, con una grande percentuale dei rami che visualizzano cambiamenti osservabili all'interno della finestra di 10 min. Questo porta a una delle principali sfide tecniche nello studio delle dinamiche dei dendriti, quantificando il comportamento delle diramazioni in base ai set di dati delle immagini 4D. I metodi stabiliti in precedenza presentano varie limitazioni, tra cui la mancanza di precisione e l'eccessivo requisito di tempo. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo semi-automatico che combina la post-elaborazione dell'immagine, la marcatura manuale dei terminali di diramazione e il tracciamento automatico dei punti 4D utilizzando un software di annotazione dell'immagine. Calcoliamo i movimenti dei terminali di diramazione in diversi punti temporali in base alle coordinate 3D dei punti. I dati vengono quindi esportati e analizzati per produrre misurazioni quantitative delle dinamiche del ramo. Questo metodo valuta accuratamente la durata e l'estensione degli eventi di estensione e ritrazione dei rami esistenti, nonché la formazione di nuovi rami, consentendoci di monitorare le dinamiche dei dendriti in un gran numero di neuroni.

Protocollo

ATTENZIONE: Questo protocollo prevede l'uso di laser di classe IV e richiederà un adeguato addestramento e linee guida di sicurezza da seguire. Evitare l'esposizione agli occhi o alla pelle alla luce laser diretta o diffusa.
NOT: Il protocollo prevede sei passaggi. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1A.

1. Etichettatura di singoli neuroni utilizzando la tecnica di flip-out

NOT: L'etichettatura singola di LNvs si ottiene esprimendo mCD8::GFP in singoli LNv utilizzando l'etichettatura stocastica mediata flippase. Il genotipo della linea di volo è: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP^11,12,13. La frequenza di ottenere un singolo LNv etichettato è di circa il 10%. Le scorte di mosche sono mantenute in un mezzo standard in incubatrici circadiane e controllate dall'umidità a 25 gradi centigradi.

1. Raccogliere 100-200 uova all'interno di una finestra 2 h dopo la fecondazione su un piatto di succo d'uva con supplemento di lievito. Incubare gli embrioni a 25 gradi centigradi per 24 ore e raccogliere le prime larve instar appena schiuse per il passo successivo.
2. Il calore scossa le larve instar appena schiuse a 37,5 gradi centigradi per 40 minuti due volte, con un periodo di recupero di 40 minuti in mezzo.
3. Cultura le larve a 25 gradi centigradi con controlli circadiani e umidità fino allo stadio di sviluppo desiderato.

2. Dissezione e montaggio Arteria Larvale

1. Cervelli larvali dissect nella soluzione salina esterna fisiologica (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mMM, 10 mM di sucrosi di glucosio, 5 mM DI TES, 10 mM HEPES, 2 mM Ca^2o, PH 7.2) sotto un microscopio di dissezione (4.5x magnification due paglie di dissezione della punta standard #5 (11 cm). Utilizzare un paio di pinze per tenere il corpo larvale in posizione e l'altro per sezionare con attenzione il cervello. Conservare i dischi oculari, i lobi cerebrali e il cordone nervoso ventrale. Rimuovere i muscoli attaccati per ridurre al minimo i movimenti del campione durante l'imaging.
2. Preparare uno scivolo di vetro (25 x 75 x 1,0 mm³⁾e utilizzare una siringa per disegnare una camera quadrata con grasso sottovuoto.
3. Aggiungere 20 - L di soluzione salina esterna alla camera quadrata con barriere di grasso.
4. Trasferire cervelli larvali sezionati nella camera sul vetrino di vetro utilizzando pinze. Regolare la posizione del cervello sotto il mirino di dissezione per garantire che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto.
5. Coprire la camera con un coperchio di copertura in vetro (22 x 22 x 0,15 mm³). Il cervello larvale è ora montato sul vetrino all'interno di una camera riempita con la soluzione salina esterna (Figura 1B).
   NOT: Premendo delicatamente sul coperchio si limita il cervello e si riduce la deriva del campione nella successiva sessione di imaging.

3. Live Imaging time-lapse

NOT: Eseguiamo esperimenti di imaging time-lapse utilizzando un microscopio confocale dotato di laser multifotono. I parametri di acquisizione devono essere regolati per altre configurazioni di imaging.

1. Identificare gli espianti cerebrali contenenti neuroni etichettati individualmente utilizzando un obiettivo di immersione dell'acqua 40X (NA 1.3) e una fonte di luce epifluorescente. Per la raccolta di immagini, utilizzare un laser a due fotoni sintonizzato su 920 nm e un rilevatore non sottoposto a scansione (NDD).
2. Raccogliere immagini a 512 x 512 pixel per fotogramma e 1 min per stack di z per 10 min. Regolare lo zoom ottico e digitale per ottenere una risoluzione sufficiente x-y-z garantendo la copertura dell'intero pergolato dendritico entro 1 min (Figura 2,Video supplementare 1). Le impostazioni generano immagini con una risoluzione tipica di x-y-z di 0,11 x 0,11 x 0,25 m³.
3. Raccogliere la serie di immagini time lapse entro 30 minuti dalla dissezione cerebrale. I dati con una deriva eccessiva o un evidente deterioramento morfologico dovrebbero essere esclusi dall'elaborazione e dalla quantificazione post-elaborazione.

4. Correzione della deriva e deconvoluzione

NOT: A seconda della qualità dell'immagine, entrambi i passaggi sono facoltativi ma fortemente consigliati.

1. Aprire un file di immagine acquisito con un software di correzione della deriva. Modificare i parametri microscopici in modo che corrispondano a quelli utilizzati per l'esperimento. Per il software (vedere Tabella dei materiali),fare clic su Modifica . Modifica parametri microscopici. Impostare il tipo di microscopio come widefield per le immagini a due fotoni se non è presente un'opzione a due fotoni e seguire il flusso di lavoro definito dal software. Ad esempio, aprire la scheda Deconvoluzione Stabilizzatore oggettoe scegliere Stabilizza intervallidi tempo .
2. Aprire l'immagine corretta dalla deriva nel software di deconvoluzione e seguire il relativo flusso di lavoro. Per il software (vedere Tabella dei materiali),selezionare l'immagine stabilizzata, quindi fare clic su Deconvoluzione Deconvoluzioneon Express. Per ottenere un risultato migliore, perfezionare i parametri utilizzando Deconvoluzione guidata.
3. Salvare l'immagine deconvolved in un tipo di file supportato dal successivo software di annotazione dell'immagine in grado di analizzare i dati 4D e riportare le coordinate spaziali dei punti definiti nell'immagine (vedere Tabella dei materiali).

5. Annotazione immagine

1. Aprire l'immagine deconvolved nel software di annotazione dell'immagine. Esaminare e contrassegnare le punte del ramo in tutti i punti temporali in 3D. Il software di annotazione dell'immagine segnala e archivia le coordinate spaziali e temporali delle punte del ramo contrassegnate. Esportare le informazioni sulle coordinate come file CSV per i calcoli successivi.
   NOT: I due passaggi seguenti sono specifici del software di annotazione utilizzato (vedere Tabella dei materiali). Il flusso di lavoro potrebbe essere diverso per altri software.
2. All'interno del modulo Spots, fare clic su "Salta creazione automatica, modifica manualmente" e selezionare la casella di controllo "Auto-connect to selected Spot"(Figura 3A). Passare sopra i fotogrammi della serie temporale e selezionare un ramo per l'annotazione. Tenere premuto il tasto Maiusc e fare clic sulla punta del terminale di diramazione per aggiungere un punto. Fare clic su tutti i punti temporali.
   NOT: Il software di annotazione dell'immagine collega le macchie tra i fotogrammi e genera automaticamente una traiettoria. Le informazioni spaziali e temporali delle punte dei rami sono ora associate a punti marcati. Ripetere questi passaggi fino a quando non vengono annotate tutte le punte di diramazione (Figura 3B).
3. All'interno del modulo Spot, fare clic sulla scheda Statistiche, scegliere Dettagliato e selezionare Valori specifici. Posizione. Verranno visualizzate le informazioni sulle coordinate spaziali e temporali registrate. Fare clic su Salva in basso per esportare tali informazioni come file CSV(Figura 3C).

6. Calcolo delle dinamiche dei rami dendritici

NOT: Utilizzando le informazioni sulle coordinate, è possibile calcolare facilmente lo spostamento delle punte di diramazione in 3D. Nel nostro studio, tutti i movimenti di ramo dendritici sono classificati come estensione o ritrazione. I passaggi seguenti descrivono come elaborare i file CSV utilizzando script R personalizzati (File supplementare) e aggiungendo le informazioni direzionali tramite la modifica manuale.

1. Aprire il file CSV come foglio di calcolo. Selezionare la colonna ID traccia, fare clic sull'opzione Ordina dal più piccolo al più grande e accettare Espandi la selezione. Dopo l'ordinamento, TRACK ID identifica ogni ramo dendritico univoco e punti dalla stessa diramazione condividono lo stesso ID traccia. La colonna Tempo memorizza le informazioni di intervalli di tempo diversi.
2. Nel foglio di calcolo aggiungere una colonna Distanza. Calcolare la distanza di ogni due punti temporalmente adiacenti utilizzando le loro coordinate e inserire i valori nella colonna Distanza (Figura 4A).
3. Movimenti minori a livello di singolo voxel. In base alle impostazioni di imaging, 0,3 m sono solitamente artefatti di una deriva non corretta o di un'annotazione di immagine imperfetta. Filtrare questi movimenti reimpostando tutti i valori di Distanza inferiori a 0,3 m su 0. Elabora manualmente più file .csv o usa il nostro filtro di colonna batch di script R. R (File supplementare).
4. Generare manualmente una nuova colonna denominata Spostamento nel foglio di calcolo. Copiare i valori dalla colonna Distanza alla colonna Spostamento. Assegnare manualmente gli eventi di estensione e retrazione per ogni suggerimento di diramazione. Se si tratta di un'estensione, lasciare invariato il valore Displacement, che è un valore positivo. Se si tratta di una retrazione, modificare il valore di Spostamento corrispondente in un valore negativo (ad esempio, da 0,35 a -0,35) (Figura 4B).
5. Generare una nuova colonna denominata Evento. In questa colonna, sommare manualmente i valori di Spostamento per singoli eventi di estensione e ritrazione (Figura 4B).
6. Elaborare il foglio di calcolo modificato e quantificare gli eventi di estensione e retrazione in base ai relativi valori di spostamento utilizzando la somma delle colonne batch di script R.Process the modified spreadsheet and quantify the extension and retraction events based on their displacement values using R script batch column sum. R (File supplementare). I parametri dioutput includono Numero di eventi di estensione , Numero di eventi di ritrazione, Lunghezza cumulativa estesa, Lunghezza cumulativa ritirata, Lunghezza netta modificatae Lunghezza totale percorsa .

Risultati

Utilizzando il protocollo di imaging dal vivo descritto in precedenza, acquisiamo stack di immagini ad alta risoluzione per le successive analisi e quantificazioni. Supplementary Video 1 mostra l'intensità massima della serie di immagini proiettate (MIP) raccolte da un rappresentante con etichetta individuale LNv. In entrambi i pannelli, le frecce contrassegnano gli eventi di retrazione e le frecce contrassegnano gli eventi...

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per registrare e quantificare il comportamento dinamico dei rami dendritici nei neuroni etichettati individualmente nei cervelli larvali della Drosophila. In particolare, il nostro protocollo di imaging dal vivo contiene parametri specifici che ci permettono di catturare l'intero pergolato dendritico di un LNv larvale e fornire una visione globale dello stato dinamico dei suoi rami dendriti. Tuttavia, poiché i nostri metodi di quantificazione si basano forte...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
high vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging		for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES